血清蛋白质测定(精)
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【医学课件】 双缩脲法测定血清蛋白
三、试剂 1. 溴甲酚绿试剂 BCG
2. 60g/L蛋白标准液
三、试剂 1. 6mol/LNaOH
2. 双缩脲试剂
3. 双缩脲空白试剂
4. 60－70g/L标准液
四、操作
Bl
0.1
0.1
蛋白标准液
0.1
蒸留水
0.1
空白试剂
5.0
双缩脲试剂
5.0
5.0
5.0
混匀置25℃30分钟或37℃10分钟，蒸留水调零在540nm处 比色，测各管吸光度 五、 计算 血清总蛋白(g/L)
实验三、双缩脲法测定血清蛋白
一、目的
二、原理 血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液 中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物，这 种 紫 红 色 络 合 物 在 540nm 处 有 明 显 的 吸 收 峰 ， 吸 收 峰 在一定范围内与血清中蛋白含量成正比，与同样方法 处理的蛋白标准液比较求得其含量。
=(AU-ARB-AB)/(AU-ARB-AB)*标准液浓度(g/L)
六、参考值 成人 60－80(g/L) 七、注意事项 略
附：溴甲酚绿法测定血清白蛋白
一、目的
二、原理 血清白蛋白在PH4.2的缓冲液中带正电荷， 在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的 染料溴甲酚绿结合形成蓝绿色的复合物，在波长 630NM处有吸收峰，其颜色深浅与蛋白的浓度成正 比。
2. 60g/L蛋白标准液
三、试剂 1. 6mol/LNaOH
2. 双缩脲试剂
3. 双缩脲空白试剂
4. 60－70g/L标准液
四、操作
Bl
0.1
0.1
蛋白标准液
0.1
蒸留水
0.1
空白试剂
5.0
双缩脲试剂
5.0
5.0
5.0
混匀置25℃30分钟或37℃10分钟，蒸留水调零在540nm处 比色，测各管吸光度 五、 计算 血清总蛋白(g/L)
实验三、双缩脲法测定血清蛋白
一、目的
二、原理 血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液 中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物，这 种 紫 红 色 络 合 物 在 540nm 处 有 明 显 的 吸 收 峰 ， 吸 收 峰 在一定范围内与血清中蛋白含量成正比，与同样方法 处理的蛋白标准液比较求得其含量。
=(AU-ARB-AB)/(AU-ARB-AB)*标准液浓度(g/L)
六、参考值 成人 60－80(g/L) 七、注意事项 略
附：溴甲酚绿法测定血清白蛋白
一、目的
二、原理 血清白蛋白在PH4.2的缓冲液中带正电荷， 在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的 染料溴甲酚绿结合形成蓝绿色的复合物，在波长 630NM处有吸收峰，其颜色深浅与蛋白的浓度成正 比。
血清白蛋白测定标准操作规程
血清白蛋白测定标准操作规程1 检验申请单独检验项目申请：血清白蛋白测定（缩写ALB）;组合项目申请：血生化中肝功能测定项目组合。
临床医生根据需要提出检验申请。
2 标本采集与处理2。
1标本采集2。
1.1常规静脉采血约2ml,不抗凝,置普通试管中。
或采用含分离胶的真空采血管。
2。
1。
2检验申请单和血标本试管标上统一且唯一的标识符。
2。
1.3急诊标本采集后，在检验申请单上填写标本采集时间。
2.1.4标本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。
专人负责标本的接收并记录标本的状态，对不合格标本予以拒收。
2。
1。
5下列标本为不合格标本2。
1。
5.1标本量不足：少于0.3ml的全血标本,或少于0。
1ml的血清或血浆。
2。
1。
5。
2对反应吸光度有干扰的标本，包括严重溶血、严重浑浊的标本。
2。
1.5.3无法确认标本与申请单对应关系的.2。
1。
5。
4其他如标识涂改、标本试管破裂等.2。
2标本保存2.2。
1接收标本后在30min内将标本离心分离出血清.2.2.2标本保存时间：室温(15～25℃)下可稳定一周，普通冰箱中（2～8℃）稳定一个月。
为避免标本中水分挥发使血清浓缩，对保存时间超过1天的标本均加塞密闭或覆盖湿巾。
2.3标本采集的注意事项2.3。
1采血前使受检者保持平静、松弛和空腹状态。
2。
3.2不建议采集抗凝血标本,如果必须使用血浆，推荐的抗凝剂是肝素。
3 方法原理血清中的白蛋白与溴甲酚绿在PH=4.2的条件下结合生成绿色复合物，溶液由黄色变为绿色，其颜色深浅与白蛋白浓度成正比，通过在630nm处测定其吸光度可得出白蛋白的含量。
PH=4.2白蛋白 + 溴甲酚绿—-—-—-------———绿色复合物4 试剂及其他用品4.1试剂:溴甲酚绿法测定白蛋白试剂盒，由北京利德曼生化技术有限公司出品.4。
2试剂盒保存：保存于2～8℃，不开盖情况下至标签的失效期。
开盖后放于仪器的冰箱中至少稳定14天.开盖后避免污染。
变质指示：当试剂有浊度时,表明有细菌污染，不能继续使用.4.3试剂盒准备：液态单试剂型，即开即用，无特殊准备4.4试剂盒主要成分:缓冲液（pH 4.2）50 mmol/L，溴甲酚绿0.25 mmol/L,其中含有稳定剂与保护剂＜0.1%。
实验一血清蛋白质测定(共51张PPT)
【注意事项】
1.测定的血清以新鲜为宜，但在冰箱保存而不混 浊的标本也可应用，高脂血症混浊血清会干扰比 色，可采用下述方法消除：取2支带塞试管或离 心管，各加待测血清，再加蒸馏水和丙酮10ml， 塞紧并颠倒混匀10次后离心，倾去上清液，将试 管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加 入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述 相同的其他操作和计算。
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标准
A 血红蛋白和BCG产生与白蛋白相等的颜色强度，血红蛋白在1g/L以下无明显干扰，2g/L使吸光度增高3.
2．10mmol/L BCG贮存液
标准
3．叠氮钠贮存液
4．聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)贮存液
5．BCG试剂
实验一 血清蛋白质测定
但本法的检出限为～，这相当于70g/L的血清3～24μl，已能满足临床生化检验的需要，成为临床实验室血清TP首选的最方便，实用的常规方法。 酚酞、溴磺酞钠在碱性溶液中呈色，影响测定结果，右旋糖酐可使测定管混浊亦影响结果，理论上这些干扰均可用相应的标本空白管来消除。 ３．在波长630nm处用空白管调零，用定量加液器加BCG试剂，与测定管血清混合后，立即在30±3s内，读取吸光度。 4%，4g/L使吸光度增高7. 2 桌面，边台，水池，窗台，仪器要一尘不染，请值日生用抹布擦干净。 4(显蓝绿色)，受酸、碱影响较大，故所用的器材必须无酸、碱污染，BCG工作液的pH必须精确度监测，务必使其保持在限度内。 手工操作参数：波长540nm，光径1cm； 用双缩脲法测定血清标本中总蛋白浓度，用溴甲酚绿法测定血清白蛋白浓度, 蛋白质测定方法很多，常用的有： 丽春红蛋白结合法测得的结果与凯氏定氮法相符，并且显色后在室温可稳定24小时； 1．黄疸血清，溶血，高糖，酚酞等干扰用样本空白来消除。 由于血红蛋白本身能与双缩脲试剂反应，产生与血清白蛋白和球蛋白相近的显色效价，故应注意高血红蛋白的影响。 取试管4支，标明测定管（U）、标准管（S）、标本空白管（B）、试剂空白管（RB）。 双缩脲法测定血清总蛋白
蛋白质代谢功能检查血清总蛋白和白蛋白球蛋白测定
蛋白质代谢功能检查血清总蛋白和白蛋白球蛋白测定蛋白质是构成我们身体组织和细胞的重要组分，参与许多生理过程，如维持正常免疫功能、携带氧气、运输营养物质、参与代谢反应等。
蛋白质代谢功能检查可以通过测定血清总蛋白和白蛋白球蛋白的水平来评估。
以下是对这两项检查的详细解释。
1.血清总蛋白测定血清总蛋白是指血清中所有蛋白质的总量，包括白蛋白和球蛋白。
测定血清总蛋白的水平可以提供关于全身蛋白质代谢的信息。
正常成年人的血清总蛋白水平通常在6.0-8.3g/dL之间。
高蛋白血症可能与一些情况有关，如饮食蛋白质过多摄入、脱水、肾功能不全、慢性炎症、恶性肿瘤、骨髓增生异常等。
低蛋白血症则可能与饮食蛋白质摄取不足、肝病（肝脏合成蛋白质减少）、肾病（尿蛋白丢失）、营养不良等因素有关。
2.白蛋白测定白蛋白是血清中最丰富的蛋白质，占总蛋白的绝大部分。
它在体内扮演着多种重要角色，如维持胶体渗透压、运输药物和激素、抗体生成等。
正常成年人的血清白蛋白水平通常在3.4-5.4g/dL之间。
低白蛋白血症可能与肝脏合成白蛋白减少（如肝病、肝功能失常）、肾重金属中毒（如自身免疫性肾炎、肾小球肾炎）、消化道吸收障碍（如吸收不良综合征）等因素有关。
高白蛋白血症可能与因为脱水或其他原因而导致的体液浓缩有关。
球蛋白是除白蛋白外的其他成分，主要包括免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）、补体、凝血因子等。
测定球蛋白的水平可以提供关于机体免疫功能和炎症反应的信息。
球蛋白水平的正常范围因年龄和性别而异。
常用的方法是将总蛋白和白蛋白测定结果相减，计算球蛋白的浓度。
高球蛋白血症可能与多发性骨髓瘤、慢性炎症、肝病等疾病相关。
低球蛋白血症可能与免疫缺陷病、肾病、胃肠道蛋白质大量丢失等因素有关。
总结：血清总蛋白和白蛋白球蛋白是检查蛋白质代谢功能的重要指标。
通过测定其水平，可以评估全身蛋白质代谢的状态，并发现一些与蛋白质代谢异常相关的疾病。
然而，需要注意的是，蛋白质代谢异常并不一定与蛋白质摄入量的变化相关，常常需要结合其他检查结果和临床病史来综合判断。
测定血清实验报告
一、实验目的1. 了解血清的组成及其生理功能。
2. 掌握血清测定的原理和方法。
3. 学习血清蛋白电泳技术的操作流程及注意事项。
二、实验原理血清是由血浆中去除纤维蛋白原后剩余的液体成分，主要包含水、蛋白质、电解质、营养物质、激素等。
血清蛋白电泳技术是一种常用的分离血清蛋白的方法，通过电泳将血清中的蛋白质分离成不同的组分，便于进一步分析。
三、实验器材与试剂1. 实验器材：醋酸纤维薄膜、电泳槽、直流稳压电泳仪、剪刀、镊子、试管、烧杯、培养皿、巴比妥-巴比妥钠缓冲液、染色液、漂洗液、浸出液、血清样本。
2. 实验试剂：巴比妥钠、巴比妥、硫酸铜结晶、酒石酸钾钠、KI、NaOH、双缩脲试剂、2，4-二硝基苯肼、丙酮酸标准液、NaOH溶液、生理盐水、75%乙醇、抗A、抗B血型定型试剂。
四、实验步骤1. 血清蛋白电泳（1）将醋酸纤维薄膜浸泡在pH8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液中，使其充分浸润。
（2）取少量血清样本，加入适量的双缩脲试剂，充分混匀。
（3）用滴管将血清样本滴加在醋酸纤维薄膜的一端，确保样本均匀分布。
（4）将醋酸纤维薄膜放入电泳槽中，加入适量的pH8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液。
（5）接通直流稳压电泳仪，调整电压为150V，电泳时间约30分钟。
（6）关闭电源，取出醋酸纤维薄膜，用染色液染色。
（7）用漂洗液漂洗醋酸纤维薄膜，直至洗去未结合的染色液。
（8）观察醋酸纤维薄膜上的蛋白质带，记录各蛋白质带的迁移率。
2. 血型鉴定（1）取双凹玻片一块，用干净纱布轻拭使之洁净，在玻片两端用腊笔标明A及B，并分别各滴入A及B标准血清一滴。
（2）细胞悬液制备：从指尖或耳垂取血一滴，加入含1ml生理盐水的小试管内，混匀，即得约5％红细胞悬液。
采血时应注意先用75％酒精消毒指尖或耳垂。
（3）用滴管吸取红细胞悬液，分别各滴一滴于玻片两端的血清上，注意勿使滴管与血清相接触。
（4）竹签两头分别混合，搅匀。
（5）10～30min后观察结果。
临床生化检验实验紫外分光光度法测定血清蛋白质(精)
实验三
实验名称：紫外分光光度法测定血清蛋白质
实验目的与要求：掌握运用标准曲线法进行紫外分光光度法测定血清蛋白质的原理与基本过程。
实验仪器、试剂：0.15mol/L的NaCl溶液，蛋白质标准液（1mg/ml），UV2300紫外分光光度计
实验原理：蛋白质分子中存在着含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，使蛋白质在270-290nm波长范围内具有吸收紫外光的性质，在此波长范围内，蛋白质溶液的吸收值与其浓度成正比，可作定量测定。
操作方法：
1、取8支试管，按下表分别加入试剂，用光径1cm的比色杯
测定吸光度。
试管 1 2 3 4 5 6 7 8 蛋白质标准液（ml） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 NaCl (ml) 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 浓度（mg/ml） 0 0.125 0.25 0.375 0.5 0.625 0.75 1.0 2、另取试管一支加入样品1ml，NaCl3ml作为样品管，同标
准一起读取吸光度。
3、绘制标准曲线，在曲线上查样品管的浓度
实验现象与数据：
结果分析与结论：。
健康评估 肝肾功能检查
----提示慢性肝炎进入活动期可能
（一）转氨酶：
2、慢性病毒性肝炎 3、酒精性肝病、药物性肝炎、脂肪肝、肝癌等非病
毒性肝病转氨酶轻度升高或正常，ALT/AST<1 原因：酒精性肝病AST显著升高，可因为酒精具有 线粒体毒性及酒精抑制吡哆醛活性有关
（一）转氨酶：
4、肝硬化 酶活性取决于肝细胞坏死程度 终末期肝硬化转氨酶活性正常或降低
ALT主要分布在肝脏，其次是脑、肾脏、心肌等组 织中（主要存在于肝细胞浆中）
AST主要分布在心肌，其次是肝脏、骨骼肌和肾脏 等组织中（主要存在于线粒体中）
（一）转氨酶：
正常血清ALT和AST的含量很低 肝受损肝C膜通透性改变ALT与AST释放入血浆升高 中等度肝细胞损伤时，血ALT增高明显 因此ALT反映肝细胞损伤灵敏度较AST为高 严重肝C损伤线粒体膜损伤内部AST释放，血AST增
成人
20-110u/L
（二）碱性磷酸酶（ALP）
[临床意义] 1．肝胆疾病
各种肝内、外胆管阻塞性疾病，如胰头癌、胆 道结石、原发性胆汁性肝硬化、肝内胆汁淤积 等，ALP明显升高，累及肝实质细胞的肝胆疾病 （如肝炎、肝硬化），ALP仅轻度升高
（二）碱性磷酸酶（ALP）
[临床意义] 2、黄疸的鉴别 ALP和转氨酶、血清胆红素同时
㈠ 内生肌酐清除率测定
外源性食物（鱼、肉）肠道入血，内源性：肌肉 严格控制饮食条件和肌肉活动相对稳定 血肌酐生成含量变化内源性肌酐影响 从肾小球滤过，不从肾小管重吸收，排泌量很少 肾单位时间内，把若干毫升血浆中的内生肌酐全
病变达到一定程度和病程才能出现血清总蛋白和白 蛋白量减少 在急性或局灶性肝损伤时，TP和A多正常 TP和A主要检测慢性肝损害，反映肝细胞储备功能
（一）转氨酶：
2、慢性病毒性肝炎 3、酒精性肝病、药物性肝炎、脂肪肝、肝癌等非病
毒性肝病转氨酶轻度升高或正常，ALT/AST<1 原因：酒精性肝病AST显著升高，可因为酒精具有 线粒体毒性及酒精抑制吡哆醛活性有关
（一）转氨酶：
4、肝硬化 酶活性取决于肝细胞坏死程度 终末期肝硬化转氨酶活性正常或降低
ALT主要分布在肝脏，其次是脑、肾脏、心肌等组 织中（主要存在于肝细胞浆中）
AST主要分布在心肌，其次是肝脏、骨骼肌和肾脏 等组织中（主要存在于线粒体中）
（一）转氨酶：
正常血清ALT和AST的含量很低 肝受损肝C膜通透性改变ALT与AST释放入血浆升高 中等度肝细胞损伤时，血ALT增高明显 因此ALT反映肝细胞损伤灵敏度较AST为高 严重肝C损伤线粒体膜损伤内部AST释放，血AST增
成人
20-110u/L
（二）碱性磷酸酶（ALP）
[临床意义] 1．肝胆疾病
各种肝内、外胆管阻塞性疾病，如胰头癌、胆 道结石、原发性胆汁性肝硬化、肝内胆汁淤积 等，ALP明显升高，累及肝实质细胞的肝胆疾病 （如肝炎、肝硬化），ALP仅轻度升高
（二）碱性磷酸酶（ALP）
[临床意义] 2、黄疸的鉴别 ALP和转氨酶、血清胆红素同时
㈠ 内生肌酐清除率测定
外源性食物（鱼、肉）肠道入血，内源性：肌肉 严格控制饮食条件和肌肉活动相对稳定 血肌酐生成含量变化内源性肌酐影响 从肾小球滤过，不从肾小管重吸收，排泌量很少 肾单位时间内，把若干毫升血浆中的内生肌酐全
病变达到一定程度和病程才能出现血清总蛋白和白 蛋白量减少 在急性或局灶性肝损伤时，TP和A多正常 TP和A主要检测慢性肝损害，反映肝细胞储备功能
血清总蛋白及白蛋白测定(精)
血清总蛋白及白/球比值的测定
实验目的：
1.混合物中某种物质浓度的测定方法 2.熟悉血清总蛋白和白蛋白的测定方法 3.掌握血清总蛋白和白/球比值的临床意义 4.熟悉721分光光度计的使用
生物化学实验基本技能训练
一、血清总蛋白的测定
（双缩脲法）
二、血清白蛋白的测定
（溴甲酚绿法）
血清总蛋白的测定
双缩脲（
•双缩脲反应示意图
实验试剂 （1）生理盐水（2）双缩脲试剂
： 实（验3）操蛋作白质标准液（4）待测血清
取三支试管按下表加入式样，混匀 37摄氏度水浴放置十 分钟，以空白管调零，540nm波长测定吸光度
血清总蛋白的测定
项目 血清/ml
蛋白质标准液/ml 理生盐水/ml
双缩脲试剂/ ml
测定管
1.00
白蛋白增高：主要由于血液浓缩而致相对性增高，如严重 脱水和休克、严重烧伤、急性出血、慢性肾上腺皮质功能减 低症。
白蛋白减低：见于肝硬变合并腹水及其他肝功能严重损害 （如急性肝坏死、中毒性肝炎等）营养不良、慢性消耗性疾 病、糖尿病、严重出血肾病综合征等。当降低至25g/L以下易 产生腹水。
血清球蛋白是机体免疫器官制造的，球蛋白正常值为20-40 g/L。球蛋白大部分在肝细胞外生成，与人体的免疫力有关系。 球蛋白要保持一定的量，球蛋白检测值超过正常值说明体内
双缩脲法 酚试剂(Follin-酚)法测定蛋白质 紫外吸收法测定蛋白质 凯氏(Kjeldahl)微量定氮法 考马斯亮蓝G—250染色法 如何测定血清中某一种蛋白质的浓度？ 分离后再测定
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量是双缩脲法的发民，所用 的试剂是由两部分组成的。第一部分相当于双缩脲试剂， 第二部分为Folin-酚试剂(磷钨酸和磷钼酸混合液)。因此， 反应的程序也是分两步进行的。第一步相当于双缩脲反应， 在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物； 第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件 下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物 (呈蓝色反应)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故 有此呈色反应。而且溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正 比关系。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法 可测定范围是25—250μg蛋白质
实验目的：
1.混合物中某种物质浓度的测定方法 2.熟悉血清总蛋白和白蛋白的测定方法 3.掌握血清总蛋白和白/球比值的临床意义 4.熟悉721分光光度计的使用
生物化学实验基本技能训练
一、血清总蛋白的测定
（双缩脲法）
二、血清白蛋白的测定
（溴甲酚绿法）
血清总蛋白的测定
双缩脲（
•双缩脲反应示意图
实验试剂 （1）生理盐水（2）双缩脲试剂
： 实（验3）操蛋作白质标准液（4）待测血清
取三支试管按下表加入式样，混匀 37摄氏度水浴放置十 分钟，以空白管调零，540nm波长测定吸光度
血清总蛋白的测定
项目 血清/ml
蛋白质标准液/ml 理生盐水/ml
双缩脲试剂/ ml
测定管
1.00
白蛋白增高：主要由于血液浓缩而致相对性增高，如严重 脱水和休克、严重烧伤、急性出血、慢性肾上腺皮质功能减 低症。
白蛋白减低：见于肝硬变合并腹水及其他肝功能严重损害 （如急性肝坏死、中毒性肝炎等）营养不良、慢性消耗性疾 病、糖尿病、严重出血肾病综合征等。当降低至25g/L以下易 产生腹水。
血清球蛋白是机体免疫器官制造的，球蛋白正常值为20-40 g/L。球蛋白大部分在肝细胞外生成，与人体的免疫力有关系。 球蛋白要保持一定的量，球蛋白检测值超过正常值说明体内
双缩脲法 酚试剂(Follin-酚)法测定蛋白质 紫外吸收法测定蛋白质 凯氏(Kjeldahl)微量定氮法 考马斯亮蓝G—250染色法 如何测定血清中某一种蛋白质的浓度？ 分离后再测定
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量是双缩脲法的发民，所用 的试剂是由两部分组成的。第一部分相当于双缩脲试剂， 第二部分为Folin-酚试剂(磷钨酸和磷钼酸混合液)。因此， 反应的程序也是分两步进行的。第一步相当于双缩脲反应， 在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物； 第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件 下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物 (呈蓝色反应)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故 有此呈色反应。而且溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正 比关系。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法 可测定范围是25—250μg蛋白质
01 生物化学实验--凯氏(Kjeldahl)微量定氮法测定血清蛋白质含量
凯氏（ Kjeldahl ）微量定氮法测定血清蛋白质含量【目的】1 ．掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括未知样品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。
2 ．熟悉微量凯氏定氮法的原理。
【原理】凯氏定氮法是蛋白质含量测定的经典方法，它是根据蛋白质分子中含氮量来测定的，各种蛋白质含氮量比较近似，平均约为 16 ％，即 1g 氮相当于 6.25g 蛋白质。
由测定出的氮量即可换算出蛋白质含量。
血清蛋白质或其它有机含氮物与浓硫酸加热进行消化 ( 氧化 ) 时，其中碳、氢、氧元素分别被氧化为二氧化碳和水，而氮原子则转变成氨，后者与硫酸结合生成硫酸铵，留在溶液中，为了加速有机物质的氧化分解，在消化时加入硫酸铜做为催化剂，加入硫酸钾以提高消化液的沸点。
硫酸铵与氢氧化钠作用，放出氨，通过水蒸气蒸馏将氨带入接收瓶中被硼酸溶液吸收，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，用已知浓度的标准盐酸滴定，直至原来溶液中氢离子的浓度恢复，即指示剂变为原来的颜色。
根据所消耗的标准盐酸量，即可计算出样品中的总氮量。
化学反应式如下：1 ．消化含氮化合物 +H 2 SO 4 —→CO 2 ↑+H 2 O +(NH 4 ) 2 SO 4 +SO 2 ↑2 ．蒸馏(NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH—→2NH 4 OH+Na 2 SO 4NH 4 OH—→NH 3 ↑+ H 2 O3NH 3 +H 3 BO 3 —→(NH 4 ) 3 BO 33 ．滴定(NH 4 ) 3 BO 3 +3HCl—→3NH 4 Cl+H 3 BO 3以上测定为样品中的总氮量，由总氮量减去非蛋白氮，即为蛋白质含氮量，再乘以 6 . 25 即为血清蛋白质含量。
【器材】1 ．电炉2 ．铁三角架3 ．酒精灯4 ．锥形瓶5 ．消化管（凯氏烧瓶）6 ．滴定管7 ．微量凯氏定氮器8 ．刻度吸量管9 ．玻璃珠10 ．漏斗11 ．血清【试剂】1 ．硫酸钾粉末2 ． 12 . 5 ％硫酸铜水溶液3 ．浓硫酸4 ． 2 ％硼酸水溶液5 ．混合指示剂取 0 . 1 ％溴甲酚绿乙醇溶液 10ml 与 0 . 1 ％甲基红乙醇溶液 4ml 混合6 ． 30 ％氢氧化钠溶液7 ． 0 . 0lmol / L 盐酸标准溶液【操作】一、消化取消化管二支，标明测定管与空白管，按下表进行操作：混匀，置于电炉上加热消化（图 3-1 ），开始有水蒸气逸出，继而溶液呈现棕色并冒出白烟 (SO 3 ) ，此时火力应减小，并在管口上盖一小漏斗，以免硫酸损失过多，再继续消化至溶液变为澄清的蓝绿色，即消化完毕 ( 此过程约需 25 分钟左右 ) ，冷却后加水 3 . 8ml ，使总量成为 5ml( 内有 1 . 2ml 硫酸 ) ，混匀，准备蒸馏。
蛋白质测定方法
蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法(microKjeldahlmethod) 生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。
生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。
凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.实验原理生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。
生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。
凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。
其原理如下：1.消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。
为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。
这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。
2.加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH,加热后生成NH3,通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。
3.滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。
此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。
HCl＋NaOHNaCl+H2O本法适用于0.2~2.0mg的氮量测定。
1.热源2.烧瓶3.玻璃管4.橡皮管5．玻璃杯6.棒状玻塞7.反应室8.反应室外壳9.夹子10.反应室中插管11.冷凝管12.锥形瓶13.石棉网微量凯氏蒸馏装置示意图试剂和器材一、试剂浓硫酸；30％过氧化氢溶液；10M氢氧化钠；0.01M的标准盐酸；标准硫酸铵（0.3mg氮/mL）催化剂：硫酸铜：硫酸钾＝1：4混合，研细。
指示剂：0.1％甲基红乙醇溶液。
二、测试样品牛血清白蛋白。
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• 3、类固醇激素
二、血清蛋白质电泳组分的临床分 析
• 1、正常血清蛋白电泳（serum protein electrophoresis,SPE) • 正常参考值： Alb: 57%-68% α1: 1.0%-5.7% α2: 4.9%-11.2% β: 7%-13% γ: 9.8%-18.2%
方法：琼脂凝胶电泳 染料：氨基黑
正常血清蛋白电泳图
• 2、异常血清蛋白电泳 • （1）双白蛋白血症型：主要特征： 在白蛋白部位有两个区带，光密度 计扫描出现双峰，呈剪刀状。 产生原因：双白蛋白血症分为持 久型和暂时型两种。持久型主 要 是一种家族性血清蛋白异常的疾病， 极少见，为 常染色体不完全显性 遗传；而暂时型主要是指肾功 能不全的患者在治疗期间使用大 剂量的β-内酰胺类 抗生素，可形 成快泳动性的白蛋白成分，治疗中 断 即逐渐消失。
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运输载体类: 血浆脂蛋白 前清蛋白和清蛋白 甲状腺素结合球蛋白 皮质素结合球蛋白 视黄醇结合蛋白转铁蛋白 结合珠蛋白 血色素结合蛋白 铜蓝蛋白
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补体蛋白类 补体蛋白C B因子 D因子 备解素
• P因子又称备解素（properdin），是替代途径中除C3以外 最先发现的一种血浆蛋白。现已探明，P因子以聚合体形式 而存在：即三聚体（54%）、二聚体（26%）和四聚体 （20%）都有，但特异活性的顺序依次为：四聚体>三聚体> 二聚体。P因子为由4条相同的肽链（分子量各55kDa）组成 的四聚体分子，链间以非共价键相连接，分子量为220kDa。 P因子的生物学活性是以高亲和力与c 3bBb和C 3bnBb相结 合，结合后通过发生构象改变而加固C3b与Bb间的结合力， 从而可使其半衰期由2分钟延长至26分钟。另外，P因子还 可封闭H因子的抑制作用，更增加了上述两种酶的稳定性及 活性，有利于促进替代途径级联反应的继续进行。因此，P 因子实际上是替代途径中的一个重要的正调节分子。因其常 成为c 3bBb和C3bnBb复合物中的组成成分之一，故将其作 为补体系统的固有成分在此一并描述。此外，在膜增生性肾 小球肾炎病人血清中发现有一种C3肾炎因子（C3nephritic factor,C3NeF）实际为C 3bBb的自身抗体，也可与C3bBb 结合而增加c 3bnBb的稳定性，使其半衰期处长10-30倍。
• 2、白蛋白（aibumin,Alb)：由肝实质细胞合成，半衰期 15~19天，含量最多的蛋白质，占40%~60%。在肝细胞 中没有贮存。 • 分子结构1975年阐明，含585个氨基酸残基的单链多 肽，分子量66458，含17个二硫键（—S—S—），不含 糖的组分。 • ⑴功能 • ①运载：胆红素、长链脂肪酸、胆汁酸盐、前列腺素、类 固醇激素、金属离子（铜、镍、钙等）； • ②营养：内源性氨基酸 • ③维持血浆蛋白质胶体渗透压、缓冲酸碱作用。 • 血液中80％的渗透压是由白蛋白承担的。
• B、关于性别差异 • ⑴男性成人略高于女性的有：Alb、AAT、 IgA等 • ⑵女性略高于男性成人的有：CER、AGM、 a1脂蛋白等；在妊娠期明显增高的有： CER、TRF等。 • C、个体不同时期的差异及个体间的差异
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五种血浆蛋白在个体内与人群间的差异
个体内不同时间的变异（CV%）
• 血浆蛋白
• 一、血浆蛋白质的功能和分类 • 蛋白质（protein)：是人体内含量和种类最 多的物质。有10万多种。 • 血浆蛋白质（plasma protein):血浆中含量 最多的成分。有1000多种。目前已研究的 不下500种，其中已分离出纯品的有200多 种。
• （一）蛋白质概述： • 研究进展领域： • ⑴生物化学家：分离纯化各种组分。研究其物理 性质、氨基酸的组成及其顺序，以及某些蛋白质 中结合的 糖、脂类、金属化合物、活性多肽、类 固醇激素等，研究其合成、降解、转换更新与代 谢调节的研究。 • ⑵生理学家与病理生理学家；注重蛋白质的生理 功能，研究其胶体性质、缓冲性质和生理作用， 运输、结合功能等。
• （3）低白蛋白血症型： • 主要特征：血清总蛋白 浓度明显减低，其中以白 蛋白减低为主。 产生原因：由于合成蛋 白质所需的氨基酸长期供 应不足，以致 血清中的主 要成分白蛋白合成减少。 常见于慢性营 养失调、肝 硬化、肝炎、肾炎、肾病 综合症、大面 积烧伤或内 分泌紊乱、垂体病等。
检查结果：Alb 44.2%(↓)；α1 4.6%(N)；α2 14.6%(↑) β 18.3%(↑)；γ 18.3%(N)； 慢性肾炎患者。
• 蛋白类激素 • 胰岛素、胰高血糖素、生长素等
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3、血浆蛋白质的功能： ⑴营养：其中的氨基酸 ⑵缓冲与胶体渗透压：维持血液渗透压 ⑶运输：类固醇、甲状腺激素、维生素A、D、脂 类、金属、微量元素、药物等； ⑷免疫与防疫功能：免疫球蛋白、补体 ⑸凝血与纤溶 ⑹酶的特殊功能 ⑺代谢调控
• （2）先天性白蛋白缺陷型：主要特 征：由于血清白蛋白的显著降低， 血清总蛋白也随之降 低，α1、α2球 蛋白明显增高，γ球蛋白也增高。 严 重无白蛋白血症时，白蛋白有时 可降为零。 产生原因：本病是极少见的先天 性疾病，可能由于肝细胞内白 蛋白 合成功能遗传性缺陷或明显低下所 致。该病患 者的白蛋白含量尽管只 有正常人的0.05%， 而其血 浆胶渗 透压仍为正常人水平的 1/2左右， 这是由于球蛋白代偿性增加所致， 如传铁蛋白为正常人的 2 -3倍， α1 巨球蛋白为正常人的3.5倍， β脂蛋 白为3 倍，IgM为3倍，这时血清白 蛋白的半衰期也明显延长， 可为正 常人的3-4倍， 对维持血浆胶体渗透 压 均有一定作用。
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（三）影响血浆蛋白质浓度的因素 1、关于血浆蛋白质的正常参考值 A、年龄组的差异 ⑴AFP、AGM、a1AT浓度在新生儿期显著高于成人； Alb\Fib\IgG与成人接近。其他成分特别是IgM\IgA及C3、 C4补体成分均偏低。 • ⑵对8~95岁的年龄组分布调查有以下几个特征 • ①Alb在50岁以前保持恒定，50岁以后有下降趋势；② AA天灾男30岁、女40后有上升趋势；③a1脂蛋白、 AAT40后有上升趋势；④Hp随年龄增加而增加；⑤AGM 在40岁以前随年龄增加而下降，到年老时 由有上升。
• ⑵临床意义 • ①可以作为个体营养状态的评价指标 • ②血浆白蛋白明显减少时，可以影响许多 配体在循环血液中的存在形式； • ③白蛋白增高较少见，在严重失水时，对 监测血浓缩有诊断意义；
• （4）α1球蛋白缺陷型： • 主要特征：α1球蛋白明显降低，有 时可接近零，血清总蛋白及 其它各 组分的蛋白通常没有明显变化。 产生原因：此病通常认为是先天 性或家族性的，系由于α1抗胰 蛋白 酶合成低下所致。因为血中α1抗胰 蛋白酶减少 或缺乏，致使血中或组 织中的胰蛋白酶活性相对增 加，肺 结缔组织破坏亢进，对青年可以发 生肺气肿 ，当合并感染时，可见白 蛋白减低，但由于α1抗胰 蛋白酶减 少，即使有炎性病灶，α1区带也不 增加。
• （二）血浆蛋白质的分类 • 1.电泳分类法 • 2.功能分类法
• 1、电泳法：（醋纤膜电泳） • 正常人血清的区带电泳结果和扫描图像 • 从左至右的5个区带依次为白蛋白及α1、α2、β和γ球 蛋白区。有时在慢电泳时β球蛋白可分为β1球蛋白和β2球 蛋白。 • 白蛋白区的成分包括白蛋白、前白蛋白和部分α1脂蛋白; • α1区包括α1抗胰酶蛋白、α1脂蛋白、Ｇc球蛋白; • α2区包括触珠蛋白、铜蓝蛋白、α2巨球蛋白等; • β1区包括转铁蛋白、补体Ｃ3ｃ、C4等; • β2区包括Ｃ3ｂ、 β2微球蛋白、Fb; • γ区包括IgA、IgＧ、IgＭ、CRP等。
第八章
体液蛋白质检验
人类白蛋白分子
本章内容概要：
第一节 概述
第二节 体液蛋白质测定
第一节 概
机体主要的 机体蛋白质： 生物大分子
述
含量：人体固体成分的45% 种类：10万，3000~5000种/单细胞 功能：生长，代谢、血凝、运动、免 疫、信息传递等
体液蛋白质的检测：
疾病发生
体液蛋白质
异常
• ⑹血浆蛋白质广泛应用于组织和细胞的培 养，血浆中含有各总细胞刺激因子和抑制 因子，它们对稀薄啊的活力、增殖、分化、 胞内酶的合成及细胞特殊功能起者特殊的 作用。 • ⑺在人类不少疾病，包括两种常见的疾 病——动脉粥样硬化及肿瘤的发病学研究， 以及最常见的糖尿病及其并发症的发病机 制中，血浆蛋白质均有广泛涉及。
• 正常血清蛋白电泳（serum protein electrophoresis,SPE) • 正常参考值： Alb:57%-68% α1:1.0%-5.7% α2:4.9%-11.2% β:7%-13% γ:9.8%-18.2%
• 2.功能分类法
• • • • 血浆蛋白质 • • • 运输载体类 补体蛋白类 血清酶类 蛋白酶抑制物 免疫球蛋白 凝血蛋白类 蛋白类激素
• 凝血蛋白类: 疫球蛋白: • IgG 、IgA、IgM、IgD、IgE
• • • •
蛋白酶抑制物 A1-抗胰蛋白酶（a1-AT） A1-抗糜蛋白酶（a1-ACT) A2-巨球蛋白（ a2-MG)
• 血清酶类: • 血浆固有酶LCAT、脂蛋白酯酶、凝血酶原、 纤溶酶等
不同个体间的变异（CV%）
结合珠蛋白 α1-酸性糖蛋白 转铁蛋白
9.5 11 2.5
71 42 9
α1-抗胰蛋白酶
α2-巨球蛋白
3
3
16
17
• 2、急性时相反应蛋白（acute phase reactants,APR) • 概念：在炎症、创伤、心肌梗塞、感染、 肿瘤等情况下血浆中浓度显著上升或降低 的蛋白质。 • 升高的有：AAT、AAG、CER、C3、C4、 CRP、Flb、hP等 • 降低的有：PA、Alb及TRF，称为负性 APR。
• 3、r球蛋白增多与M蛋白 • 正常SPE中γ球蛋白区带：IgG；IgM；IgA； IgD；IgE • M蛋白是浆细胞或B淋巴细胞单克隆恶性增 殖所产生的一种大量的异常免疫球蛋白， 因其多见于多发性骨髓瘤 (multiple myeloma)、巨球蛋白血症 (macroglobulinemia)及恶性淋巴瘤 (malignant lymphoma)，都是以M开头的 疾病，故称为“M蛋白”。