1(1).实验一
- 格式：ppt
- 大小：858.50 KB
- 文档页数：34
下载文档原格式
合集下载
实验一阿司匹林1
实验一阿司匹林（乙酰水杨酸）的合成（方法一）一、目的要求１．熟悉阿司匹林的性状、特点和化学性质。
２．掌握酯化反应的原理和实验操作３．巩固重结晶、精制、抽滤等基本操作技术。
４．了解阿司匹林中杂质的来源和鉴定。
二、反应原理COOHOH+ (CH3CO)2OCOOHOCOCH3+ CH3COOH H SO三、实验方法１．原料规格及配比２．操作步骤（１）乙酰水杨酸的制备称取水杨酸5.0g，置于100mL锥形瓶中，加入醋酐7.5mL，滴加浓硫酸3滴，注意勿将固体沾附到瓶壁上，在50~60℃水浴锅上搅拌10min。
若已析出结晶，仍于50~60℃水浴内反应，保证反应10min。
然后冷却，待结晶析出后，再加蒸馏水75mL，用玻璃棒轻轻搅拌，继续冷却直至乙酰水杨酸完全析出。
抽滤，滤饼用蒸馏水15mL分3次快速洗涤，洗涤时先停止减压，用刮刀轻轻将滤饼拨松，而后用5mL水浸湿结晶，抽滤，玻塞挤压滤饼，抽干，得粗品。
（２）精制将乙酰水杨酸粗品移至50mL锥形瓶中，加入无水乙醇约10mL，于水浴中加热溶解，另取40mL蒸馏水于100mL锥形瓶中预热至60℃。
将乙醇溶液倒入热蒸馏水中，这时如有固体析出则加热至澄清，放置，冷却，慢慢析出针状结晶，抽滤，用1:1醇水溶液3～5mL洗涤,抽干，50℃干燥1h，得精品。
３．附注（１）乙酰化反应所用的仪器、量具必须干燥，同时注意不要让水蒸气进入锥形瓶。
（２）乙酰化反应温度不宜过高，否则将增加副产物（乙酰水杨酸酯、乙酰水杨酸水杨酸酯）的生成。
（３）倘若在冷却过程中阿司匹林没有从反应液中析出，可用玻璃棒轻轻摩擦锥形瓶的内壁，也可同时将锥形瓶放入冰浴中冷却，促使结晶生成。
（４）加水时要注意，一定要等结晶充分形成后才能加入。
加水时要慢慢加入，并有放热现象，甚至会使溶液沸腾，产生醋酸蒸气，必须小心。
（５）阿司匹林受热易分解，可生成复杂物质使熔点下降。
因此，需将传温液预热至130℃后立即放入样品，迅速测定熔点。
实验一 乙苯脱氢制苯乙烯
4.2 实验一 乙苯脱氢制苯乙烯一 实验目的（1）了解以乙苯为原料，氧化铁系为催化剂，在固定床单管反应器中制备苯乙烯的过程。
（2）学会稳定工艺操作条件的方法。
二 实验原理1．本实验的主副反应 主反应：副反应：在水蒸气存在的条件下，还可能发生下列反应：此外还有芳烃脱氢缩合苯乙烯聚合生成焦油和焦等。
这些连串副反应的发生不仅使反应的选择性下降，而且极易使催化剂表面结焦进而活性下降。
（1）影响本反应的因素 1）温度的影响乙苯脱氢反应为吸热反应，00>∆H，从平衡常数与温度的关系式20ln RT H T K pp ∆=⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛∂∂可知，提高温度可增大平衡常数，从而提高脱氢反应的平衡转化率。
但是温度过高副反应增加，使苯乙烯选择性下降，能耗增大，设备材质要求增加，故应控制适宜的反应温度。
本实验的反应温度为：540~600℃。
2）压力的影响乙苯脱氢为体积增加的反应，从平衡常数与压力的关系式n p K K =γ∆⎪⎪⎭⎫⎝⎛∑i nP 总可知，当γ∆>时，降低总压总P 可使n K 增大，从而增加了反应的平衡转化率，故降低压力有利于平衡向脱氢方向移动。
本实验加水蒸气的目的是降低乙苯的分压，以提高平衡转化率。
较适宜的水蒸气用量为：水∶乙苯=1.5∶1（体积比）或8∶1（摩尔比）。
3）空速的影响乙苯脱氢反应系统中有平衡副反应和连串副反应，随着接触时间的增加，副反应也增加，苯乙烯的选择性可能下降，适宜的空速与催化剂的活性及反应温度有关，本实验乙苯的液空速以0.6h-1为宜。
（2）催化剂本实验采用氧化铁系催化剂其组成为：Fe2O3—CuO—K2O3—CeO2。
三预习与思考（1）乙苯脱氢生成苯乙烯反应是吸热还是放热反应？如何判断？如果是吸热反应，则反应温度为多少？实验室是如何来实现的？工业上又是如何实现的？（2）对本反应而言是体积增大还是减小？加压有利还是减压有利？工业上是如何来实现加减压操作的？本实验采用什么方法？为什么加入水蒸气可以降低烃分压？（3）在本实验中你认为有哪几种液体产物生成？哪几种气体产物生成？如何分析？四实验装置及流程见图4.2-1。
实验一.称量实验
实验一称量实验1.实验目的1.1学会正确使用分析天平。
1.2掌握减重称量的方法，了解直接称量法。
2.实验仪器及方法2.1仪器：分析天平，砝码，软毛刷，称量瓶，称量用样品等。
2.2实验仪器装置图：1.横梁。
2平衡螺丝。
4指针，微分标牌5支点刀和承重刀6框罩7圈码8指数盘9支力销10托梁架11阻尼器12投影屏13称盘14盘托15螺旋脚17开关旋钮18调零杆2.3方法：a.使用单盘电光天平，1g以上用砝码盒中的砝码，100~900mg由加砝码（或称指数盘）外圈转加，10~90mg有加码器内圈转加，10mg以下有光幕标尺读取，读准至0.1mg。
b.使用单盘电光自动天平，100mg以上由加码器加放，100mg以下由光幕标尺读取，读准至0.1mgc..使用电子分析天平，直接由读数屏幕读数，读准至0.1mg3．实验步骤3.1检查天平：观察天平各部件是否处于正常状态，检查天平的水平与清洁情况，砝码盒中的砝码有无短缺，调节天平零点。
3.2直接称量练习3.21称量称量瓶的质量从干燥器中取一称量瓶，放在天平盘上，称其重量并进行记录。
重复称量2~3次，求出平均值。
3.22称量瓶盖的质量将瓶盖放在天平盘上（瓶体放回干燥器内），称其质量并进行记录。
重复称量2~3次，求出平均值。
3.23称量瓶体的质量将瓶体放在天平盘上（瓶体放回干燥器内），称其质量并进行记录。
重复称量2~3次，求出平均值。
3.3减重称量练习3.31取一空称量瓶A（空），在托盘天平粗称并记录。
3.32将样品粉末（用小药匙）小心地装入空瓶内约2.0~2.3g（勿洒落瓶外），粗称A并记录。
3.33将A精称（分析天平上）并记录。
3.34将A中平行倒出三样样品（每份0.45~0.55g）于另一容器，每倒出一份需精称A并记录。
此次实验是最基本的称量实验，以前总是觉得非常简单，做得不够精确，所以没有做得很好，这次经过老师的提醒，更加注重数据的准确性，对实验的态度也更端正点了。
实验一(一) 熔点的测定(毛细 管法)
实验一(一) 熔点的测定（毛细管法）一、实验目的1、了解熔点测定的意义。
2、掌握用毛细管法测定熔点的操作。
二、基本原理物质的熔点是指物质的固液两相在大气压下达成平衡时的温度T M。
当温度高T M时，所有的固相将全部转化为液相；若低于T M时，则由液相转变为固相。
纯粹的固态物质通常都有固定的熔点，但在一定压力下，固液两相之间的变化对温度是非常敏锐的，从开始熔化（始溶）至完全熔化（全熔）的温度范围（熔程）较小，一般不超过0.5—1℃。
若该物质中含有杂质时，则其熔点往往较纯粹物质的熔点低，而且熔程也较大。
因此，熔点的测定常常可以用来识别和定性地检验物质的纯度。
若测定熔点的样品为两种不同的有机物的混合物（如肉桂酸和尿素），他们各自的熔点均为133℃，但把它们等量混合，再测其熔点，则比133℃低得多，而且熔程较大。
这种现象叫做混合熔点下降，这种实验叫做混合熔点实验，是用来检验两种熔点相同或相近的有机物质是否为同一种物质的简便的物理方法。
本实验采用简便的毛细管法测定熔点，实际上由此法测得的不是一个温度点，而是熔化范围，所得的结果也常高于真实的熔点，但作为一般纯度的鉴定已经可以了。
用毛细管法测定熔点时，温度计上的熔点读数与真实熔点之间常有一定的偏差，原因是多方面的，温度的影响是一个重要因素。
如温度计中的毛细管孔径不均匀，有时刻度不精确。
温度计刻度有全浸式和半浸式两种。
全浸式温度计的刻度是在温度计的汞线全部均匀受热的情况下刻出来的，在使用这类温度计测定熔点时仅有部分汞线受热，因而露出来的温度当然较全部受热者为低。
另外长期使用的温度计，玻璃也可能发生体积变形使刻度不准。
为了消除上述误差，可选择几种已知熔点的纯粹有机化合物作为标准，以实测的熔点作纵坐标，测得的熔点与应有熔点的差值作横坐标，绘成曲线，从图中曲线上可直接读出温度计的校正值。
三、仪器与试剂1、仪器：b形管、毛细管、酒精灯、铁架台、玻璃棒、表面皿、温度计、缺口软木塞。
实验一白盒测试（一）
实验⼀⽩盒测试（⼀）实验⼀⽩盒测试(⼀)⼀、实验⽅法：1、项⽬任务驱动教学法；2、“讲、学、练”相结合。
⼆、实验仪器与设备：1、计算机（要求：CPU 1000MHz以上，内存512M以上，磁盘空间20G以上。
）；2、Eclipse；3、⼀个JAVA程序；三、实验⽬的：1、掌握⽩盒测试理论；2、掌握⽩盒测试的重要⽅法；3、掌握逻辑覆盖⽅法的原理；4、分析程序，设计逻辑覆盖的测试⽤例四、实验重点：1、逻辑覆盖⽅法的原理；2、分析程序，设计逻辑覆盖的测试⽤例。
五、实验难点：1、分析程序，设计逻辑覆盖的测试⽤例六、实验项⽬：使⽤逻辑覆盖⽅法测试⼀个JA V A程序1、实训要求：1、JAVA 程序。
2、根据⽩盒测试技术的逻辑覆盖⽅法设计程序的测试⽤例。
2、实训步骤：1、编写程序public static int DoWord(int x,int y,int z){if(x>3&&z<10)y=y/x+4;if (x==4 || y>5)y=x*y-10;return y;}2、设计测试⽤例（1）根据⽩盒测试技术的逻辑覆盖⽅法设计该程序的测试⽤例，分别满⾜：a.语句覆盖b.判定覆盖if(x>3&&z<10)y=y/x+4;if (x==4 || y>5)y=x*y-10;return y;}（2）根据上⾯设计的测试⽤例使⽤Junit编写程序进⾏测试。
要求：包括测试⽤例和预期结果，并书写实验报告。
1实验一 免疫血清的制备及应用(1)
实验一免疫血清的制备及应用（1）免疫血清（溶血素）的制备【实验原理】用绵羊红细胞(SRBC)免疫家兔，可获得抗绵羊红细胞抗体(抗SRBC抗体)。
SRBC与抗SRBC抗体结合，在补体参与下，可出现红细胞溶解，因此抗SRBC抗体也称为溶血素。
【主要试剂与器材】1.健康雄性家兔、绵羊。
2.2%碘酒、75％酒精、无菌生理盐水。
3.0.10g/L硫酸镁生理盐水溶液。
4.无菌三角瓶(内装玻璃珠)、离心管、吸管、注射器。
5.离心机。
【操作方法】1.抗原制备（1）用碘酒、75％酒精消毒绵羊颈静脉处皮肤，抽血，缓慢注入含有玻璃珠的无菌三角瓶内，轻轻摇动三角瓶，脱纤维抗凝。
抗凝绵羊血用Alsever液可保存2周。
（2）无菌取抗凝绵羊血于离心管中，加适量生理盐水，2000r/min离心5min，吸去上清液和白细胞层，再用较多的无菌盐水与红细胞混匀，离心再弃上清，重复3次，最后一次离心10min。
（3）根据红细胞压积，用0.10g/L硫酸镁生理盐水溶液配成20％SRBC悬液。
2.免疫动物（1）取健康雄性家兔，通过耳静脉免疫，免疫程序见表1-2。
表1-2 溶血素制备免疫方案【结果判断】收获的抗血清应是无菌、无溶血的。
【注意事项】注意无菌操作，并尽可能多的采集血清。
【方法评价】溶血素方法简便易行，但是动物个体间产生溶血素质量差异较大。
【临床应用】溶血素可直接用于补体参与的溶血反应，如总补体溶血活性和单个补体成分溶血活性测定。
用溶血素和SRBC做指示系统，可进行补体结合试验。
【思考题】在制备绵羊红细胞过程中为什么要洗涤并吸去红细胞表面的白细胞层?。
流化床实验报告(1)(1)(1)
贵州xx学院化工原理实验报告学院：xxxxx 专业：xxxxxxxxx 班级：化工xx利用床层的压降来测定干燥过程的失水量。
（1）准备0.5~1kg 的湿物料，待用。
（2）开启风机，调节风量至40～60m 3/h ，打开加热器加热。
待热风温度恒定后（通常可设定在70～80℃），将湿物料加入流化床中，开始计时，此时床层的压差将随时间减小，实验至床层压差（）恒定为止。
则物料中瞬间含水率为（11－3）式中，—时刻时床层的压差。
计算出每一时刻的瞬间含水率，然后将对干燥时间作图，如图11－1，即为干燥曲线。
图11－1恒定干燥条件下的干燥曲线上述干燥曲线还可以变换得到干燥速率曲线。
由已测得的干燥曲线求出不同下的斜率，再由式11－1计算得到干燥速率，将对作图，就是干燥速率曲线，如图11－2所示。
e p ∆i X eei p p p X ∆∆-∆=p ∆τi X i X i τi X iid dX τU U X图11－2恒定干燥条件下的干燥速率曲线将床层的温度对时间作图，可得床层的温度与干燥时间的关系曲线。
3. 干燥过程分析预热段见图11－1、11－2中的AB段或A′ B段。
物料在预热段中，含水率略有下降，温度则升至湿球温度t W,干燥速率可能呈上升趋势变化，也可能呈下降趋势变化。
预热段经历的时间很短，通常在干燥计算中忽略不计，有些干燥过程甚至没有预热段。
恒速干燥阶段见图11－1、11－2中的BC段。
该段物料水分不断汽化，含水率不断下降。
但由于这一阶段去除的是物料表面附着的非结合水分，水分去除的机理与纯水的相同，故在恒定干燥条件下，物料表面始终保持为湿球温度t W，传质推动力保持不变，因而干燥速率也不变。
于是，在图11－2中，BC段为水平线。
只要物料表面保持足够湿润，物料的干燥过程中总处于恒速阶段。
而该段的干燥速率大小取决于物料表面水分的汽化速率，亦即决定于物料外部的空气干燥条件，故该阶段又称为表面汽化控制阶段。
实验一 分析化学实验基础知识(1)
分析纯试剂。 试剂在使用和存放过程中要保持清洁，防止污染或变质。用毕盖
严、多取的试剂不允许倒回原试剂瓶。氧化剂、还原剂必须密封、避光 存放。易挥发及低沸点试剂应低温存放，易燃易爆试剂要有安全措施剧 毒试剂要专门保管。试剂标签不清洁或脱落应该及时重新帖好。
二、试剂的取用 取用试剂药品前，应看清标签。取用时，先打开瓶塞，将瓶塞反放 在实验台上。如果瓶塞上端不是平顶而是扁平的，可用食指和中指将瓶 塞夹住（或放在清洁表面皿上），绝不可将它横置桌上以免沾污。不能 用手接触化学试剂。应根据用量取用试剂，这样既能节约药品，又能取 得好的实验结果。取完试剂后，一定要把瓶塞盖严，绝不允许将瓶盖张 冠李戴。然后把试剂放回原处，以保持实验台整齐干净。 1、试剂瓶的种类 （1）细口试剂瓶：用于保存试剂溶液，通常有无色和棕色两种。 遇光易变化的试剂（如硝酸银等）用棕色瓶。通常为玻璃制品，玻璃瓶 的磨口塞各自成套，注意不要混淆。聚乙烯瓶盛苛性碱较好。 （2）广口试剂瓶：用于装少量固体试剂，有无色和棕色两种。 （3）滴瓶：用于盛逐滴滴加的试剂，例如指示剂等，也有无色和 棕色两种。使用时用中指和无名指夹住乳头和滴管的连接处，捏住（松 开）乳头，以吸取或放出试液。 2、固体试剂的取用 （1）要用清洁、干燥的药匙取试剂。药匙的两端为大小不同的两 个匙，分别用取大量固体和少量固体。应专匙专用，用过的药匙必须洗 净擦干后才能再使用。 （2）注意不要超过指定用量取药，多取的不能倒回原瓶，可放在 指定的容器中供他人使用。 （3）要求取用一定质量的固体试剂时，可把固体放在干燥的纸上 称量。具有腐蚀性或易潮解的固体应放在表面皿上或称量瓶内称量。 （4）固体的颗粒较大时，可在清洁干燥的研钵中研碎。研钵中所 盛固体的量不要超过研钵容量的1/3。 （5）有毒药品要在教师指导下取用。 3、液体试剂的取用 （1）从滴瓶中取用液体试剂时，要用滴瓶中的滴管。滴管决不能 伸入所用的容器中，以免接触器壁而沾污药品。如用滴管从试剂瓶中取 少量液体试剂时，则需要附于该试剂瓶的专用滴管取用。装有药品的滴 管不得横置或滴管口向上斜放，以免液体流入滴管的橡皮头中。
《普通化学》实验一、化学反应摩尔焓变的测定
实验一化学反应摩尔焓变的测定（2学时）一、实验目的：1．了解测定反应摩尔焓变的原理和方法；2．学习称量、溶液配制和测温等基本操作；3．学习实验数据的作图法处理。
二、实验原理本实验测定CuSO4溶液与锌粉反应的摩尔焓变：Cu2+(aq) + Zn(S) = Cu(S) + Zn2+(aq)在相对绝热条件下，取一定量的CuSO4溶液与过量锌粉反应，考虑量热计热容的条件下，反应放出的热量q p等于系统中溶液吸收的热量q与量热计吸收的热量之和，该反应的摩尔焓变Δr HӨ计算公式为：Δr HӨ=－[(V sρs C s + C b)ΔT]／[C(CuSO4)V s]其中V s—反应后溶液的体积，mLρs—反应后溶液的密度，g·mL-1C s—反应后溶液的比热容，J·g-1·K-1C b—量热计的热容，J·K-1ΔT—由作图法求出的反应前后温度差量热计热容采用在量热杯中冷热水混合热量守恒的原理，计算公式为：(T h-T m)V hρ(H2O)c(H2O) = (T m-T c)[V cρ(H2O)c(H2O) + C b ]三、实验用品量热计一套，电磁搅拌器，烧杯，玻璃温度计,容量瓶，量筒等。
四、实验步骤1．250ml 0.200mol·L-1CuSO4溶液的配制准确称取计算量的CuSO4·5H2O固体,以大约50mL的去离子水溶解，转入250mL容量瓶中，重复3-4次，直至硫酸铜全部溶解，定容，盖紧瓶塞，混匀。
2．反应摩尔焓变的测定（1）在台天平上称取锌粉（c·p）3g，将其装入量热计的加料器中，并检查密封。
（2）量取100mL配制好的0.200mol·L-1的硫酸铜溶液，注入干净的量热计的反应杯中；加入搅拌磁子,盖上盖子，插入温度计传感器,将量热计的反应杯放在电磁搅拌上。
（3）开启电磁搅拌，同时打开秒表，每隔30秒记录一次溶液温度，直至溶液与量热计达到平衡（约2～3min）。
实验一移液管容量瓶的使用
实验一移液管、容量瓶的使用一、实验目的1．掌握移液管、容量瓶、洗涤、干燥及存放方法；2．掌握移液管、容量瓶的规范使用方法及使用注意事项。
二、实验原理移液管为量出式（EX）计量玻璃仪器，吸量管是具有分刻度的玻璃管，吸量管转移溶液的准确度不如移液管。
在滴定分析中，要用到3种能准确测量溶液体积的仪器，即滴定管，移液管和容量瓶。
这3种仪器的正确使用是滴定分析中最重要的基本操作。
对这些仪器使用得准确、熟练就可以减少溶液体积的测量误差，为获得准确的分析结果创造了先决条件。
三、仪器与试液（一）仪器：移液管、容量瓶。
（二）试液：自来水、洗涤剂、蒸馏水、毛刷。
◆洗液：将8克重铬酸钾用少量水润湿，慢慢加入180ml粗硫酸，搅拌以加速溶解，冷却后贮存于磨口试剂瓶中。
四、实验方法与步骤（一）移液管基本操作1．洗涤洗涤前，应先检查移液管或吸量管的管口和尖嘴有无破损，若有破损则不能使用。
（1）自来水洗涤若干次，较脏（内壁挂水珠）时，可用铬酸酸洗液洗净。
使其内壁下端的外壁均不挂水珠，用滤纸片将液液口内外残留的水擦掉。
（2）实验室用水润洗：自来水洗净后，要用实验室用水润洗2-3次，方法是：用洗净并烘干的小烧杯盛装实验室用水，用移液管吸取5-10ml，立即用右手食指按信管口（尽量勿使溶液回流，以免稀释），将管横过来，用两手的拇指及食指分别拿住移液管的两端，转动移液管并使溶液布满全管内壁，当溶液流至距上口2-3cm时，将管直立，使溶液由尖嘴（流液口）放出，弃去。
（3）欲移取溶液润洗：移取溶液前，先用欲移取的溶液涮洗三次，方法是：用洗净并烘干的小烧杯倒出一部分欲移取的溶液，用移液管吸取溶液5-10ml，立即用右手食指按信管口（尽量勿使溶液回流，以免稀释），将管横过来，用两手的拇指及食指分别拿住移液管的两端，转动移液管并使溶液布满全管内壁，当溶液流至距上口2-3cm时，将管直立，使溶液由尖嘴（流液口）放出，弃去。
2．吸取溶液：用移液管自容量瓶中移取溶液时，右手拇指及中指拿管颈刻线以上的地方（后面二指依次靠拢中指），将移液管插入容量瓶内液面以下1-2cm深度，不要插入太深，以免外壁沾带溶液过多；也不要插入太浅，以免液面下降时吸空，左手拿洗耳球，排除空气后紧按在移液管口上，借吸力使液面慢慢上升，移液管应随容量瓶中液面的下降而下降，当管中液面上升至刻线以上时，迅速用右手食指堵住管口（食指最好是潮而不湿）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子生物学其它常用实验仪器
1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机
5. 微量取液器
实验一 聚合酶链式反应 （PCR）扩增DNA片段
一．实验目的 二．实验原理 三．实验仪器、材料与试剂
四．实验步骤
五．实验结果与讨论
一．实验目的 掌握PCR反应的原理及技术 二．实验原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体 外扩增特异DNA片段的技术； • 利用PCR技术可在短时间内获得数 百万个特异的DNA序列的拷贝；
⑤ 引物之间： 两引物之间不应有互补性，尤 其避免3’端的互补重叠以防引物二聚体的 形成。 ⑥ 引物的3’端： 引物的延伸是从3’端开始的， 不能进行任何修饰。 ⑦ 引物的5’端：引物的5’端限定着PCR产物的 长度，它对扩增特异性影响不大。因此， 可以被修饰而不影响扩增的特异性。 • 引物5’端的修饰包括：加酶切位点；标记 生物素、荧光等；引入蛋白质结合位点； 引入突变位点、插入与缺失突变序列和引 入启动子序列等。
⑥ 所有试剂都应该以大体积配制，试验一下 是否满意，然后分装成小份以确保实验间 的连续性。 ⑦ 所有试剂或样品准备过程中都要使用一次 性灭菌的塑料瓶和离心管，玻璃器皿应洗 涤干净并高压灭菌。 ⑧ PCR样品应在冰浴上化开，并且要充分 混匀。 ⑨ 扩增反应应当设计不加模板的阴性对照， 电泳时应当加标准DNA分子量标记 （Marker）以估计产物的大小。
五、实验结果与讨论
PCR体系的调制过程中应尽量减少污染的 机会，以免出现目的条带以外的杂带。 • 如退火温度过低，也可能出现杂带。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12 13 M
使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750bp，500bp，250bp，100bp。
2. 按下述循环程序进行扩增 ① 94℃ 5（3）分钟，1个循环； ② 94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分25秒；30 个循环； ③ 72℃ 延伸10 分钟。 ④ 4℃保温。
3. 扩增结束后，取全部 PCR扩增产物进行1% 的琼脂糖电泳，检测扩增情况、分析结果。 • 并在紫外灯下切割扩增的琼脂糖胶块中的 DNA片段、放入Eppendorf管中。4℃冰箱 存放，用于回收。
1. 琼脂糖 2. TAE电泳缓冲液(50×): Tris 242g ,冰醋酸 57.1ml, 0.5mol/L EDTA（pH8.0）100ml 。 稀释到电泳缓冲液1×TAE 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml，室温下棕色瓶或 铝铂纸包装保存。 4. 10 ×(6×) ×溴酚蓝指示剂（DNA样品加 样缓冲液）
⑩ 琼脂糖凝胶电泳对DNA分子的检测，主要 基于在凝胶中加入溴化乙锭，这样溴化乙 锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物， 使DNA在紫外光下发射很强的荧光，而在 紫外光下DNA发出的荧光是可见光。在溴 化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于 DNA的含量，因而DNA的检测很方便。 • 如将已知大小和浓度的标准样品（Marker） 作电泳对照，就可估计出待测样品的大小 和浓度。
• PCR技术在分子克隆、遗传病的基因 诊断等方面得到了广泛的应用。 PCR技术实际上是在模板DNA、引 物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依 赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 • PCR技术的特异性取决于引物和模板 DNA结合的特异性。
PCR：变性－退火－延伸
PCR
靶DNA的扩增
5’ (a) 引物2 5’ 3’ 5’ (c) 引物2互补链 3’
(d)
3’ 3’ 5’ 引物1 3’
(b)
引物1互补链
5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链 5’ 3’ 3’ 5’
(f)
引物2互补链
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
反应分为三步：
1. 变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链 DNA； 2. 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在 局部形成杂交链； 3. 延伸： 在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条 件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸 反应。 • 以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为 下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个 引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数 量可达到106-107个拷贝。
⑧ 密码子的简并： 如扩增编码区域，引物3’ 端不要终止于密码子的第三位，因为第三 位容易发生简并，会影响扩增特异性与效 率。 ⑨ 引物的特异性： 引物与非特异扩增序列的 同源性不要超过70%或有连续8个碱基同源。 ⑩ 避免产物的二级结构： 选择扩增片断时最 好避开二级结构的区域。 现在有商品化的或免费的计算机软件程序， 可用来在特定的区域中选择引物序列。在 对所研究基因组全部序列并不完全知道的 情况下，这些程序既方便又实用。
1×TAE配制1 %的 Agrose琼脂糖凝胶 液 • 加热，使琼脂糖完全溶解； • 待Agrose琼脂糖凝胶液稍凉（约60℃） 后，加入 约1/1000的1 mg/ml溴化乙锭溶 液（至终浓度为0.5-1 μg/ml）后轻轻混 匀，勿起气泡（避免剧烈摇晃产生气 泡）； • 等溶液降温到50-55℃左右（不烫手）， 将其倒入电泳槽，迅速在制胶槽一端插 上梳子，检查有无气泡。
PCR技术的参数主要有7个：聚合酶、 引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、 模板、一价离子。
三、实验仪器、材料与试剂
（一）仪器 1. PCR仪 2. 台式离心机 3. 微量取液器 4. 紫外荧光观测仪 5. 高压灭菌的微量离心管 6. DNA扩增系统 7. 琼脂糖凝胶电泳系统
（二）材料 模板DNA : 800bp的片段插入在pEASY-T1 载体（或pMD18-T或KS载体) （三）试剂 1. 10×PCR buffer 2. dNTPs ： 2.5mM ×4 3. Taq 酶： 5U/µ L 4. 引物1和2 (M13F, M13R) ： 2μmol/L
在紫外观测仪上观察电泳结果； 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml离 心管中，放入4 ℃ （-20℃）冷冻保存， 以备以后的实验用。
附：引物设计原则
① 寡核苷酸引物长度一般为15—30bp. ② G+C含量 G+C含量一般在40%-60%。 ③ 碱基的随机分布： 引物中碱基的分布最好 是随机分布的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的 存在。 ④ 引物自身：引物自身不应存在互补序列， 否则引物自身折叠成发夹结构或引物本身 复性。这种二级结构会因空间位阻而影响 引物与模板的复性结合。
pMD18-T Vector
四、实验步骤
1. 在0.2ml Eppendorf管内配制25μl反应体系： ddH2O： 18.25µ (25-6.75) ×7 l 10×PCR buffer： 2.5µ l×7 dNTPs（2.5mM×4） 2µl ×7 M13-F(10µ M)： 0.5µ ×7 l M13-R(10µM)： 0.5µ ×7 l Taq 酶： 0.25ul ×7 模板： 1µ /每管 l 注：做一管阴性对照，即模板为灭菌的双蒸水
注意事项
① PCR反应是在一个在没有DNA污染的干净环 境中进行。 ② 一般而言，只要能够得到可靠的结果，模板 纯化的方法越简单越好。 ③ 要使用新配制的或适当贮存的未使用过的试 剂或缓冲液来提取核酸，不要使用以前用于 别的样品的试剂。 ④ 所用的所有溶液都应该没有核酸和核酸酶的 污染。配制试剂，操作样品，建立反应和以 后的检测扩增产物过程中最好都使用手套。 ⑤ 所有PCR试剂中使用的水都应该用新鲜蒸馏 的去离子水，高压灭菌后分装备用。
1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机
5. 微量取液器
实验一 聚合酶链式反应 （PCR）扩增DNA片段
一．实验目的 二．实验原理 三．实验仪器、材料与试剂
四．实验步骤
五．实验结果与讨论
一．实验目的 掌握PCR反应的原理及技术 二．实验原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体 外扩增特异DNA片段的技术； • 利用PCR技术可在短时间内获得数 百万个特异的DNA序列的拷贝；
⑤ 引物之间： 两引物之间不应有互补性，尤 其避免3’端的互补重叠以防引物二聚体的 形成。 ⑥ 引物的3’端： 引物的延伸是从3’端开始的， 不能进行任何修饰。 ⑦ 引物的5’端：引物的5’端限定着PCR产物的 长度，它对扩增特异性影响不大。因此， 可以被修饰而不影响扩增的特异性。 • 引物5’端的修饰包括：加酶切位点；标记 生物素、荧光等；引入蛋白质结合位点； 引入突变位点、插入与缺失突变序列和引 入启动子序列等。
⑥ 所有试剂都应该以大体积配制，试验一下 是否满意，然后分装成小份以确保实验间 的连续性。 ⑦ 所有试剂或样品准备过程中都要使用一次 性灭菌的塑料瓶和离心管，玻璃器皿应洗 涤干净并高压灭菌。 ⑧ PCR样品应在冰浴上化开，并且要充分 混匀。 ⑨ 扩增反应应当设计不加模板的阴性对照， 电泳时应当加标准DNA分子量标记 （Marker）以估计产物的大小。
五、实验结果与讨论
PCR体系的调制过程中应尽量减少污染的 机会，以免出现目的条带以外的杂带。 • 如退火温度过低，也可能出现杂带。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12 13 M
使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750bp，500bp，250bp，100bp。
2. 按下述循环程序进行扩增 ① 94℃ 5（3）分钟，1个循环； ② 94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分25秒；30 个循环； ③ 72℃ 延伸10 分钟。 ④ 4℃保温。
3. 扩增结束后，取全部 PCR扩增产物进行1% 的琼脂糖电泳，检测扩增情况、分析结果。 • 并在紫外灯下切割扩增的琼脂糖胶块中的 DNA片段、放入Eppendorf管中。4℃冰箱 存放，用于回收。
1. 琼脂糖 2. TAE电泳缓冲液(50×): Tris 242g ,冰醋酸 57.1ml, 0.5mol/L EDTA（pH8.0）100ml 。 稀释到电泳缓冲液1×TAE 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml，室温下棕色瓶或 铝铂纸包装保存。 4. 10 ×(6×) ×溴酚蓝指示剂（DNA样品加 样缓冲液）
⑩ 琼脂糖凝胶电泳对DNA分子的检测，主要 基于在凝胶中加入溴化乙锭，这样溴化乙 锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物， 使DNA在紫外光下发射很强的荧光，而在 紫外光下DNA发出的荧光是可见光。在溴 化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于 DNA的含量，因而DNA的检测很方便。 • 如将已知大小和浓度的标准样品（Marker） 作电泳对照，就可估计出待测样品的大小 和浓度。
• PCR技术在分子克隆、遗传病的基因 诊断等方面得到了广泛的应用。 PCR技术实际上是在模板DNA、引 物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依 赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 • PCR技术的特异性取决于引物和模板 DNA结合的特异性。
PCR：变性－退火－延伸
PCR
靶DNA的扩增
5’ (a) 引物2 5’ 3’ 5’ (c) 引物2互补链 3’
(d)
3’ 3’ 5’ 引物1 3’
(b)
引物1互补链
5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链 5’ 3’ 3’ 5’
(f)
引物2互补链
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
反应分为三步：
1. 变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链 DNA； 2. 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在 局部形成杂交链； 3. 延伸： 在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条 件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸 反应。 • 以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为 下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个 引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数 量可达到106-107个拷贝。
⑧ 密码子的简并： 如扩增编码区域，引物3’ 端不要终止于密码子的第三位，因为第三 位容易发生简并，会影响扩增特异性与效 率。 ⑨ 引物的特异性： 引物与非特异扩增序列的 同源性不要超过70%或有连续8个碱基同源。 ⑩ 避免产物的二级结构： 选择扩增片断时最 好避开二级结构的区域。 现在有商品化的或免费的计算机软件程序， 可用来在特定的区域中选择引物序列。在 对所研究基因组全部序列并不完全知道的 情况下，这些程序既方便又实用。
1×TAE配制1 %的 Agrose琼脂糖凝胶 液 • 加热，使琼脂糖完全溶解； • 待Agrose琼脂糖凝胶液稍凉（约60℃） 后，加入 约1/1000的1 mg/ml溴化乙锭溶 液（至终浓度为0.5-1 μg/ml）后轻轻混 匀，勿起气泡（避免剧烈摇晃产生气 泡）； • 等溶液降温到50-55℃左右（不烫手）， 将其倒入电泳槽，迅速在制胶槽一端插 上梳子，检查有无气泡。
PCR技术的参数主要有7个：聚合酶、 引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、 模板、一价离子。
三、实验仪器、材料与试剂
（一）仪器 1. PCR仪 2. 台式离心机 3. 微量取液器 4. 紫外荧光观测仪 5. 高压灭菌的微量离心管 6. DNA扩增系统 7. 琼脂糖凝胶电泳系统
（二）材料 模板DNA : 800bp的片段插入在pEASY-T1 载体（或pMD18-T或KS载体) （三）试剂 1. 10×PCR buffer 2. dNTPs ： 2.5mM ×4 3. Taq 酶： 5U/µ L 4. 引物1和2 (M13F, M13R) ： 2μmol/L
在紫外观测仪上观察电泳结果； 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml离 心管中，放入4 ℃ （-20℃）冷冻保存， 以备以后的实验用。
附：引物设计原则
① 寡核苷酸引物长度一般为15—30bp. ② G+C含量 G+C含量一般在40%-60%。 ③ 碱基的随机分布： 引物中碱基的分布最好 是随机分布的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的 存在。 ④ 引物自身：引物自身不应存在互补序列， 否则引物自身折叠成发夹结构或引物本身 复性。这种二级结构会因空间位阻而影响 引物与模板的复性结合。
pMD18-T Vector
四、实验步骤
1. 在0.2ml Eppendorf管内配制25μl反应体系： ddH2O： 18.25µ (25-6.75) ×7 l 10×PCR buffer： 2.5µ l×7 dNTPs（2.5mM×4） 2µl ×7 M13-F(10µ M)： 0.5µ ×7 l M13-R(10µM)： 0.5µ ×7 l Taq 酶： 0.25ul ×7 模板： 1µ /每管 l 注：做一管阴性对照，即模板为灭菌的双蒸水
注意事项
① PCR反应是在一个在没有DNA污染的干净环 境中进行。 ② 一般而言，只要能够得到可靠的结果，模板 纯化的方法越简单越好。 ③ 要使用新配制的或适当贮存的未使用过的试 剂或缓冲液来提取核酸，不要使用以前用于 别的样品的试剂。 ④ 所用的所有溶液都应该没有核酸和核酸酶的 污染。配制试剂，操作样品，建立反应和以 后的检测扩增产物过程中最好都使用手套。 ⑤ 所有PCR试剂中使用的水都应该用新鲜蒸馏 的去离子水，高压灭菌后分装备用。