临床PCR检验标本的采集处理存及核酸提取方法共64页文档
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PCR实验室临床标本的采集、运送、接收程序
PCR实验室临床标本的采集、运送、接收程序1．目的：规范临床待检标本的正确采集、送检和处理。
2．适用范围：分子诊断室的所有临床检测标本。
3．负责人：操作人：4．程序：4．1 标本的采集4．1．1 标本由临床各科室接受过临床基因扩增检测有关标本采集、保存、运输知识培训的医护人员采集并送至实验室。
4．1．2标本采集要求a）血液标本：用2ml真空采集管或1.5ml高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在2小时内送达实验室（HCV采用EDTA 抗凝的血浆）。
离心（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的1.5ml的离心管中，编号。
b）痰标本：用带盖的无菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰标本送检。
（对于无痰或少痰的患者，可用45℃加温的100g/L NaCl 水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出；对于小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本。
）标本在室温下保存不能超过24小时。
c）生殖道拭子：尿道或阴道分泌物由医生用专用取样拭子（灭菌，一次性）采集样本，及时送检。
采集生殖道拭子标本，要求男性病人在采样前2小时内不能排尿，采样时，将棉拭子伸入男性尿道及女性宫颈口2～3cm，转动一周以获得上皮细胞。
d）尿液：由病人自留尿液于无菌封闭的杯中送检。
e）脑脊液和胸腹水：由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。
注意：所有上述用于临床标本采集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌和密封。
4．2 标本的运送标本采集后，密闭、标（贴）姓名，应尽可能快的送至检测实验室，如运送时间需2小时以上，必须用冰盒送至实验室。
标本中如加入了适当的稳定剂，如用于RNA测定加入4mol/L异硫氰酸胍盐（GITC）的血清（浆）标本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄。
4．5 接收4．5．1严格对各类样本的查对和双签制度，对病房各样本及时进行验收，查对，不符合要求的样本一律退回，并有书面记录。
临床基因扩增检验标本的处理保存和核酸提取方法及质量控制
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否 临床PCR检验操作中最易出问题的环节
.
3
分析前质量控制
——标本采集、转运、预处理、储存等
.
4
标本采集、运送和保存
早 特别是对用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本
快 标本应尽快送检，不能及时检测的标本放入低温容器内送检。短时
间可低温保存，冻存的标本忌反复冻融
.
21
核酸的分离纯化
核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核 酸扩增的物质去除。
经典方法 硅吸附法 对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用
前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。
.
22
DNA提取的经典方法
即所谓的”酚-
氯仿提取法”
.
23
RNA提取的独特性
临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具有强 烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温,不易失活 。
近 标本应尽量取自病变部位或接近病变部位
多 净
标本的量不能太少 避免污染标本
.
5
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备 标本的类型和采集量 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染
.
6
标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室 。
样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加 入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA 抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。
自动化 高效提取，高通量，一体化
.
20
一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理
靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各 种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物,则靶 核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果 上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在于细胞外。
.
3
分析前质量控制
——标本采集、转运、预处理、储存等
.
4
标本采集、运送和保存
早 特别是对用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本
快 标本应尽快送检，不能及时检测的标本放入低温容器内送检。短时
间可低温保存，冻存的标本忌反复冻融
.
21
核酸的分离纯化
核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核 酸扩增的物质去除。
经典方法 硅吸附法 对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用
前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。
.
22
DNA提取的经典方法
即所谓的”酚-
氯仿提取法”
.
23
RNA提取的独特性
临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具有强 烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温,不易失活 。
近 标本应尽量取自病变部位或接近病变部位
多 净
标本的量不能太少 避免污染标本
.
5
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备 标本的类型和采集量 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染
.
6
标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室 。
样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加 入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA 抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。
自动化 高效提取，高通量，一体化
.
20
一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理
靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各 种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物,则靶 核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果 上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在于细胞外。
PCR核酸检测样本采集、送检、处理流程学习资料
PCR核酸检测样本采集、送检、处理流
程学习资料
一、样本采集
* 样本采集前需洗手并佩戴口罩、手套等个人防护用品。
* 使用无菌棉签或吸管采集鼻腔或咽喉部分泌物样本。
对于深
部呼吸道样本，采用支气管肺泡灌洗液或痰液。
* 确保样本采集工具和无污染，且采集过程要避免空气污染。
* 将采集的样本及时放入适当的中，并密闭保存。
二、样本送检
* 样本采集完毕后，尽快送往PCR实验室进行检测。
* 在运输中需遵循安全规定，确保样本不泄漏、不变质。
* 样本上需标注采集时间、日期等信息，确保溯源和易于处理。
三、样本处理
* 样本到达实验室后，应尽快进行处理，以保持样本的可靠性。
* 样本处理前，检查样本是否完整，并对样本进行初步质检，
确保样本质量可靠。
* 样本处理过程中要确保操作环境无菌、无污染。
* 根据PCR实验方案，提取样本中的核酸。
* 根据真实样本的情况，可以进行一定的前处理，如样本离心、去除杂质等。
四、流程总结
PCR核酸检测的样本采集、送检、处理流程是一个关键的环节，对结果的准确性和可靠性具有重要影响。
在每个操作环节中都要严
格遵守操作规程，确保样本的采集、送检和处理过程都符合相关要求。
这样才能有效预防污染，提高检测水平。
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清 脂质和沉淀用750ul裂解液重悬 重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌 煮沸5min，离心14000rpm，3min 650ul上清转移到另一离心管中，等体积异 丙醇沉淀
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA
的相互作用，使得靶DNA不能与DNA 聚合酶相互作用
使用煮沸作为标本处理方法或使用
PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反 应的抑制
去除或减轻抑制的一些方法
NaOH处理可中和临床标本中的Taq
DNA聚合酶抑制剂，但这种方法 不适用于DNA含量低的标本，因 为NaOH处理可使DNA大量丢失。
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清 脂质和沉淀用750ul裂解液重悬 重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌 煮沸5min，离心14000rpm，3min 650ul上清转移到另一离心管中，等体积异 丙醇沉淀
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA
的相互作用，使得靶DNA不能与DNA 聚合酶相互作用
使用煮沸作为标本处理方法或使用
PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反 应的抑制
去除或减轻抑制的一些方法
NaOH处理可中和临床标本中的Taq
DNA聚合酶抑制剂，但这种方法 不适用于DNA含量低的标本，因 为NaOH处理可使DNA大量丢失。
临床基因扩增检验标本的采集、处理、保存和核酸提取方法
体液
• 体液标本包括胸水、腹水、脑脊液、
尿液等，可按水样标本的方式离心 处理。 • 沉淀标本的 保存-70 ̊C 。
组织
• 组织有新鲜组织块和石蜡切片。 • 新鲜组织块的处理，首先用生理盐水
洗2次，将组织研碎，加入生理盐水震 荡混匀，离心，取沉淀，用蛋白酶K消 化后，提取核酸。新鲜组织可保存于 50% 50 %乙醇中。 • 石蜡组织切片，需先用辛烷或二甲苯 脱蜡，蛋白酶K消化后，提取核酸。
标本的运送
• 原则 原则：标本采集后必须尽快送至实验室。 ：标本采集后必须尽快送至实验室。 • 需要转送的标本 需要转送的标本： ：用于RNA检测的标本，如果未
经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。 • 经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄 运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及 用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本，通 常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。
二、标本的前处理
• 标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测
成败的关键性步骤。 • 通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去 除不完全所致，抑制物可能来源于标本本 身（如血红素及其前体或降解产物）或核 酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯 仿等），这些物质对其后的Taq酶扩增反应 步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核 酸的扩增测定。
RNA提取常用方法
• 经典方法：胍盐提取结合酚-氯仿
抽提。 • 商品化试剂盒。
三、靶核酸提取质量
• 纯化靶核酸的完整性：使用凝胶
电泳将样品的核酸提取物与核酸 marker比较
三、靶核酸提取质量
• 靶核酸的浓度：可在A260读数测定, • DNA浓度可按以下公式计算：
[DNA]=(A260 [DNA]=(A 260)*( )*(0 0.05μg/μl) *稀释倍数
PCR实验室临床标本的处理核酸纯化程序
PCR实验室临床标本的处理核酸纯化程序
1. 目的：规范临床标本的核酸提取、纯化等处理过程。
2．范围：进行PCR检测的临床标本。
3．职责：保证检测过程中，被检核酸不被破坏或损失。
4．程序：
4.1 血清标本的DNA获取：
4.1.1 取待测样本血清100μl，分别加到0.5ml离心管中；
4.1.2 加入50μl样本处理液，振荡混匀后，放入加热变性仪中，96℃处理10分钟。
4.1.2 取出离心管，12,000g离心10min，保留上清备用（如长期保存置于-20℃）。
4.2 血清标本的DNA/RNA的获取：
4.2.1 取50µl待测血清，加入含吸附剂的离心管中；
4.2.2 每5分钟振摇一次，室温放置20分钟，10000转/分离心15秒钟；
4.2.3 弃上清，加入140µl洗涤液，混悬，10000转/分离心15秒钟，尽量吸去上清；4.2.4 沉淀用140µl重复洗涤液混悬，10000转/分离心15秒钟，尽量吸去上清；
4.2.5 沉淀用30µl核酸洗脱液混悬，94℃加热5分钟，10000转/分离心15秒钟；
4.2.6 保留上清(注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请立即进行后续步骤)。
4.3 分泌物标本、痰液的DNA获取：
4.3.1 将分泌物（1ml）、尿液和培养液（400μl）加入1ml 离心管中，12000g离心5分钟；痰液需用1mol/l的NaOH 液化处理后再离心。
4.3.2 向沉淀中加入50μl样本处理液，振荡混匀后，放入加热变性仪中，96℃处理10分钟；
4.3.3 取出离心管，12,000g离心10min，保留上清备用（如长期保存置于-20℃）。
临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法共59页
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
45、法律的制定是为了保证每一个人 自由发 挥自己 的才能 ，而不 是为了 束缚他 的才能 。—— 罗伯斯 庇尔
Hale Waihona Puke 56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
45、法律的制定是为了保证每一个人 自由发 挥自己 的才能 ，而不 是为了 束缚他 的才能 。—— 罗伯斯 庇尔
Hale Waihona Puke 56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
临床标本的采集、验收、保存及核酸的提取
石蜡切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脱蜡， 再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取。
三、核酸的提取方法
待测标本中的核酸是PCR反应的模板，由 于PCR具有高度的特异性和敏感性,一些样本简 单到不需要任何处理即可用于PCR。但大多数 情况下还需对样本进行适当的处理，其目的为： 1）纯化样本中的核酸，除去杂质，2）使待扩 增的靶序列暴露及核酸模板得到浓缩3）有利于 评价扩增体系的灵感度。
3、RNA的提取
异硫氰胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取RNA方法。
（1）试剂 1) 裂解液：4mol /L GuSCN,25mmol /L柠檬酸钠 pH7.0,0.5% Sarkosyl,100mmol /Lβ-巯基乙醇 2) 饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1） 3mol /LNaAc pH5.2 3) 无水乙醇 4) 75%乙醇 5) DEPC处理的无菌去离子水 6) RNasin（RNA酶抑制剂）
经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管， 离心管等基本上无RNase，可以不经预处理直接 用于制备和储存RNA。实验室用的普通玻璃器皿 经常有RNase污染，使用前必须于180℃干烤8小 时以上，或用1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液 浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。 DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于 37℃下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并 于100℃干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。 上述处理可除去器皿上痕量的DEPC以防DEPC通过 羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
对于全血标本制备单个核细胞主要有两个途 径：1）使用淋巴细胞分离液分离。2）使用红细 胞裂解液,裂解红细胞后经生理盐水洗涤可得单 个核细胞,单个核细胞如不提取核酸可保存于70℃以下。
三、核酸的提取方法
待测标本中的核酸是PCR反应的模板，由 于PCR具有高度的特异性和敏感性,一些样本简 单到不需要任何处理即可用于PCR。但大多数 情况下还需对样本进行适当的处理，其目的为： 1）纯化样本中的核酸，除去杂质，2）使待扩 增的靶序列暴露及核酸模板得到浓缩3）有利于 评价扩增体系的灵感度。
3、RNA的提取
异硫氰胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取RNA方法。
（1）试剂 1) 裂解液：4mol /L GuSCN,25mmol /L柠檬酸钠 pH7.0,0.5% Sarkosyl,100mmol /Lβ-巯基乙醇 2) 饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1） 3mol /LNaAc pH5.2 3) 无水乙醇 4) 75%乙醇 5) DEPC处理的无菌去离子水 6) RNasin（RNA酶抑制剂）
经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管， 离心管等基本上无RNase，可以不经预处理直接 用于制备和储存RNA。实验室用的普通玻璃器皿 经常有RNase污染，使用前必须于180℃干烤8小 时以上，或用1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液 浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。 DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于 37℃下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并 于100℃干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。 上述处理可除去器皿上痕量的DEPC以防DEPC通过 羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
对于全血标本制备单个核细胞主要有两个途 径：1）使用淋巴细胞分离液分离。2）使用红细 胞裂解液,裂解红细胞后经生理盐水洗涤可得单 个核细胞,单个核细胞如不提取核酸可保存于70℃以下。
临床样本的采集运输和保存及核酸提取课件
3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤
沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后
使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤
4. 核酸的鉴定
浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定
浓度鉴定
DNA：
1）紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度
酚 抽 提 法 提 取 步 骤：
DNA酚抽提法示意图
主要试剂的作用：
EDTA：1. 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2. 降低细胞膜的稳定性
SDS的作用： 1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂 2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸
释放出来 3. 对RNA、DNA酶有抑制作用 4. 与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物，
2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发 出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析（1-5ng）
EB与DNA的结合
纯度鉴定
紫外分光光度法：
在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA A260与A280之比 应在1.80 (1.60~1.80)，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高 于此值表明有RNA的残留量
研究背景
样本的采集、处理 样本的保存 样本的运输 DNA的提取 RNA的提取
研究背景
一、样本的采集、处 理、保存及运输
临床标本的正确采集、运送、保存 的重要性
临床检验的质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一
（一）、样本的采集
地贫检测样品采集： 外周血: ≥5mL 脐带血: 0.5~1mL 羊 水：20～30mL 绒 毛：≥15mg 唾 液 组 织