酶工程原理(由德林主编)思维导图

辅酶中与酶蛋白共价结合的辅酶又称为辅基。 辅基和酶蛋白结合紧密，不能通过透析或超滤等方法将其除去，在反应中不能离开酶蛋白，如FAD、 FMN、生物素等。
酶的活性中心是酶分子中执行其催化功能的部位
必需基团：酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。 酶活性中心：指必需基团在结构空间上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合 并将底物转化为产物。 活性中心内的必需基团：结合基团（与底物相结合），催化基团（催化底物转变成产物 ） 活性中心外的必需基团：位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间结构和（或）作为调节剂的 结合部位所必需。
酶
酶的分子结构与功能
酶的不同形式： 单体酶：仅具有三级结构的酶 寡聚酶：由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶 多酶体系：由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。 多功能酶：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶 称为多功能酶。
酶的分子组成中常含有辅助因子
酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称 为酶—底物结合的契合作用。
邻近效应与定向排列使诸底物正确定位于酶的活性中心
这种邻近效应实际上是将分子间的反应变成类似分子内的反应，从而提高反应速率。
表面效应使底物分子去溶剂化
酶的活性分子中心多是酶分子内部的疏水“口袋”，酶反应在此疏水环境中进行，使底物分子 脱溶剂化，排除周围大量水分子对酶底和底物分子中功能基团的干扰性吸引和排斥，防止水 化膜的形成，利于底物与酶分子的密切接触和结合。这种现象称为表面效应。
酶和某些疾病的治疗关系密切
酶在医学上的应用领域广泛 酶作为试剂用于临床检验和科学研究 酶法分析是以酶作为工具对化合物和酶活性进行定量分析的一种方法 酶标记测定法是酶学与免疫学相结合的一种测定方法 工具酶广泛地应用于分子克隆领域

连接酶 ligases
占总酶比例% 26 27
24 12 5 6
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利用率% 65 25
5 ~5 ~1 ~1
国际系统命名法
❖ 系统名称包括底物名称、构型、反应性 质，最后加一个酶（-ase）字。
酶的系统编号：EC1.1.1.1
❖ 例如：
❖ 习惯名称:谷丙转氨酶
❖ 系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移 酶
理想的提取和分离纯化方法：在提高酶的比 活的同时，要求酶回收率高，提取步骤少、 工艺简单，成本低。
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策略：
①酶产品的质量要求
设定目标：（用途：医用、食品级、工业级或 研究级） 目标酶蛋白与主要杂质的性质
②提取过程的设计应尽可能防止酶的损失， 减少处理步骤。
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③提取方法的经济性和可分析性
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3.透析 透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或塞璐玢 等制成。使用时可做成透析管、透析袋或透析槽 等形式。 优点：设备简单，操作简便。 缺点：时间长，若不更换水或缓冲液时，只扩 散到膜内外平衡为止。透析结束时，透析袋内的 保留液体积较大，浓度较低。 透析主要用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子 的分离纯化，从中除去小分子物质。透析在酶纯 化过程中极为常用，通过透析可以除去酶液中的 盐类、有机溶剂、低相对分子质量的抑制剂等。
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酶工程是现代生物技术的重要组成部分。
以微生物或酶为催化剂进行物质转化的 工业生物技术，大规模生产人类所需的化 学品、医药、能源和材料等，是解决人类 目前面临的资源、能源及环境危机的有效 手段。
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酶工程一般工艺流程示意图
胞外酶 胞内酶 菌种→基因改造→发酵→发酵酶液（→预处理→细胞 分离→细胞破壁→碎片分离→）提取→精制→酶制剂 及其改造

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降低杂质含量：通过优化分离纯化 技术，降低杂质含量，提高酶的纯 度
提高酶的稳定性：通过优化分离纯 化技术，提高酶的稳定性，延长酶 的保存时间
酶的生产与制备技 术
酶的生产方式
微生物发酵法：通过微生 物发酵产生酶
植物提取法：从植物中提 取酶
动物提取法：从动物中提 取酶
化学合成法：通过化学合 成产生酶
基因工程法：通过基因工 程产生酶
酶固定化技术：将酶固定 在载体上，提高酶的稳定 性和活性
酶的固定化技术
固定化酶的定义：将酶固定在载体上，使其保持活性并可重复使用的技 术 固定化酶的优点：提高酶的稳定性、可重复使用、降低成本
固定化酶的种类：吸附法、交联法、共价结合法等
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温度：酶的活性随温 度升高而增加，但超 过一定温度会失活
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pH值：酶的活性随 pH值变化而变化， 通常存在最适pH值
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离子强度：高离子强 度可能影响酶的活性， 导致酶失活
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酶浓度：酶的活性随 酶浓度增加而增加， 但超过一定浓度后不 再增加
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底物浓度：底物浓度 对酶的活性有影响， 通常存在最适底物浓 度
生物能源：用于生物燃料、 生物发电等领域
生物材料：用于生物材料合 成、生物材料改性等领域
酶的分类与性质
酶的分类
按照酶的来源分类： 动物酶、植物酶、 微生物酶
按照酶的催化反应 类型分类：氧化还 原酶、水解酶、转 移酶、裂解酶、异 构酶、连接酶
按照酶的活性中心 分类：金属酶、非 金属酶
按照酶的催化反应 机制分类：单酶、 多酶、复合酶
酶在食品加工中 的应用：酶在食 品加工中主要用 于提高食品品质 和营养价值，如 酶在食品发酵、 食品加工、食品 保鲜等方面的应 用。

捕获法
用于血清中IgM类抗病原体抗体，测定特异性抗体亚型，类风湿因子
原理：先用抗人IgM（抗人μ链抗体）包被固相载体，以捕获标本中所有IgM，洗涤去除未结合物，加入已知抗原与相对应 的待测IgM结合形成免疫复合物，再加入针对已知抗原的酶标抗体，形成抗人IgM抗体-IgM-抗原-酶标抗体复合物
自动化酶联免疫分析系统
多任务，多通道，平行过程处理
用于小分子抗原或半抗原的测定，属于竞争性结合分析模式
酶放大免疫测定（EMIT）
原理：半抗原与酶结合形成酶标半抗原，保留半抗原与酶的生物活性，当酶标半抗原与抗体结合后，半抗原分子上的酶蛋白与 抗体密切接触，导致酶的活性受到抑制
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫测定
待测标本中半抗原浓度低，与抗体结合的酶标半抗原的比例就高，游离酶标半抗原少，反应显色就越浅，即显色的深浅与样本中待测半抗原的浓度呈正相关。
同一张膜条可以检测多种抗体，检测自身抗体谱
斑点酶免疫吸附实验（dot-ELISA）
实质上是双抗体夹心法
用于单个B细胞分泌抗体的功能检测，从单细胞水平检测细胞分泌的细胞因子或抗体 包被单克隆抗体，成正比
酶联免疫斑点实验
每一个斑点代表一个分泌细胞因子的细胞，PPD（结核菌素）、CEF（T细胞表位肽）
应用于抗原组分及免疫活性测定，艾滋病感染确诊
双抗原夹心法
原理
方法类型与原理
间接法
测抗体，也可以测抗原（少见）
通用性强，但易出现假阳性，时间长，针对免疫球蛋白分子同种型抗原表位，一种酶标二抗检测同一种属中各种与抗 原相对应的抗体，非竞争性结合试验。
原理：先将定量的特异性抗体包被在固相载体表面，待测抗原与定量的酶标抗原竞争性结合固相抗体，结合于固相 的酶标抗原量与待测抗原浓度呈负相关

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b. 共价催化
亲电试剂：一种试剂具有强烈亲和电子 的原子中心。
亲核试剂：就是一种试剂具有强烈供给 电子的原子中心。
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c. 邻近效应及定向效应
所谓邻近效应就是底物的反应基团与酶的催 化基团越靠近，其反应速度越快。
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d. 变形或张力
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e. 酶的活性中心为疏水区域
酶的活性中心为酶分子的凹穴 此处常为非极性或疏水性的氨基酸残基
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5．异构酶(Isomerase)
此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子 异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反 异构等
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6．连接酶（合成酶）(Ligase or Synthetase)
这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸 腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅 助因子。分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、C-S键 （与脂肪酸合成有关）、C-C键和磷酸酯键。
专一性
活性部位
必需基团
催化基团 催化性质
维持酶的空间结构
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三．酶的作用机制
1． 酶的作用过程 2． 酶与底物的结合模型 3 ．酶的催化作用
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1． 酶的作用过程
酶的活性部位：
是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个 酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽中可能相隔很 远的氨基酸残基形成的三维实体。
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1．氧化还原酶 2．转移酶 3．水解酶 4．裂合酶 5．异构酶 6．连接酶（合成酶） 7．核酸酶（催化核酸）
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1．氧化还原酶 (Oxidoreductase)
包括脱氢酶(Dehydrogenase) 、氧化酶 (Oxidase) 、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素 氧化酶等

除了以上3种酶的纯化方法以外，还有利用分子大小不同以纯化酶 的凝胶过滤法和超离心法、利用不同蛋白质分子在某一pH环境中荷 电性质不同而建立的离子交换法、以及利用酶具有和底物或竞争性 抑制剂结合的功能而建立的亲和层析法等。以上这些方法在酶的分 离纯化上已逐渐得到广泛的应用。
从生物体的细胞或组织中提取出来的酶，能不能直接用于催化化学 反应呢？
现代酶工程范围大致包括酶的生产（包括微生物酶的发酵和提取以及 从动植物中提取酶的技术）、酶的固定化技术、酶的化学修饰、酶动力学 研究、酶反应器的设计和应用、酶在医学、工业、农业、食品等方面的应 用等内容。
1、 酶工程的概念：
“酶工程”是指酶制剂在工业上的大规模生产及应用。将酶所具有 的生物催化功能，借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术。
(3)固定化酶，是将酶分子通过吸附、交联、包埋及共价键结合束缚于某 种特定支持物上而发挥酶的作用，具有能反复使用、产物易纯化、可用 微电脑控制，实行自动化连续化生产等优点。
(4)人工合成酶，是根据酶的催化原理，模拟酶的催化功能，用化学方法 合成具有专一性的催化剂。
生物酶工程：
生物酶工程是在化学酶工程基础上发展起来的，是以 酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的 产物。因此它亦可称为高级酶工程(advanced enzyme engineering)。
例：利用酶相对分子质量的大小进行分离纯化的过程
首先，通过透析的方法，使提取液中的酶和其他蛋白质分子与提 取液中的各种小分子物质分离开来；
其次，通过高速离心使酶和其他蛋白质分子沉降。在高速离心的情 况下，酶和其他蛋白质分子虽然都会发生沉降，但是沉降的速度因 各自相对分子质量的不同而不同。利用这一原理就可以达到分离纯 化酶的目的。具体做法是，取一只离心试管，管内注入具有连续浓 度梯度的蔗糖溶液(试管上部溶液的浓度低，下部溶液的浓度高)。在 蔗糖溶液的表层，小心地滴上含有酶和其他蛋白质的待分离纯化的 液体通过高速离心后，酶和其他蛋白质就会沿着浓度梯度形成各自 的区带，每个区带中只含有一种酶或一种蛋白质； 将离心试管的底部钻一个小孔，使管内的溶液分段流出；这样就可 以将各区带的溶液分开，通过结晶和干燥等方法获得所需要的那种 酶； 也可以将整个离心试管进行冷冻，然后通过切割获得含有所需酶的 那个区带，进而通过结晶和干燥等方法获得那种酶。

类蛋白质(少数为RNA)或其复合体，是生物催化剂。
例如：由胰腺分泌的胰蛋白酶（肽链内切酶），它能把多肽链中赖氨
酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。
O
NH2
…－(CH2)4－CH－C－NH－(CH2)4－CH－COOH
赖氨酸残基
O －C－OH H－NH－
- H2OOLeabharlann NHONH
O
－C－NH－
…N H
HN
N H
CH2OP (CHOH)4
CHO
医学PPT
7
⑶水解酶类
水解酶类用于催化底物发生水解反应，水解酶在生物体内担负降解的 作用。水解酶类是当前应用最广泛的一种重要酶。
例如：淀粉的水解 (C6H10O5)n + nH2O 淀粉酶
淀粉
nC6H12O6
葡萄糖
又如：蛋白质在蛋白酶的催化下水解
蛋白酶
蛋白质
水解
蛋白酶
COOH C＝O CH2 -COOH
医学PPT
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2.酶的命名
酶的命名方法有系统命名法和习惯命名法两种。系统命名法是根据 国际生物化学联合会酶学委员会的命名规则进行的命名；习惯命名法常 根据底物名称和反应类型进行命名。
⑴系统命名 国际酶学委员会规定，酶的名称包括两部分。即： 酶的系统名称 分类编号（4个数字） 酶的系统名称应包括底物名称、反应类型；若有两种底物，将其名
COOH 谷丙转氨酶 (CH2)2 +
HCNH2
COOH
C＝O
COOH
COOH
谷氨酸 丙酮酸
α-酮戊二酸
CH3 HCNH2
COOH
丙氨酸
又如：葡萄糖在己糖激酶的催化下，被活化为6-磷酸葡萄糖，使底物 分子上的高能磷酸基团转移到 ADP 分子上。

酶工程第章酶的结构和功能
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动力学分析法
各基团的pK值有一理论值，但由于微环境 的影响，实测的pK值往往与理论值有偏差，导 致分析基团种类的困难，这时需要用其他方法辅 助分析，如测该基团的解离热函△H，或加有机 溶剂，改变溶液的电导率，作pH依存关系实验， 从pK的变化来协助推断基团种类。
酶工程第章酶的结构和功能
对化学修饰实验得出的结论应非常慎重，因为 可能被修饰的基团位于活性中心以外的附近，由于 空间位阻使得底物无法进入活性中心，从而表现出 酶失去活性。活性中心往往有多个与底物结合的基 团，修饰其中的一个往往不能使酶失去活性，可能 导致结合力减弱，也可能改变被结合底物的专一性。
酶工程第章酶的结构和功能
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质膜上分离出了IAA受体蛋白。
酶工程第章酶的结构和功能
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某些常用的修饰剂
酶工程第章酶的结构和功能
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鉴别化学修饰剂是否已经 引入酶活性中心的标准
a．酶活性的丧失程度与修饰的程度成正比。 b．底物或可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用。
酶工程第章酶的结构和功能
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分析化学修饰结果时 应注意的问题
酶工程第章酶的结构和功能
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羧肽酶A活性中心 的结构示意图
酶工程第章酶的结构和功能
return
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二、酶活性中心化学基团 的鉴定
常用的方法有:
化学修饰法 反应动力学法 x-光晶体衍射法
酶工程第章酶的结构和功能
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1.化学修饰法
酶分子中有许多氨基酸残基的侧链基团可 以被化学修饰，如羟基、巯基、咪唑基、氨基、 羧基等。如果一个基团是必需的，则被修饰后 酶活性会大大下降，甚至完全失活。
酶工程第章酶的结构和功能

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Buchner兄弟的试验：
用细砂研磨酵母细胞，压取汁液，汁液 不含活细胞，但仍能使糖发酵生成酒精和二 氧化碳。 证明：发酵与细胞的活动无关。
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The Nobel Prize in Chemistry 1907
"for his biochemical researches and his discovery of cell-free
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生物催化剂发展的工业展望
Competitive Imperative
Speed to Market
Current Chemical Varieties
2-5 years
Current Biocatalyst
s
10 years
Biocatalyst of the Future
2-3 years
Cost to Manufacture
机结合而产生的边缘交叉科学。
• 应用主要集中于食品工业、工业和医药工业等领 域。
• 酶工程是生物技术的重要组成部分。
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二、酶工程相关概念
生物工程(Bioengineering)又称生物技术 或生物工艺学(Biotechnology). 20世纪70 年代发展起来的一门新的综合性技术学科。 综合运用生物学、化学和工程学技术，改造 物种、创造新物种，改造生物体中的某些组 分(如酶、蛋白质、核酸、细胞器)，利用生物 体的某些特殊机能(如酶的催化功能、抗体 的免疫功能等) 为工农业生产以及医疗卫生 服务。
that enzymes
virus proteins in a pure form"
can be
crystallized"
James Batcheller Sumner