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第三章 细胞生物学研究方法学时文稿演示

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第三章-细胞生物学研究方法【可编辑的PPT文档】

第三章-细胞生物学研究方法【可编辑的PPT文档】
制备程序：
取材 固定 脱水 浸透 包埋 切片 染色 观察
取材与固定
常用的固定剂：醛类固定剂、四氧化锇等
单一固定剂不能固定细胞内所有组分，常 需联合使用不同固定剂。常采用戊二醛和 四氧化锇双重固定。
戊二醛：是一种化学交联剂，渗透速率较四氧化锇快， 不但能固定蛋白，还能固定糖类特别是糖原。 一般用戊二醛进行前固定。但对大多数脂类 的固定作用不强，样品仅用戊二醛固定后， 其反差不好，最好再用四氧化锇进行后固定。
3、激光共焦扫描显微镜技术
（Laser Scanning Confocal Microscopy）
原理
物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点，彼此互相共 聚焦。激光束（光源）经双色镜反射后，通过物 镜汇聚到样品某一焦点。从焦点发射的荧光（样
品一般经免疫荧光标 记）经透镜汇聚成像， 被检测器检出。通过 样品其他部位的激光 即激光发出的荧光不 会聚焦成像，因而检 测器不能检出。
电磁透镜
要求真空 利用样品对电子的
（1.33x10-5～ 散射和透射形成明 1.33x10-3Pa） 暗反差
（3）透射电镜主要制样样本内部超微结构。
电子束穿透力很弱，很难通过细胞、组织切片， 样品须先制备超薄切片。
超薄切片厚度：50～100nm
家蚕细小病毒负染色电镜照片(病毒直径20nm) （陈立华、翟中和）
制备过程简单，只需将样品制成悬液， 直接滴于载网上，然后用重金属物质染 液染色。即可在EM下观察。
重金属物质散射电子的能力较样品本身 强，电镜下两者显示出明显的明暗对比， 样品呈亮色，而其周围的背景将呈暗色， 这样样品表面的微细结构就被衬托出来。
常用染色液:醋酸双氧铀和铅染液
电镜观察
大鼠骨髓干细胞的超薄切片 （引自G.M.Wright et al）

第三章细胞生物学研究方法演示文稿

第三章细胞生物学研究方法演示文稿
用专门的切片机切割包埋块，制备成薄切片。适用于光 学显微镜观察的切片厚度为 l-10μm。
第三十页，共89页。
第三十一页，共89页。
染色(staining)
大多数细胞总重量的70%是水，对可见光几乎是透明的 ，只有很少的内含物不透光。染色的目的就是给细胞的 不同组分带上可区别的颜色特征。
19世纪初，发现某些有机染料可染生物组织，并对细胞 特殊部位的着色具有选择性。如苏木精对负电荷分子 有亲和性，能显示出细胞内核酸的分布；酸性染料 如伊红可使细胞质染色；苏丹染料在脂肪中的溶解度比 在乙醇中大，所以苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪 着色。但对许多染料的特异性染色机理尚不清楚。
扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope )
第三页，共89页。
一、光学显微镜技术（light microscopy)
最早的光学显微镜是1590年Janssen和他的侄子共同研 制的。其后，Robert Hooke和Leeuwenhoek对光学显微
镜的分辨本领进行了极大的改进，由此发现了细胞。
第二十一页，共89页。
第二十二页，共89页。
相差显微镜的光学 部件及光线通路
第二十三页，共89页。
相差显微镜观察的活细胞
倒置显微镜
倒置显微镜的结构组成与普通显微镜一样，所不同的 只是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来。
前者置于载物台之下，而后者在载物台的上方。集光 器与载物台之间的工作距离提高。
负染原理：又称阴性反差染色，借助染色剂的衬 托，增加背景对电子的散射，使样品相对地透过 较多的电子，最后在荧光屏上形成暗背景下的“ 亮像”。
第四十六页，共89页。
第四十七页，共89页。
●冰冻断裂复型和冰

细胞生物学 第3章 细胞生物学研究方法 图文

细胞生物学 第3章 细胞生物学研究方法 图文

3、分辨极限与放大率
显微镜的最大分辨率即是它的分辨极限。 最终成像的大小与原物体大小的比值称为 放大率（magnification）。 总放大率=物镜的放大率*目镜放大率
放大率受分辨极限的限制。一般，光学显 微镜的最大放大率只能是数值孔镜（N.A.） 的1000倍。
二、光学显微镜学放大系统：由物镜和目镜组成，由 玻璃透镜组构成；在物镜上方装有4个棱 镜，使物镜的光线平分为两路到达目镜 *机械和支架系统：保证光学系统的准确 配制和灵活调控
out of phase partially cancel each other and
produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased.
7、微分干涉显微镜
（differential-interference microscope）
聚光镜中央有挡光片，使照明光线不 直接进入物镜，只允许被标本反射和衍 射的光线进入物镜，因而视野的背景是 黑的，物体的边缘是亮的。
能观察 4-200nm的微粒子，分辨率 可比普通显微镜高50倍。
4、荧光显微镜
是对能发荧光的物质进行定性和定量 研究的工具。
细胞中有些物质如叶绿素等，受紫外 线照射后可发荧光；
α射线
电子束
0.1 10 Kv Kv
波 长 450-
(nm)
760
13~39 0
0.05~1 3
0.005~1
0.123
0.012 2
2、最大分辨率
R值越小，分辨率越高，即需要λ尽可能
地小，和N.A.尽可能大。
可见光中以蓝光波长最短， λ=450nm；
目前最好的玻璃透镜的α=70 ˚ ， sin α =0.94; 空气的折射率n≈1； 所以光镜的最大分辨率： R=450/1*0.94=292nm=0.3μm

第三章细胞生物学研究方法1(2)

第三章细胞生物学研究方法1(2)
对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样 品干燥后，样品凹陷A处铺了一薄层重金属盐，B 而 凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果， 分辨力可达1.5nm左右。
冰冻蚀刻技术（Freeze etching） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白 质颗粒和膜表面结构。
膜质双分子 层的疏水断
碳 铂
快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching）
最大特点：可以观察未经染色的标本和活细胞。 基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅
差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构 变得清晰可见。
相差显微镜与普通光学显微镜不同之处： 1.环形光阑(annular diaphragm):位于光源与聚光器之 间。 作用:使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。 2.相位板(annular phaseplate):在物镜中加涂有氟化镁 的相位板，将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
利用样品对电子的散 射和透射形成明暗反
差
2.电镜与光镜光路图比较
3.电子显微镜的基本结构
Figure : Early images of cells. (A) Drawings of a living plant cell (a hair cell from a Tradescantia flower), observed dividing into two daughter cells over a period of 2.5 hours by Eduard Strasburger in 1880. (B) A comparable living cell photographed recently through a modern light microscope. (B, courtesy of Peter Hepler.)

第三章细胞生物学研究方法精品PPT课件

第三章细胞生物学研究方法精品PPT课件
（1.33x10-5～ 散射和透射形成明 1.33x10-3Pa） 暗反差
（3）透射电镜主要制样技术
1）超薄切片技术 用 于 透 射 电 镜 （ TEM） 观 察样本内部超微结构。
电子束穿透力很弱，很难通过细胞、组织切 片，样品须先制备超薄切片。
超薄切片厚度：50～100nm 制备程序：
取材 固定 脱水 浸透 包埋 切片 染色 观察
第三章 细胞生物 学研究方法
本章学习要求
概要了解细胞生物学常用研究方 法，包括细胞形态结构观察方法、细胞组 分分析方法、细胞培养方法、细胞工程与 显微操作技术等。
本章主要教学内容
细胞形态结构观察方法 细胞组分分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操
作技术
第一节 细胞形态结构的观察方法
一、光学显微镜技术（light microscopy)
载网上一般包被一层支持膜，以支撑 载网上的超薄切片，增加其稳定性。 最常用的支持膜是Formvar(聚乙烯甲 醛)、火棉胶、碳等。
染色与观察
生物样品多数是由碳、氢、氧、氮等元素组 成的，这些元素的原子序数低，散射电子的 能力不强，在电镜下的反差非常弱，因此通 常需用高分子量的金属盐来对超薄切片进行 染色，由于细胞的不同结构对金属盐的亲和 力不同，因此染色后不同结构对电子的散射 能力亦不同，从而增强了细胞结构的反差。
3、激光共焦扫描显微镜技术
（Laser Scanning Confocal Microscopy）
原理
物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点，彼此互相共 聚焦。激光束（光源）经双色镜反射后，通过物 镜汇聚到样品某一焦点。从焦点发射的荧光（样 品一般经免疫荧光标 记）经透镜汇聚成像， 被检测器检出。通过 样品其他部位的激光 即激光发出的荧光不 会聚焦成像，因而检 测器不能检出。

第三章、细胞生物学研究方法(下).pptx

第三章、细胞生物学研究方法(下).pptx
和新城鸡瘟病毒 ）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理 方法（电击和激光）。
2、单克隆抗体技术
•B淋巴细胞能分泌特异抗体，但不能长期培养， 瘤细胞可以在体外长期培养，但不分泌特异抗 体。于是Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂 交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔 奖。
单克隆抗体技术
。2020年11月6日星期五下午2时38分38秒14:38:3820.11.6 15、会当凌绝顶，一览众山小。2020年11月下午2时38分20.11.614:38November 6, 2020 16、如果一个人不知道他要驶向哪头，那么任何风都不是顺风。2020年11月6日星期五2时38分38秒14:38:386 November 2020 17、一个人如果不到最高峰，他就没有片刻的安宁，他也就不会感到生命的恬静和光荣。下午2时38分38秒下午2时38分14:38:3820.11.6
• 细胞株（cell strain）：从培养细胞中筛选出的具 有特定性质或标志的细胞群。
原代培养(primary culture)
传代
传代培养(secondary culture)
成功ell strain）
表三、实验室中常用的几种细胞系
细胞系名称
3T3 HeLa BHK21 PtKl
（二）植物细胞培养
1. 单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体 植株。
2. 原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：
– ①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA； – ②便于进行细胞融合，形成杂交细胞； – ③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
二、细胞工程
1、细胞融合 2、单克隆抗体 3、显微操作
THE END
谢谢观看

细胞生物学研究方法 (2)


（八）荧光漂白恢复技术
教学ppt
4
（一）普通光学显微镜
Olympus显微镜的结构图
1、构成
①照明系统：光源
②光学放大系统：
物镜、目镜、聚光器和
光阑
③机械装置：镜筒、
物镜转换器、镜臂镜座、
载物台、调焦螺旋
教学ppt
5
2、原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一
步放大成像。
光学显微镜的放大原理和光路图
教学ppt
Explain results
Devise conclusion
教学ppt
2
Outline
第一节 形态学研究方法 一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术 三、扫描隧道显微镜技术
第二节 细胞组分的分析方法 一、细胞组分的分离 二、细胞组分的化学染色 三、放射自显影技术 四、显微分光光度技术
第三节 细胞培养及细胞工程 一、动物细胞的分离及培养 二、植物细胞的培养 三、细胞工程 （一）细胞融合与细胞杂交技术 （二）单克隆抗体技术 （三）细胞显微技术
第四节 模式生物
五、分子杂交技术
六、流式细胞技术
七、免疫学方法对细胞组分的分析
教学ppt
3
第一节 形态学研究方法
一、光学显微镜技术
（一）普通光学显微镜及其标本的制备
（二）荧光显微镜及其应用
（三）扫描激光共聚焦显微镜及其应用
（四）相差显微镜
（五）暗视场显微镜
（六）微分干涉显微镜
（七）荧光能量共振转移技术
4.绿色荧光蛋白
教学ppt
18
教学ppt
19
教学ppt
20
图示： 鼠主动脉平滑肌
的荧光染色。 核:blue 线粒体:green 肌动蛋白:red

细胞生物学研究方法(4)演示课件


的立体图像信息。
2020/10/10
14
高尔基体透射电镜图（伪彩色）
既然有了电子显微镜，还需要光学显微镜吗？？
2020/10/10
15
1.3 扫描隧道显微镜
2020/10/10
• 根据隧道效应而设计， 是一种探测微观世界物 质表面形貌的仪器。分 辨率能达到0.1nm(原 子尺度)，非破坏性测 量，纳米生物学。
2020/10/10
2
第一节 细胞形态结构的观察方法
• 工欲善其事，必先利其器。显微镜之 于生物学，犹如望远镜之于天文学。
2020/10/10
3
2020/10/10
1.1 光学显微镜
最短的可见光波长是450nm， 此时分辨率约为0.3um，若在油 镜下，N可提高到1.5，分辨率 可达到0.2um。这个数值就是显 微水平和亚显微水平的分界线。
第三章 细胞生物学研 究方法
弥志伟
联系方式：13426231444
zhiweimi@
2020/10/10
1
第三章 细胞生物学研究方法
第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞及其组分的分析方法 第三节 细胞培养与细胞工程 第四节 细胞及生物大分子的动态变化 第五节 模式生物与功能基因组的研究
提高分辨率的手段有缩短光线 波长，应用特殊的光学效应， 增强反差。
4
两束光波之间的相互干涉
2020/10/10
5
不同显微镜下观察体外培养的成纤维细胞
A、普通光学显微镜 B、相差显微镜 C、微分干涉显微镜
增强样品的反差，实现了对非染色活细胞的观察
2020/10/10
6
荧光显微镜技术
• 细胞中有些物质，如叶绿素 等，受紫外线照射后可发荧
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激光共焦扫描显微系统(Confocal System)
利用光切片技术显示的花粉内部结构 Pine Tree pollen - collected on a Bio-Rad MRC 1024 at Purdue University Cytometry Laboratories
质壁分离后转基因烟草单细胞的激光共聚焦显微镜观察
Confocal Microscopy） 相差显微镜（phase-contrast microscope）（自习）
普通复式光学显微镜技术
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离
普通光学显微镜
各种显微镜的分辨率梯度
荧光显微镜技术 （Fluorescence Microscopy）
原理
荧光显微镜技术 （Fluorescence Microscopy）
应用
直接荧光标记技术 间接荧光标记技术(免疫荧光标记技术) 用于特异蛋白质等生物大分子的定性
定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用
应用：绿色荧光蛋白
激光共焦扫描显微镜技术 （Laser Scanning Confocal Microscopy）
原理： 应用：
排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)， 通过“光切片”观察样品内部结构，可 重构样品的三维结构。
扫描电镜
原理与应用： 电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电 子，探测器收集二次电子成象。
CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题
三、 扫描遂道显微镜
Scanning Tunneling Microscope,STM 80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器。
反映出样品表面形貌信息Байду номын сангаас电特性或磁特性等。 特点：
分辨率高： 侧分辨率：分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.001nm
不受介质限制 非破坏性
用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样 本表面的结构，观察生物大分子、膜、病毒等的结构。
第二节 细胞组分的分析方法
1. 离心分离技术 2. 特异蛋白抗原的定位与定性 3. 细胞内特异核酸的定位与定性 4. 放射自显影技术
一、 离心分离技术
用途：分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离
差速离心
密度梯度离心
常用的介质： 蔗糖、氯化铯、甘油等。
二、特异蛋白抗原的定位与定性
免疫荧光技术 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限
免疫电镜技术 免疫胶体金技术
第一节 细胞形态结构的观察方法 1 光学显微镜技术（light microscopy）
2 电子显微镜技术 (Electro microscopy)
3 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope )
一、光学显微镜技术（light microscopy)
普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning
1.33x10-3Pa
电子显微镜的基本构造
电子束照明系统、成像系统、真空系统、记录系统
二、 电子显微镜技术
电子显微镜的基本知识
电镜与光镜的比较 电子显微镜的基本构造
主要电镜制样技术
负染色技术 冰冻蚀刻技术 超薄切片技术 电镜三维重构技术
主要电镜制样技术
超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 细胞超微结构
（同位素标记或荧光素标记的探针）
电镜水平的原位杂交技术
（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）
四、放射自显影技术
原理及应用： 利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大 分子进行定性、定位与半定量研究； 实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研 究。
应用：能对蛋白进行精细定位。如通过对分泌蛋白的定位，可以 确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架
蛋白的定位等。 蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应(Western-Blot)
免疫荧光技术图片示例
免疫胶体金技术原理与图片示例
三、细胞内特异核酸的定位与定性
光镜水平的原位杂交技术
超薄切片技术
固定
包埋
切片
染色
超薄切片技术图片示例
冷冻蚀刻
二、 电子显微镜技术
电子显微镜的基本知识
电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造
主要电镜制样技术
负染色技术 冰冻蚀刻技术 超薄切片技术 电镜三维重构技术 扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）
负染色技术（Negative staining） 染色背景，衬托出样品的精细结构，如病毒、核糖体等结构。
冷冻蚀刻技术（Freeze etching） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构。
电镜三维重构技术 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology） 主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。
第三章 细胞生物学研究方法学时文稿演示
Drosophila melanogaster
Caenorhabditis elegans
Arabidopsis thaliana
第三章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
细胞膜
细胞壁
细胞膜
细胞壁
细胞膜
细胞核 细胞核
细胞壁
细胞核 细胞核
细胞核 细胞膜 细胞壁
细胞膜
1为转GFP基因的烟草单细胞；2为转SCaM1-GFP融合基因的 烟草单细胞；3为转SCaM4-GFP融合基因的烟草单细胞。
二、 电子显微镜技术
电子显微镜的基本知识
电镜与光镜的比较 电子显微镜的基本构造
电镜与光镜的比较
显微镜 分辨本领 光源
透镜
真空
成像原理
LM 200nm 可见光 玻璃透镜 不要求真空 利用样品对光的吸收形
（400-700）
成明暗反差和颜色变化
100nm
紫外光 （约
玻璃透镜 不要求真空
200nm)
EM
0.1nm 电子束
电磁透镜 要求真空 利用样品对电子的散射
（0.01-0.9）
1.33x10-5～ 和透射形成明暗反差