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细胞色素C评价心肌细胞凋亡的研究进展杨泽栋【摘要】细胞色素C(Cyt C)是呼吸链的电子载体,线粒体释放的Cyt C不仅进入细胞质诱导凋亡,而且也由凋亡细胞释放到细胞外.缺氧、缺血可致心肌细胞线粒体中Cyt C大量释放导致心肌细胞凋亡,心肌细胞凋亡加重时,Cyt C胞质表达增多,抑制心肌细胞凋亡时Cyt C胞质表达也同时减少.血清Cyt C含量的变化可以反映心肌细胞凋亡程度的改变.%Cytochrome C( Cyt C )is the electron carrier of the respiratory chain,Cyt C not only enters cytoplasm to induce apoptosis, but is also released from apoptotic cells extracellularly. Ischemia and hypoxia can cause mitochondrias of myocardial cells to release numerous Cyt C, which induces cell apoptosis. The more cells died, the more Cyt C expressed, when suppressed cell apoptosis, the expressd Cyt C is parallel decreased. The level of Cyt C can reflect the degree of apoptosis of myocardial cell.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2012(018)003【总页数】4页(P341-344)【关键词】细胞色素C;心肌细胞凋亡;研究进展【作者】杨泽栋【作者单位】内蒙古医学院第三附属医院心内科,内蒙古,包头,014010【正文语种】中文【中图分类】R541.4;R543.3急性心肌梗死是严重危害人类生命健康的常见病，急性心肌梗死后心肌细胞凋亡存在时间长，可引起左心室扩张、心率衰竭等严重不良事件［1］。
细胞生物学中的药物筛选与评价方法研究细胞生物学是研究细胞结构、功能和生物过程的学科，而药物筛选与评价方法是指在细胞水平上对药物进行筛选和评价的方法。
这些方法在药物研发和临床应用中起着至关重要的作用。
本文将介绍几种常用的细胞生物学中的药物筛选与评价方法。
1. 细胞存活率测定法细胞存活率测定法是一种常用的药物筛选与评价方法。
该方法通过评估细胞在药物处理后的存活率来判断药物对细胞的毒性和抗细胞增殖活性。
常见的细胞存活率测定方法包括MTT、CCK-8、LDH释放等。
MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法是通过测定细胞内活性代谢产物的形成来评估细胞存活率的。
MTT是一种黄色草酮类化合物，可以被活细胞内的NAD(P)H依赖的还原酶酶活（如线粒体呼吸链复合物）还原为紫色的结晶物。
通过把MTT溶液添加到细胞培养板中，待细胞生长一段时间后，通过加入一定的溶解剂来溶解结晶物，最后用分光光度计测定溶液的吸光度来评估细胞存活率。
CCK-8（cell counting kit-8）法是一种类似于MTT法的细胞存活率测定方法。
CCK-8是MTT法的改进版，它具有更高的灵敏度和更好的线性关系。
该方法也是通过测定细胞内的活性代谢产物（如细胞色素c）来评估细胞存活率的。
LDH（lactate dehydrogenase）释放法是一种衡量细胞毒性的常用方法。
LDH是存在于细胞质中的酶，只有在细胞膜破裂释放到培养液中时才会被检测到。
通过测量培养液中的LDH含量，可以评估细胞膜完整性的损害程度和细胞的存活率。
2. 细胞凋亡检测法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，与多种疾病的发生和药物治疗效果密切相关。
因此，在药物筛选与评价中，细胞凋亡的检测方法也是不可或缺的。
常见的细胞凋亡检测方法包括TUNEL、Annexin V-FITC/PI、DNA Ladder等。
细胞培养过程中常见的变异问题分析与解决方法细胞培养作为生物学研究中重要的实验手段之一，被广泛应用于细胞生物学、生物医学研究和药物研发等领域。
然而，在细胞培养过程中，常常会遇到各种变异问题，如细胞形态改变、生长速度减慢以及细胞死亡等等。
本文旨在分析这些常见的变异问题，并提供相应的解决方法。
一、细胞形态改变细胞形态的改变是细胞培养过程中较为常见的变异问题之一。
通常，细胞形态的异常变化可能包括细胞变大或变小、细胞伸长或收缩等。
这些变异往往会导致细胞功能和代谢活性的改变，从而影响实验结果的准确性。
解决方法：1. 检查培养条件：首先，应对培养基质及培养液的pH值、温度、含氧量等因素进行仔细的调控与监测，以确保细胞处于适宜的生长状态。
2. 检测浓度：根据细胞系的特性，调整培养基中添加物的浓度，如血清、酶消化液等，以维持适当的细胞形态。
3. 鉴别混杂：定期进行细胞株的鉴别，避免因细胞混杂导致形态异常。
二、生长速度减慢细胞在培养过程中，如果出现生长速度减慢的情况，可能会严重影响实验进展与结果的获取。
细胞生长速度的减慢可能是由多种因素引起的，如细胞老化、细胞密度过高、培养液中营养物质不足等。
解决方法：1. 细胞分离：及时将细胞进行适当的分离，避免细胞在培养中过度堆积，从而影响生长速度。
2. 营养补充：调整培养基中的营养物质浓度，确保细胞处于良好的生长环境中，并加强对细胞的营养补充。
3. 细胞凋亡检测：定期检测和评估细胞凋亡的情况，如有需要，可采取相应的干预措施，以保证细胞群体的健康状态。
三、细胞死亡细胞死亡是细胞培养过程中常见的变异问题之一，其发生率可能由多种因素决定，如感染、细胞凋亡、培养条件不良等。
细胞死亡不仅会影响细胞培养的连续性，也会对实验结果的可重复性产生不良影响。
解决方法：1. 检测感染：对培养基进行微生物污染检测，避免细菌、真菌等微生物的感染，导致细胞死亡。
2. 调整培养条件：对培养条件进行优化，如温度、培养基组分等，保证细胞处于最适宜的生长状态。
化妆品中的抗衰老效果评价方法研究随着人们对美容和抗衰老的需求不断增加，化妆品市场中涌现出大量标榜抗衰老功效的产品。
然而，如何准确评价化妆品中的抗衰老效果成为一个关键问题。
本文将探讨化妆品中抗衰老效果的评价方法，并提出一种基于细胞与动物实验相结合的综合评估模式。
一、细胞实验评价方法在化妆品研发过程中，细胞实验是最常用的评价方法之一。
通过细胞实验，可以评估化妆品对皮肤细胞的影响，进而判断其抗衰老效果。
常用的细胞实验评价方法包括细胞增殖实验、细胞凋亡实验和细胞酶活性实验。
1. 细胞增殖实验细胞增殖实验可以评估化妆品对细胞增殖的影响，从而判断其是否能促进皮肤细胞的再生和修复能力。
实验中，可以选择常用的细胞系，如人类皮肤成纤维细胞（HDFs）或人类表皮角质形成细胞（HaCaT），将其培养在含有不同浓度化妆品的培养基中，通过细胞计数或细胞活性试剂盒等方法，测定细胞的增殖情况，从而判断化妆品的抗衰老效果。
2. 细胞凋亡实验细胞凋亡是一种正常的细胞自我调节机制，但过度的细胞凋亡会导致皮肤老化。
因此，通过细胞凋亡实验可以评价化妆品对凋亡的影响，判断其是否能有效减缓皮肤衰老进程。
实验中，可以利用流式细胞术或DNA断裂实验等方法，测定细胞凋亡率，进而评估化妆品的抗衰老效果。
3. 细胞酶活性实验细胞酶活性实验用于评估化妆品对细胞内重要酶活性的影响，如超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
这些酶在抗氧化过程中起着重要的作用，因此，通过测定酶活性，可以间接评估化妆品的抗衰老能力。
二、动物实验评价方法尽管细胞实验可以提供重要的信息，但动物实验仍然是评估化妆品抗衰老效果的重要手段之一。
动物实验可以更接近真实情况，考虑到整个皮肤系统的复杂性。
常用的动物实验评价方法包括小鼠模型、豚鼠模型和猪模型等。
1. 小鼠模型小鼠是最常用的动物模型之一，可以通过给小鼠灌胃或者外用化妆品等方式，评估其对皮肤的影响，并通过检测皮肤厚度、弹性、含水量、皱纹深度等指标，来评估化妆品的抗衰老效果。
细胞水平评价流程
细胞水平评价是一种广泛应用于生物医学研究的重要实验方法,用于评估药物、化学物质或其他因素对细胞的影响。
通常包括以下几个步骤:
1. 细胞培养
- 选择合适的细胞系或原代细胞
- 维持细胞在适当的培养条件下生长
2. 细胞处理
- 准备需要评估的药物、化合物或其他处理条件
- 将细胞暴露于不同浓度或时间的处理条件
3. 细胞活性测定
- 使用适当的检测方法评估细胞活性或增殖情况,如MTT、CCK-8、BrdU等
- 收集并分析数据,确定半数有效浓度(EC50)或半数抑制浓度(IC50)
4. 细胞凋亡检测
- 使用流式细胞术、TUNEL等方法检测细胞凋亡水平
- 分析数据,评估处理条件对细胞凋亡的影响
5. 细胞周期分析
- 通过PI或BrdU染色等方法检测细胞周期分布
- 分析数据,确定处理条件是否导致细胞周期阻滞
6. 其他细胞功能分析
- 根据需要进行细胞迁移、侵袭、分化等功能评估
- 采用划痕实验、Transwell小室、免疫荧光染色等方法
7. 数据分析与解释
- 使用适当的统计方法分析实验数据
- 绘制曲线图、柱状图等,直观展示结果
- 解释结果,评估处理条件对细胞的影响
细胞水平评价为研究药物、化合物或其他因素的生物学效应提供了有力支持,结果能够反映细胞增殖、存活、凋亡、周期及其他功能方面的变化,为进一步的动物实验和临床试验提供重要依据。
一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、 ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。
二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法）， Hoechst33342/PI 双染色法流式细胞仪检测， AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等。
不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI 单染色法流式细胞仪检测等。
三、样品来源不同选择组织：主要用形态学方法 (HE 染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA 或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳 ) 。
四、细胞凋亡检测1、早期检测 :1)PS(磷脂酰丝氨酸 ) 在细胞外膜上的检测2)细胞内氧化还原状态改变的检测3)细胞色素 C 的定位检测4)线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测：细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。
对于晚期检测通常有以下方法：1)TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记 )2)LM-PCRLadder ( 连接介导的 PCR检测 )3)Telemerase Detection ( 端粒酶检测 )3、生化检测：1）典型的生化特征：DNA片段化2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等3） TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）4）通过 DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为 dUTP）间接或直接接到DNA片段的 3’ -OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。
可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。
4、 LM-PCRLadder ( 连接介导的PCR检测 )当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核 DNA的变化。
TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结3. TUNEL实验中几个关键步骤是什么？4. 如何减弱非特异性染色？5. 细胞通透的时间如何选择？6. 内源性过氧化物酶的封闭时间和封闭液的浓度如何确定？7. TUNEL反应混合液的孵育时间可以调整吗？8. DAB的显色时间和条件如何把握？9. 首次做TUNEL实验的注意事项？10. PBS浸洗在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？ 11. 脱蜡和水化在TUNEL法中的作用和方法分别是什么？针对问题3（TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：1. 充分脱蜡和水化。
脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀； 2. 把握好细胞通透的时间。
一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3. 适当延长TUNEL反应液的时间。
一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。
4. DAB显色条件的选择。
一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。
5.PBS的充分清洗。
我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。
对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。
针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
细胞凋亡和生长因子的调控和机制研究随着现代医学技术的不断发展，人类对于一些疾病的治疗方法也越来越高效和精准。
而细胞凋亡和生长因子作为目前最为热门的研究领域之一，其调控和机制研究将会为人类的健康事业带来巨大的进步。
一、细胞凋亡的调控机制细胞凋亡，也称细胞自杀，是一种自然而然的程序性细胞死亡现象，是较为重要的重大生物学过程之一。
细胞凋亡的调控机制目前还在不断研究中，主要包括外源性、内源性以及程序本身这三个方面。
外源性调控机制主要是指通过一些外在因素来刺激细胞产生凋亡反应。
常见的刺激因素包括放射线、毒素、化学药物、热休克等。
通过这些因素对细胞的刺激，能够引起细胞凋亡的发生。
内源性调控机制则是指细胞在自身内部某些因素的作用下，产生了凋亡反应。
这些因素包括病毒感染、细胞DNA损伤、细胞膜受损以及无法修复的细胞器损伤等，这些因素产生的累积效应会导致细胞凋亡的发生。
细胞程序本身，也就是指细胞凋亡过程中，必然存在某些分子程序在调控着细胞凋亡的进行。
例如细胞凋亡中的caspase家族以及凋亡信号转导途径等，这些程序的存在是细胞凋亡能够进行的重要保证。
二、生长因子的调控机制生长因子是一类由细胞自身产生并在体内参与调控和维持体内各种功能的蛋白质分子。
在生物体内，生长因子不仅能够调控细胞的生存、增殖、分化、分裂等功能，而且在某些情况下还能够刺激细胞分泌其它物质，从而影响整个生物个体的生理与形态发育。
生长因子的调控机制包括内源性调控和外源性调控。
内源性调控是指生长因子产生于细胞内部，并在细胞内部对细胞本身进行自身的调控。
例如内源性生长因子家族分化因子（diffrention factors）、转录因子（transcription factors）等，这些因子促进细胞的生长、分化等功能。
外源性调控是指环境因素刺激生长因子产生，从而调节细胞的生长。
例如外源性生长因子家族胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）等，这些生长因子在外部环境中刺激下，能够促进细胞生长、增殖等。
细胞凋亡检测方法绿谷生物网/experiment/celltech/apoptosis/2009/6612.htmlUpdate:2006-07-04From: Hot:264北京大学人类疾病基因研究中心陈英玉细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。
一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。
三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。
细胞增殖的检测方法:四甲基偶氮唑盐法(MTT)MTT 商品名为噻唑蓝, 就是一种黄色的染料。
1983 年Mosmann 建立MTT比色法,用于检测细胞存活与增殖。
其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶-甲瓒(formazan)并沉积在细胞中,而死亡的细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫分析仪测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数量范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
此方法已广泛用于各种细胞增殖的检测、肿瘤细胞的生长、生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定[4-8]等。
此方法简便、灵敏且无放射性。
MTT 溶液需要放置在4℃避光保存,最好就是现用现配。
由于MTT 经还原所产生的产物甲瓒不溶于水,无法直接测定吸光度,需要被溶解之后才能检测。
这不仅使工作量增加,而且MTT 溶液具有致癌性。
需要注意的就是,MTT 法只能用来检测细胞相对数与相对活力, 但不能测定细胞的绝对数。
另外, 有研究发现过氧化物会降低MTT 测定的准确度,抑制将近95%的MTT 与O2－的反应,MTT 溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上, 而致使检测的结果呈现假阴性。
内盐法(MTS)MTS 就是一种新型的MTT 类似物。
MTS 在偶联剂PMS 存在的条件下, 可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物, 其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关,可用酶标仪检测。
它的优点在于无放射性、快速、安全、方便、灵活及特异性强,同时又克服了MTT、XTT 的缺点。
此方法已应用于细胞增殖的检测、药物敏感性试验、细胞毒性的检测等,且比MTT 法更加准确。
此方法在一定程度上也存在缺陷。
最新研究表明在96 孔板试验中, 靠外的孔液体易蒸发,对检测结果有一定影响[24],且不适合于猪淋巴细胞促有丝分裂反应的检测、细胞粘附能力测定:蛋白染料染色法测细胞粘附本法就是以蛋白染色剂如氨基黑10B来问接测定96孔板中的细胞数目,该法迅速可靠,还可用怍细胞形态学观察与染色细胞的照像。
