细胞凋亡的研究方法的建立与评价
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细胞色素C评价心肌细胞凋亡的研究进展杨泽栋【摘要】细胞色素C(Cyt C)是呼吸链的电子载体,线粒体释放的Cyt C不仅进入细胞质诱导凋亡,而且也由凋亡细胞释放到细胞外.缺氧、缺血可致心肌细胞线粒体中Cyt C大量释放导致心肌细胞凋亡,心肌细胞凋亡加重时,Cyt C胞质表达增多,抑制心肌细胞凋亡时Cyt C胞质表达也同时减少.血清Cyt C含量的变化可以反映心肌细胞凋亡程度的改变.%Cytochrome C( Cyt C )is the electron carrier of the respiratory chain,Cyt C not only enters cytoplasm to induce apoptosis, but is also released from apoptotic cells extracellularly. Ischemia and hypoxia can cause mitochondrias of myocardial cells to release numerous Cyt C, which induces cell apoptosis. The more cells died, the more Cyt C expressed, when suppressed cell apoptosis, the expressd Cyt C is parallel decreased. The level of Cyt C can reflect the degree of apoptosis of myocardial cell.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2012(018)003【总页数】4页(P341-344)【关键词】细胞色素C;心肌细胞凋亡;研究进展【作者】杨泽栋【作者单位】内蒙古医学院第三附属医院心内科,内蒙古,包头,014010【正文语种】中文【中图分类】R541.4;R543.3急性心肌梗死是严重危害人类生命健康的常见病,急性心肌梗死后心肌细胞凋亡存在时间长,可引起左心室扩张、心率衰竭等严重不良事件[1]。
细胞生物学中的药物筛选与评价方法研究细胞生物学是研究细胞结构、功能和生物过程的学科,而药物筛选与评价方法是指在细胞水平上对药物进行筛选和评价的方法。
这些方法在药物研发和临床应用中起着至关重要的作用。
本文将介绍几种常用的细胞生物学中的药物筛选与评价方法。
1. 细胞存活率测定法细胞存活率测定法是一种常用的药物筛选与评价方法。
该方法通过评估细胞在药物处理后的存活率来判断药物对细胞的毒性和抗细胞增殖活性。
常见的细胞存活率测定方法包括MTT、CCK-8、LDH释放等。
MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)法是通过测定细胞内活性代谢产物的形成来评估细胞存活率的。
MTT是一种黄色草酮类化合物,可以被活细胞内的NAD(P)H依赖的还原酶酶活(如线粒体呼吸链复合物)还原为紫色的结晶物。
通过把MTT溶液添加到细胞培养板中,待细胞生长一段时间后,通过加入一定的溶解剂来溶解结晶物,最后用分光光度计测定溶液的吸光度来评估细胞存活率。
CCK-8(cell counting kit-8)法是一种类似于MTT法的细胞存活率测定方法。
CCK-8是MTT法的改进版,它具有更高的灵敏度和更好的线性关系。
该方法也是通过测定细胞内的活性代谢产物(如细胞色素c)来评估细胞存活率的。
LDH(lactate dehydrogenase)释放法是一种衡量细胞毒性的常用方法。
LDH是存在于细胞质中的酶,只有在细胞膜破裂释放到培养液中时才会被检测到。
通过测量培养液中的LDH含量,可以评估细胞膜完整性的损害程度和细胞的存活率。
2. 细胞凋亡检测法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,与多种疾病的发生和药物治疗效果密切相关。
因此,在药物筛选与评价中,细胞凋亡的检测方法也是不可或缺的。
常见的细胞凋亡检测方法包括TUNEL、Annexin V-FITC/PI、DNA Ladder等。
细胞培养过程中常见的变异问题分析与解决方法细胞培养作为生物学研究中重要的实验手段之一,被广泛应用于细胞生物学、生物医学研究和药物研发等领域。
然而,在细胞培养过程中,常常会遇到各种变异问题,如细胞形态改变、生长速度减慢以及细胞死亡等等。
本文旨在分析这些常见的变异问题,并提供相应的解决方法。
一、细胞形态改变细胞形态的改变是细胞培养过程中较为常见的变异问题之一。
通常,细胞形态的异常变化可能包括细胞变大或变小、细胞伸长或收缩等。
这些变异往往会导致细胞功能和代谢活性的改变,从而影响实验结果的准确性。
解决方法:1. 检查培养条件:首先,应对培养基质及培养液的pH值、温度、含氧量等因素进行仔细的调控与监测,以确保细胞处于适宜的生长状态。
2. 检测浓度:根据细胞系的特性,调整培养基中添加物的浓度,如血清、酶消化液等,以维持适当的细胞形态。
3. 鉴别混杂:定期进行细胞株的鉴别,避免因细胞混杂导致形态异常。
二、生长速度减慢细胞在培养过程中,如果出现生长速度减慢的情况,可能会严重影响实验进展与结果的获取。
细胞生长速度的减慢可能是由多种因素引起的,如细胞老化、细胞密度过高、培养液中营养物质不足等。
解决方法:1. 细胞分离:及时将细胞进行适当的分离,避免细胞在培养中过度堆积,从而影响生长速度。
2. 营养补充:调整培养基中的营养物质浓度,确保细胞处于良好的生长环境中,并加强对细胞的营养补充。
3. 细胞凋亡检测:定期检测和评估细胞凋亡的情况,如有需要,可采取相应的干预措施,以保证细胞群体的健康状态。
三、细胞死亡细胞死亡是细胞培养过程中常见的变异问题之一,其发生率可能由多种因素决定,如感染、细胞凋亡、培养条件不良等。
细胞死亡不仅会影响细胞培养的连续性,也会对实验结果的可重复性产生不良影响。
解决方法:1. 检测感染:对培养基进行微生物污染检测,避免细菌、真菌等微生物的感染,导致细胞死亡。
2. 调整培养条件:对培养条件进行优化,如温度、培养基组分等,保证细胞处于最适宜的生长状态。
化妆品中的抗衰老效果评价方法研究随着人们对美容和抗衰老的需求不断增加,化妆品市场中涌现出大量标榜抗衰老功效的产品。
然而,如何准确评价化妆品中的抗衰老效果成为一个关键问题。
本文将探讨化妆品中抗衰老效果的评价方法,并提出一种基于细胞与动物实验相结合的综合评估模式。
一、细胞实验评价方法在化妆品研发过程中,细胞实验是最常用的评价方法之一。
通过细胞实验,可以评估化妆品对皮肤细胞的影响,进而判断其抗衰老效果。
常用的细胞实验评价方法包括细胞增殖实验、细胞凋亡实验和细胞酶活性实验。
1. 细胞增殖实验细胞增殖实验可以评估化妆品对细胞增殖的影响,从而判断其是否能促进皮肤细胞的再生和修复能力。
实验中,可以选择常用的细胞系,如人类皮肤成纤维细胞(HDFs)或人类表皮角质形成细胞(HaCaT),将其培养在含有不同浓度化妆品的培养基中,通过细胞计数或细胞活性试剂盒等方法,测定细胞的增殖情况,从而判断化妆品的抗衰老效果。
2. 细胞凋亡实验细胞凋亡是一种正常的细胞自我调节机制,但过度的细胞凋亡会导致皮肤老化。
因此,通过细胞凋亡实验可以评价化妆品对凋亡的影响,判断其是否能有效减缓皮肤衰老进程。
实验中,可以利用流式细胞术或DNA断裂实验等方法,测定细胞凋亡率,进而评估化妆品的抗衰老效果。
3. 细胞酶活性实验细胞酶活性实验用于评估化妆品对细胞内重要酶活性的影响,如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等。
这些酶在抗氧化过程中起着重要的作用,因此,通过测定酶活性,可以间接评估化妆品的抗衰老能力。
二、动物实验评价方法尽管细胞实验可以提供重要的信息,但动物实验仍然是评估化妆品抗衰老效果的重要手段之一。
动物实验可以更接近真实情况,考虑到整个皮肤系统的复杂性。
常用的动物实验评价方法包括小鼠模型、豚鼠模型和猪模型等。
1. 小鼠模型小鼠是最常用的动物模型之一,可以通过给小鼠灌胃或者外用化妆品等方式,评估其对皮肤的影响,并通过检测皮肤厚度、弹性、含水量、皱纹深度等指标,来评估化妆品的抗衰老效果。
细胞水平评价流程
细胞水平评价是一种广泛应用于生物医学研究的重要实验方法,用于评估药物、化学物质或其他因素对细胞的影响。
通常包括以下几个步骤:
1. 细胞培养
- 选择合适的细胞系或原代细胞
- 维持细胞在适当的培养条件下生长
2. 细胞处理
- 准备需要评估的药物、化合物或其他处理条件
- 将细胞暴露于不同浓度或时间的处理条件
3. 细胞活性测定
- 使用适当的检测方法评估细胞活性或增殖情况,如MTT、CCK-8、BrdU等
- 收集并分析数据,确定半数有效浓度(EC50)或半数抑制浓度(IC50)
4. 细胞凋亡检测
- 使用流式细胞术、TUNEL等方法检测细胞凋亡水平
- 分析数据,评估处理条件对细胞凋亡的影响
5. 细胞周期分析
- 通过PI或BrdU染色等方法检测细胞周期分布
- 分析数据,确定处理条件是否导致细胞周期阻滞
6. 其他细胞功能分析
- 根据需要进行细胞迁移、侵袭、分化等功能评估
- 采用划痕实验、Transwell小室、免疫荧光染色等方法
7. 数据分析与解释
- 使用适当的统计方法分析实验数据
- 绘制曲线图、柱状图等,直观展示结果
- 解释结果,评估处理条件对细胞的影响
细胞水平评价为研究药物、化合物或其他因素的生物学效应提供了有力支持,结果能够反映细胞增殖、存活、凋亡、周期及其他功能方面的变化,为进一步的动物实验和临床试验提供重要依据。
一、定性和定量研究只定性的研究方法:常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察(普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜)进行定量或半定量的研究方法:各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、 ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。
二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法:琼脂糖凝胶电泳,形态学观察(透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法), Hoechst33342/PI 双染色法流式细胞仪检测, AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等。
不能将二者区分开的方法:原位末端标记法、PI 单染色法流式细胞仪检测等。
三、样品来源不同选择组织:主要用形态学方法 (HE 染色,透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记,ELISA 或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳 ) 。
四、细胞凋亡检测1、早期检测 :1)PS(磷脂酰丝氨酸 ) 在细胞外膜上的检测2)细胞内氧化还原状态改变的检测3)细胞色素 C 的定位检测4)线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测:细胞凋亡晚期中,核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。
对于晚期检测通常有以下方法:1)TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记 )2)LM-PCRLadder ( 连接介导的 PCR检测 )3)Telemerase Detection ( 端粒酶检测 )3、生化检测:1)典型的生化特征:DNA片段化2)检测方法主要有:琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记(TUNEL)等3) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)4)通过 DNA末端转移酶将带标记的dNTP (多为 dUTP)间接或直接接到DNA片段的 3’ -OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。
可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。
4、 LM-PCRLadder ( 连接介导的PCR检测 )当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少(如活体组织切片)时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核 DNA的变化。
TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结3. TUNEL实验中几个关键步骤是什么?4. 如何减弱非特异性染色?5. 细胞通透的时间如何选择?6. 内源性过氧化物酶的封闭时间和封闭液的浓度如何确定?7. TUNEL反应混合液的孵育时间可以调整吗?8. DAB的显色时间和条件如何把握?9. 首次做TUNEL实验的注意事项?10. PBS浸洗在TUNEL法中的作用和方法分别是什么? 11. 脱蜡和水化在TUNEL法中的作用和方法分别是什么?针对问题3(TUNEL实验中几个关键步骤是什么?):1. 充分脱蜡和水化。
脱蜡可以先60度20min,再用二甲苯两次5~10min;而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,这些以便后面的结合反应充分、均匀; 2. 把握好细胞通透的时间。
一般根据切片的厚薄,选择蛋白酶k的孵育时间,常用10~30min,几um切片用短时间;几十um切片用长时间,通过摸索达到既不脱片,有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3. 适当延长TUNEL反应液的时间。
一般是37度1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度,选择更长的时间,可长至2h,但要结合你最终的背景着色。
4. DAB显色条件的选择。
一般DAB反应10分钟左右,结合镜下控制背景颜色,最长不超过30min;我不喜欢用promega公司提供的DAB液(桃红色),不利于辨认棕褐色。
5.PBS的充分清洗。
我个人认为,在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格,可增加次数达5次,因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
6. 此外,内源性POD的封闭也十分关键。
对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织,我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度,可以达到很好的封闭效果,且不影响最终的特异性染色。
针对问题2( TUNEL法的实验原理是什么?):基本原理:对不同组织切片先增加细胞膜通透性,然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内,在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合,再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合(每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子),最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应,形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色,最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
细胞凋亡和生长因子的调控和机制研究随着现代医学技术的不断发展,人类对于一些疾病的治疗方法也越来越高效和精准。
而细胞凋亡和生长因子作为目前最为热门的研究领域之一,其调控和机制研究将会为人类的健康事业带来巨大的进步。
一、细胞凋亡的调控机制细胞凋亡,也称细胞自杀,是一种自然而然的程序性细胞死亡现象,是较为重要的重大生物学过程之一。
细胞凋亡的调控机制目前还在不断研究中,主要包括外源性、内源性以及程序本身这三个方面。
外源性调控机制主要是指通过一些外在因素来刺激细胞产生凋亡反应。
常见的刺激因素包括放射线、毒素、化学药物、热休克等。
通过这些因素对细胞的刺激,能够引起细胞凋亡的发生。
内源性调控机制则是指细胞在自身内部某些因素的作用下,产生了凋亡反应。
这些因素包括病毒感染、细胞DNA损伤、细胞膜受损以及无法修复的细胞器损伤等,这些因素产生的累积效应会导致细胞凋亡的发生。
细胞程序本身,也就是指细胞凋亡过程中,必然存在某些分子程序在调控着细胞凋亡的进行。
例如细胞凋亡中的caspase家族以及凋亡信号转导途径等,这些程序的存在是细胞凋亡能够进行的重要保证。
二、生长因子的调控机制生长因子是一类由细胞自身产生并在体内参与调控和维持体内各种功能的蛋白质分子。
在生物体内,生长因子不仅能够调控细胞的生存、增殖、分化、分裂等功能,而且在某些情况下还能够刺激细胞分泌其它物质,从而影响整个生物个体的生理与形态发育。
生长因子的调控机制包括内源性调控和外源性调控。
内源性调控是指生长因子产生于细胞内部,并在细胞内部对细胞本身进行自身的调控。
例如内源性生长因子家族分化因子(diffrention factors)、转录因子(transcription factors)等,这些因子促进细胞的生长、分化等功能。
外源性调控是指环境因素刺激生长因子产生,从而调节细胞的生长。
例如外源性生长因子家族胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)等,这些生长因子在外部环境中刺激下,能够促进细胞生长、增殖等。
细胞凋亡检测方法绿谷生物网/experiment/celltech/apoptosis/2009/6612.htmlUpdate:2006-07-04From: Hot:264北京大学人类疾病基因研究中心陈英玉细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式,根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别,可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多,下面介绍几种常用的测定方法。
一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜(1)未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
(2)染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。
三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。
3 透射电子显微镜观察结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。
细胞增殖的检测方法:四甲基偶氮唑盐法(MTT)MTT 商品名为噻唑蓝, 就是一种黄色的染料。
1983 年Mosmann 建立MTT比色法,用于检测细胞存活与增殖。
其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶-甲瓒(formazan)并沉积在细胞中,而死亡的细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫分析仪测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数量范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
此方法已广泛用于各种细胞增殖的检测、肿瘤细胞的生长、生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定[4-8]等。
此方法简便、灵敏且无放射性。
MTT 溶液需要放置在4℃避光保存,最好就是现用现配。
由于MTT 经还原所产生的产物甲瓒不溶于水,无法直接测定吸光度,需要被溶解之后才能检测。
这不仅使工作量增加,而且MTT 溶液具有致癌性。
需要注意的就是,MTT 法只能用来检测细胞相对数与相对活力, 但不能测定细胞的绝对数。
另外, 有研究发现过氧化物会降低MTT 测定的准确度,抑制将近95%的MTT 与O2-的反应,MTT 溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上, 而致使检测的结果呈现假阴性。
内盐法(MTS)MTS 就是一种新型的MTT 类似物。
MTS 在偶联剂PMS 存在的条件下, 可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物, 其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关,可用酶标仪检测。
它的优点在于无放射性、快速、安全、方便、灵活及特异性强,同时又克服了MTT、XTT 的缺点。
此方法已应用于细胞增殖的检测、药物敏感性试验、细胞毒性的检测等,且比MTT 法更加准确。
此方法在一定程度上也存在缺陷。
最新研究表明在96 孔板试验中, 靠外的孔液体易蒸发,对检测结果有一定影响[24],且不适合于猪淋巴细胞促有丝分裂反应的检测、细胞粘附能力测定:蛋白染料染色法测细胞粘附本法就是以蛋白染色剂如氨基黑10B来问接测定96孔板中的细胞数目,该法迅速可靠,还可用怍细胞形态学观察与染色细胞的照像。
细胞凋亡的检测技术与方法王嘉宁,郭 宁3(军事医学科学院基础医学研究所细胞免疫室,北京 100850)摘要:细胞凋亡在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。
根据死亡细胞的形态学、生物化学和分子生物学特征,可以将凋亡细胞与坏死细胞区别开来。
本文综述了常用的细胞凋亡检测技术与方法的基本原理,如形态学观察、荧光素染色、DNA 阶梯、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性的检测等,并对各种方法的优点及局限性做一简要比较。
用透射电镜进行超微结构观察仍是鉴定细胞凋亡的金标准。
在选择细胞凋亡检测方法时,要充分了解各种方法的原理和应用范围,进行综合考虑。
多种检测方法的联合应用常可获得准确的结果。
关键词:细胞凋亡;线粒体膜电位;荧光染料;流式细胞术;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶中图分类号:R965.2文献标识码:A文章编号:100023002(2005)0620466205细胞凋亡(apoptosis ),又称程序性细胞死亡,是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束生命的过程。
它是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程,在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。
细胞凋亡概念的提出引起了广大研究者的浓厚兴趣。
随着凋亡研究的不断深入,各种各样检测凋亡的新技术和新方法相继建立,其中不少检测试剂已经商品化,从而有力推动了该领域研究的进展。
1 形态学观察细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞死亡形式,根据死亡细胞的形态学、生物化学和分子生物学的特征,可以将二者区别开来。
细胞凋亡时发生独特的形态变化,如核染色质凝聚、边集,细胞膜的发泡现象及凋亡小体形成。
人们可通过光学显微镜、荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜和透射电子显微镜观察来鉴定凋亡细胞。
普通光学显微镜下可观察到贴壁生长的凋亡细胞外型皱缩、圆化,细胞的体积变小,但细胞膜完整,常可见胞膜发 来稿日期:2005205216 接受日期:2005210209 基金项目:国家高技术研究发展计划(2003AA215100) 作者简介:王嘉宁(1978-),男,山东省济宁市人,在读博士研究生,主要从事生物工程药物的研究。
摘自北京大学人类疾病基因研究中心/news/apoptosis.htm细胞凋亡的检测北京大学人类疾病基因研究中心陈英玉细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式,根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别,可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多,下面介绍几种常用的测定方法。
一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜(1)未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
(2)染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。
三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DN A的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。
3 透射电子显微镜观察结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。
凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。
细胞凋亡调控的研究方法细胞凋亡是正常细胞活动周期的一个必要步骤,同时也是细胞在遭受损伤或病理刺激时主动死亡的一种形式。
不同于坏死,凋亡具有自身调节机制,不会对周围组织造成损害和炎症反应。
因此,对于了解凋亡调控机制的研究和开发相关药物具有重要意义。
那么如何研究细胞凋亡的调控机制呢?本文将从不同角度介绍一些常用的方法。
一、细胞学方法1. 细胞培养细胞培养技术是研究细胞凋亡调控的重要手段。
利用不同的培养条件、细胞系和刺激剂等,可以诱导细胞发生凋亡,并通过形态学、细胞周期分析、流式细胞术等方法对凋亡细胞的特征进行确定。
2. 细胞转染和免疫染色通过转染外源性基因或siRNA,可以研究多个关键蛋白对凋亡的影响。
另外,使用特异性抗体检测某些凋亡相关蛋白的表达和分布情况,也是研究凋亡调控的重要方法。
3. 光学显微镜光学显微镜可以观察活细胞或固定细胞的形态学变化,如细胞核的形态、色素体的形成等。
结合荧光染料或基因标记技术,可以对活体细胞动态观察凋亡过程。
二、分子生物学方法1. 蛋白质组学蛋白质质谱技术可以在全基因组水平上研究凋亡调控的分子机制。
通过比较不同状态下细胞的蛋白质组成,可以鉴定出不同表达量的蛋白质,进一步研究其生物学功能和作用机制。
2. 基因组学基因芯片技术可以同时检测数千个基因的表达情况,有助于研究不同细胞状态下凋亡相关基因的表达变化。
此外,也可以利用基因编辑技术构建凋亡相关基因的敲除或过表达模型,深入研究凋亡调控的分子机制。
3. RNA测序RNA测序是研究基因表达的高通量技术,可以检测细胞RNA的表达情况和可变剪接,深入了解凋亡调控的生物学过程和机制。
三、生化方法1. 蛋白质结构研究通过蛋白质结晶、核磁共振等技术研究凋亡相关蛋白的结构,有助于了解蛋白质功能和相互作用机制,为开发凋亡抑制剂提供理论基础。
2. 酶活性分析研究凋亡相关蛋白的酶活性和酶学特性有助于了解生化反应的机制和途径,为开发相关药物提供实验依据。
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。
然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180~200bp 核小体DNA多聚体。
DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色。
低分子量的DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译(nick translation),使低分子量的DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞。
TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
一、过氧化物酶标记测定法原理:脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗地高辛抗体结合。
在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察。
毛地黄植物是地高辛的唯一来源。
第28卷第6期Vol.28,No.6滨州学院学报Journal of Binzhou University2012年12月Dec.,2012细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术收稿日期:2012-04-28第一作者简介:卢建美(1986—),女,山东滨州人,硕士,主要从事生物化学与分子生物学研究,E-mail:water.1860@yahoo.com.cn.卢建美,赵云峰(曲阜师范大学生命科学学院,山东曲阜273165) 摘 要:目前普遍认为细胞的死亡途径有细胞凋亡、细胞坏死及自噬3种,其中细胞凋亡一直是医学界为治疗癌症而不懈努力研究的方向,而自噬是近几年研究的热点.现对这3种死亡方式及其各自的检测方法作一简要概述. 关键词:凋亡;坏死;自噬;检测方法 中图分类号:Q 255 文献标识码:A 文章编号:1673-2618(2012)06-0114-071 凋亡、坏死及自噬的概述1.1 细胞凋亡细胞凋亡现象由Kerr在1965年首次发现,并在1972年首次提出这一概念.细胞凋亡(Apopto-sis)是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程.在细胞凋亡过程中,细胞膜反折包裹断裂的染色质片段或细胞器与胞体分离,形成众多的凋亡小体,随后凋亡小体被邻近的细胞吞噬,整个过程中细胞膜保持完整,无内容物溢出,从而不会引起炎症反应.细胞凋亡同增殖一样,是维持机体细胞数量动态平衡的基本措施.在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞,保证了胚胎的正常发育;在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞,保证了机体的健康.细胞凋亡调控紊乱会导致一系列疾病的发生,如自身免疫病,阿尔茨海默病等.对细胞凋亡的研究除了有助于阐明一系列免疫病的病发机制外,还能为肿瘤治疗提供新的疗法,即重建肿瘤细胞的凋亡信号传递系统,抑制肿瘤细胞生存基因的表达,使肿瘤细胞走向凋亡,而不引起炎症反应,从而不会影响机体健康.这也正是细胞凋亡的研究如此受关注的原因.1.2 细胞坏死细胞坏死是极端的物理化学因素或严重的病理性刺激引起的细胞损伤和死亡.坏死过程中细胞器膨胀变形,染色质随机降解,细胞膜发生渗漏,导致细胞内容物释放到胞外,从而引起炎症反应.此外,未得到及时清除的凋亡细胞也会发生胞膜破裂溶解、胞浆外泄并引发炎症反应的现象,即发生继发性坏死,这在体外培养细胞及巨噬细胞发生功能障碍的机体中较为常见.细胞坏死曾被认为是偶然的不能控制的退化,但近期的研究表明,细胞坏死可能是细胞“程序性死亡”的另一种形式,具有包括引发炎症反应在内的重要生理功能.当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时,坏死作为凋亡的“替补”方式被采用.1.3 细胞自噬1962年,Ashford和Porter在人肝细胞中首次观察到自噬(autophagy)[1].自噬,即自体吞噬,是一种存在于正常细胞和病态细胞中的非选择性降解机制,是细胞内长寿蛋白降解的主要途径.它的主要作用是在应激状态下为细胞生长代谢提供必要的大分子物质和能量,并清除细胞内过剩或有缺陷的细胞器.在癌症治疗中,自噬是一把双刃剑,既能抑制肿瘤细胞的生存又能产生促生存效应,造第6期卢建美,赵云峰 细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术成治疗抵抗[2].如何调节自噬使其发挥肿瘤抑制活性,成为肿瘤治疗的新靶点,这是近几年研究的热点,所以对于自噬的检测也成了一种迫切需要.1.4 三者之间的关系细胞凋亡、坏死和自噬是3种不同的细胞死亡方式,共同维持着机体的自我平衡,在肿瘤发生发展中起重要的作用.一直以来,自噬被认为是一种细胞生存的机制,随着研究的深入,发现自噬具有双重性,首先是作为细胞的保护机制防止细胞死亡,但是当自噬达到一定水平就会促使细胞走向凋亡[3].因此自噬通常先于凋亡,进而启动凋亡.而当发生凋亡的细胞未得到及时清除时便会导致继发性坏死,出现胞膜破裂溶解、胞浆外泄并引发炎症反应的现象.研究发现其机制为caspase酶能切割与自噬有关的蛋白Beclin1、Atg5、Atg4D,导致Beclin1及Atg5失去自噬诱导活性,而发挥促凋亡作用[4].切割后的Atg4D自噬活性及促凋亡活性均增加[5].由此细胞从自噬走向凋亡.凋亡可以抑制坏死.坏死与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)导致的ATP过度消耗及其产物介导的线粒体凋亡诱导因子释放有关.凋亡时激活的caspase面每切割PARP使其失活,从而抑制ATP的过度消耗,防止坏死发生[6].王晓东等人发现了诱导细胞坏死的关键蛋白RIP3[7],并发现RIP3蛋白表达量的高低是控制细胞凋亡或细胞坏死的关键,如果RIP3表达量高,细胞则走向坏死;RIP3表达量低,细胞则走向凋亡.由此可见,三者之间的关系是比较复杂的,三者之间相互协调,共同维持机体结构及功能的稳定.2 检测方法细胞凋亡、坏死及自噬无论在生化代谢途径,还是形态学方面都有显著的区别,可以根据其各自的特点,运用一定的检测手段将其区分开来.2.1 细胞凋亡检测2.1.1 细胞凋亡的形态学检测方法凋亡细胞会发生形态学上的改变,一般认为凋亡细胞的形态学改变是判断其凋亡的基础.在光学显微镜下可以观察到凋亡细胞大体形态的改变,如贴壁生长的凋亡细胞外形皱缩、圆化,细胞的体积变小,凋亡晚期可以观察到凋亡小体.经吖啶橙或H33258染色后,在荧光显微镜下可以观察到活细胞核染色质呈现均匀分布的黄绿色或蓝色荧光,而凋亡细胞核染色质的荧光浓聚在核膜内侧,因此凋亡细胞核的特征性形态可以被清晰地辨认.在电子显微镜下可以清晰地观察到凋亡细胞超微结构的改变,如细胞表面微绒毛消失,核染色质凝聚、边缘化,细胞器集中,胞膜起泡.凋亡晚期的细胞可观察到凋亡小体或可见凋亡小体被邻近巨噬细胞吞噬的现象.激光共聚焦显微镜除用于普通形态学观察外,还可以对凋亡细胞内的大分子进行初步定位[8].实验证实10μmol/L的MMPT作用于H1792细胞48h后,倒置相差显微镜下可以观察到凋亡小体及胞膜起泡,荧光显微镜下部分细胞呈现明显的染色质凝集现象[9].此外利用荧光显微镜还可以定性地观察转染效率的高低[10].形态学观察法与其他方法相比更形象、更直观、更容易被接受.一般实验研究的首选是进行形态学检测.电镜形态学观察曾一度被认为是判断凋亡最经典、最可靠的方法,是鉴定细胞凋亡的金标准[11].然而形态学检测法也有一定的局限性,如只能定性不能定量,且在判定时存在一定的主观性.另外,扫描电镜及透射电镜的样品处理过程比较繁琐,且价格昂贵.2.1.2 凋亡细胞的DNA检测分析细胞凋亡的一个最主要特征是DNA发生核小体间的断裂,产生含有不同数量核小体单位的片段,大小为180~200bp的整数倍,在进行琼脂糖凝胶电泳时就形成了特征性的梯状条带(DNAladder).但是当凋亡细胞数量少无法直接应用琼脂糖电泳观察凋亡细胞核DNA的变化时,可以通过连接介导的PCR专一性地扩增核小体的梯形片段再进行琼脂糖电泳,从而提高检测的灵敏度.此外,对凋亡细胞DNA的检测分析还包括DNA末端标记检测:原位切口平移(ISNT)和DNA断裂的原位末端标记法(TUNEL).其原理都是将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3’羟基末端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果.酶联免疫吸附法(ELISA)也是常用的检测细胞凋亡的方法,其原理是在吸附有组蛋白抗体的微孔板上加入核小体511滨州学院学报第28卷上清液,核小体组蛋白与抗体结合,当加入过氧化物酶标记的DNA抗体后,它们与核小体上的DNA结合,并对过氧化物酶底物产生显色反应,再用酶标仪对凋亡细胞进行定量分析.罗迪贤等人证实TOFA和DNR处理的细胞经琼脂糖凝胶电泳后,其DNA出现特征性的梯状条带[12].TUNEL染色后,经电针刺处理的小鼠大脑皮层变薄并伴有局部神经元丢失[13].经ELISA法证实,随着MMPT作用时间的延长和药物浓度的增加,肺癌H1792细胞内核小体水平逐渐升高,表明凋亡细胞数逐渐增加[9].DNA检测分析与电镜检测法一样也被认为是判断细胞凋亡的金标准,但是它只能对晚期凋亡细胞进行检测.琼脂糖凝胶电泳法简单易行,但灵敏度不高,且需要的细胞数量较多.TUNEL荧光素标记法灵敏度高,且可以测定在细胞周期中DNA发生断裂的具体时相,但是不能检测只发生DNA大片段断裂的凋亡细胞,不能定量,且容易出现坏死细胞的假阳性.ELISA法不需要特殊仪器,但不能精确测定凋亡发生的绝对量.2.1.3 细胞凋亡相关基因的表达检测细胞凋亡时有些基因表达异常,这些基因的产物促进或抑制凋亡发生.因此检测这些基因的表达也成了确定细胞是否发生凋亡的手段之一.基因的表达包括转录和翻译两个过程,因此可以分别从转录水平和翻译水平进行检测.(1)相关基因转录水平的检测①RT-PCR检测凋亡相关基因的表达变化细胞发生凋亡时,细胞内如Bcl-2家族、Caspase家族成员表达异常,可以用RT-PCR对这些基因的表达进行半定量测定.首先提取细胞总RNA,并添加要检测基因及内参基因的引物,进行RT-PCR反应,随后通过琼脂糖凝胶电泳进行半定量检测[14-15].②荧光定量PCR检测细胞凋亡近年来,实时荧光定量PCR作为一种新的技术在检测基因表达水平方面得到了广泛的应用,与RT-PCR相比,其具有操作简单,反应快速,灵敏度高等优点.原理是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团.探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’端~3’端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步.步骤是提取细胞总RNA,设置反转录反应体系反转录成cDNA,取1μL cDNA,加入Taq酶等进行实时荧光定量PCR扩增,根据得到的CT值分别与其相对应的内参(一般为β-actin)的CT值相减进行校正得到校正CT值,从而相对定量计算mRNA含量[16].(2)相关基因翻译水平的检测①酶活检测凋亡有3条信号通路,每条通路都有其特征性酶,如caspase4或caspase12是内质网通路特有的酶,而caspase9为线粒体途径所特有,因此检测这些特征性的酶对于确定具体的凋亡途径具有重要的意义.对于酶活检测,可以选用特定的试剂盒,如碧云天的caspase4试剂盒,原理是caspase4能催化底物Ac-LEVD-pNA产生黄色的pNA,用分光光度计或酶标仪测pNA在405nm处的吸光度,根据标准曲线换算成酶活力单位.②Western blot检测蛋白表达Western blot又称蛋白质印迹,是一种蛋白质的固定和分析技术,现在被广泛用于检测蛋白水平的表达.将已用聚丙烯酰胺凝胶或其他凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上,固定在滤膜上的蛋白质成分保留抗原活性,第一抗体与特异性抗原决定簇结合,再用荧光标记(用同位素或非同位素)的第二抗体来检测.③免疫组化免疫组化与Western blot一样,也是利用了抗原与抗体特异性结合的免疫学原理,它通过化学反应使标记抗体的显色剂显色,以此对组织细胞内抗原其进行定位、定性及定量研究.一般要用到石蜡切片技术.经RT-PCR和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示,二甲胂酸通过调节鼠表皮细胞内Bcl-2、Bad和caspase12的mRNA水平和蛋白表达水平来诱导凋亡[17].而PCSK9siRNA通过Bcl/Bax—caspase9—caspase3途径抑制ox-LDL诱导的脐静611第6期卢建美,赵云峰 细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术脉内皮细胞凋亡[18].通过检测细胞内特定基因的表达变化可以明确细胞的凋亡途径.荧光定量PCR与Northern杂交相比更快更准确,能显著提高检测的特异性和灵敏度,同时,它要求操作也必须非常精确.Western blot检测法灵敏度高,但是只能做半定量分析,且部分药品毒性较大.2.1.4 凋亡细胞的流式细胞仪检测流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置,是现代高科技多学科高度发展、综合的结晶,是目前定量测定细胞凋亡的重要方法之一.细胞凋亡时的许多特征性变化都可以用流式细胞仪检测出来.(1)磷脂酰丝氨酸外翻检测用荧光素FITC标记的Annexin V进行磷脂酰丝氨酸外翻检测.Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与磷脂酰丝氨酸特异性结合.正常细胞的磷脂酰丝氨酸位于细胞膜内侧,荧光素FITC标记的Annexin V不能与PS结合.而凋亡早期,细胞的磷脂酰丝氨酸外翻到细胞膜表面,从而能与Annexin V特异性结合.坏死细胞由于胞膜不完整,Annexin V也可以与PS结合.为了将凋亡与坏死区分开来,一般采用Annexin V与PI双染.PI是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,因此可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来.即正常活细胞为Annexin-/PI-均低染;凋亡细胞Annexin+高染、PI-低染;继发性坏死细胞Annexin+/PI+均高染.(2)凋亡细胞的DNA检测PI虽不能透过完整的细胞膜,但经打孔后可以进入细胞插入到DNA碱基对之间,用流式细胞仪检测掺入的PI荧光强度,即为DNA含量.细胞凋亡时,DNA发生断裂,膜通透性升高,一部分小分子DNA可透出细胞外,使细胞内DNA含量低于正常细胞,故在正常的G0/G1峰前常有一亚二倍体峰出现[19],即为凋亡峰(AP峰).根据亚二倍体峰的高低可计算出凋亡细胞百分率.(3)凋亡细胞的周期检测利用流式细胞仪还可以检测出某种药物使细胞周期阻滞于哪个时期,来确认处于什么周期的细胞更易发生凋亡.如盐霉素可以使经辐射处理的癌细胞阻滞于G2期[20],而经表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)处理的HT-1080细胞停滞于G0/G1期[21].此外,利用流式细胞仪还可以对细胞进行线粒体膜电位及细胞内氧化还原态的检测等.流式细胞仪检测显示,盐霉素能使经辐射处理的癌细胞阻滞在G2期,且能引起DNA片段化[20].通过Annexin V/PI双染显示H2O2能有效诱导树突状细胞走向凋亡,为治疗植物抗宿主病及自身免疫病等提供了新的方向[22].流式细胞仪常用作细胞凋亡的定量分析,具有简便、快速、特异性好、灵敏度高等特点,可以分别从DNA及膜分子水平进行多方位的检测.但是也存在一定的局限性,如检测中漏检率和错检率很高,周期检测时固定过程难控制等.2.2 细胞坏死检测2.2.1 形态学检测方法同凋亡一样,坏死的细胞也有其独特的形态学变化.借助显微镜可以观察到坏死细胞体积及细胞器肿胀,细胞核稀疏成网状,细胞膜破裂引起内容物外溢等现象.2.2.2 DNA检测分析细胞坏死的另一特点是染色质随机降解.因此DNA电泳条带呈弥散状,而非规则的梯状条带.2.2.3 PI染色法通常采用Annexin-V和PI双标法对凋亡细胞与坏死细胞加以鉴别.凋亡早期,磷脂酰丝氨酸外翻,但膜具有完整性,因此凋亡细胞呈Annexin-V单标阳性.坏死细胞膜不具完整性,呈Annexin-V和PI双染阳性.同凋亡不同,细胞坏死会引发周围组织发生炎症反应,不利于机体健康,因此单独研究坏死的文献较少.根据细胞坏死特征所采用的检测方法可以将细胞坏死与凋亡区分开来.2.3 细胞自噬检测2.3.1 自噬泡的观察透射电子显微镜的超微结构观察一直被认为是检测自噬的金标准[23].在透射电子显微镜下,可以观察到自噬的特征性变化即自噬泡及自噬溶酶体形成的全过程.首先在肿胀变形的细胞器周围出现双层膜空泡状结构,继而包裹待降解物质形成自噬体,随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体.711滨州学院学报第28卷透射电镜观察显示,暴露在香烟中的部分卵泡上皮细胞发生自体吞噬,细胞内形成许多清晰可见的自噬泡[24].而P53靶基因ISG20L1敲除能降低细胞自噬泡水平[25].透射电镜观察结果形象、直观,甚至可以观察到自噬的全过程,但是存在一定的主观性,且样品处理过程比较繁琐,价格昂贵.2.3.2 单丹(磺)酰戊二胺染色法单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种非特异的检测自噬体方法.MDC是自噬囊泡示踪剂,能与自噬囊泡膜上的Atg8特异性结合,因此其阳性结构可代表自噬囊泡[26],在荧光显微镜下可观察自噬囊泡的数量.顺铂作用于食管鳞状上皮细胞后,用MDC对自噬囊泡染色,结果显示实验组自噬泡数量明显高于对照组,而经自噬抑制剂3-MA诱导后,自噬泡数量照组的50%左右[27].由于MDC染色法不具有自噬特异性,且假阳性较高,因此只有当自噬效应得到了肯定后,用此方法分析效应强度才有意义.2.3.3 自噬体膜上标志性蛋白质检测微管相关蛋白1的轻链3(LC3)是目前检测自噬的唯一标志蛋白[28],定位在自噬体分隔膜上,在自噬体形成各阶段的内外膜及自噬溶酶体膜上也可见到.通过与绿色荧光蛋白(GFP)结合来示踪自噬形成.在正常细胞中,自噬特异性蛋白LC3呈低水平表达,且均匀地弥散在胞浆中,在荧光显微镜下呈现均匀的绿色荧光.而细胞发生自噬后,LC3表达增加并转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,斑点的个数用来评价自噬活性的高低[29].用Western blot法可以检测细胞内LC3的相对含量,评价自噬水平.激光共聚焦显微镜检测显示,低氧条件下内皮细胞内含LC3-GFP颗粒的自噬小体明显增多[30].Western blot检测显示顺铂作用于食管鳞状上皮细胞后,实验组Beclin 1与PIKⅢ含量明显升高,而加入自噬抑制剂3-MA诱导后能恰好抵消Bec-lin 1与PIKⅢ表达的上调,且能降低LC3-Ⅰ的含量及减少LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转变[27].Westernblot检测法特异性强,灵敏度高,但是只能做半定量分析,且部分药品毒性较大.此外还有间接自噬体检测法、吖啶橙染色法等.3 结语由于不同药物触发的细胞死亡途径有多种,而每种检测方法也都有一定的局限性,因此在研究某一药物的作用机制时可以同时采用多种检测方法.例如在测定细胞活力时可采用四唑盐比色实验,也可以采用染料排斥实验进行细胞计数绘制生长曲线.在检测细胞内凋亡蛋白caspase酶的表达时,可以用RT-PCR及荧光定量PCR半定量测定其mRNA含量,也可以采用试剂盒直接测定该酶的活性或用免疫印迹实验在翻译水平测定其蛋白表达量.在检测细胞核的凋亡变化时,可以通过吖啶橙或H33258染色对凋亡细胞核进行形态学观察,也可以通过琼脂糖凝胶电泳对DNA进行定性分析.总之药物作用机制的检测方法有很多,在实验过程中应该根据具体情况及实验目的进行筛选.细胞是一个复杂的有机体,凋亡、坏死及自噬是细胞自我调控维持机体稳定的3种形式,研究其各自的检测方法有助于为癌症及肿瘤治疗提供可靠的依据.目前对细胞的这3种调控方式已日渐明朗,检测手段也日益成熟,但是对三者之间的相互关联的分子机制还知之甚少.受刺激诱导以后,细胞又是如何特异性地选择了其中之一走向了死亡,还有待进一步研究.参 考 文 献:[1] Ashford T P,Porter K R.Cytoplasmic components in hepatic cell lysosomes[J].Cell Biology,1962,12:198-202.[2] Chen Ning,Vassiliki Karantza.Autophagy as a therapeutic target in cancer[J].Cancer Biology&Therapy,2011,11(2):157-168.[3] Vicencio J 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在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、宇文皓月二、检测细胞增殖的方法(1)直接方法:通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA特有的碱基,也是DNA合成的必须物质。
用同位素3H标识表记标帜TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程,通过测定细胞的放射性强度,可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。
但是具有放射性。
2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料,具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团,使CFSE成为一种良好的细胞标识表记标帜物。
CFSE进入细胞后可以不成逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时,CFsE标识表记标帜荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样,在一个增殖的细胞群中,各连续代细胞的荧光强度呈对递减,利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷,为胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdu单克隆抗体,ICC染色,显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标识表记标帜物,双重染色,可判断增殖细胞的种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标记检测有些抗原只存在于增殖细胞中,而非增值细胞缺乏这些抗原,您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。
例如,在人体细胞中,Ki-67抗体识别同名蛋白,在细胞周期S期、G2期和M期表达,而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。
用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。
由于需要组织切片,这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐,因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。