马铃薯茎尖脱毒培养技术研究21页PPT

马铃薯茎尖脱毒及组培快繁技术研究摘要：以下寨65和青薯168为实验对象，采用不同培养基，对马铃薯两个品种进行脱毒及组培，对培养基及关键技术措施进行了分析，结果表明：与青薯168在不同培养中生长表现不同，下寨65茎尖组织在MS中加入BA2 mg/L 的培养基中生长表现突出，而青薯168茎尖组织在MS中加入BA2 mg/L的培养基中成苗率较高。

在同等条件下，加入IAA 0.50 mg/L的培养基宜用于下寨65脱毒苗的组织快繁，加入IAA 0.30 mg/L的培养基宜用于青薯168脱毒苗的组织快繁。

关键词：马铃薯；茎尖脱毒；组织快繁我国是马铃薯生产第一大国，2008年种植面积达到573.33万hm2，鲜薯总产达8 800万t，平均单产约15.45t／hm2，总产位居世界第一[1]。

马铃薯是无性繁殖作物，体内病毒的积累可使品种种性退化、品质和产量降低，对其生产造成严重危害[2]。

因为大部分病毒不能感染马铃薯茎尖组织，通过茎尖脱毒，生产脱毒种薯用于生产是防止马铃薯退化的切实可行的措施[3]。

马铃薯脱毒及组培快繁中所用基质和培养条件等关键技术方面的报道较多，但对下寨65和青薯168报道较少，本文既通过对马铃薯下寨65和青薯168两个品种进行脱毒及组培试验研究，为西部高原地区当家品种脱毒种薯的工厂化生产提供帮助。

1材料和方法1.1供试材料采用当家品种下寨65和青薯168。

1.2试验方法1.2.1催芽于11月中旬左右，挑拣表皮光滑、正常薯形、大小均匀、无病害和无损伤薯块，放置在有供暖的房间，室内温度24 ℃左右进行催芽。

在催芽前薯块正处于休眠期，采用0.05～0.l0 mg/L的GA3来处理薯块，浸没于GA3溶液中10～20 min，以打破休眠[4]。

1.2.2种薯处理采用MS培养基，加入不同配比的激素，准备BA、NAA、GA3、IBA和IAA，由于激素在培养基中用量非常少，且不易溶于水，所以采用特殊的配置方法，配置成500 mg/L的溶液待用。

可编辑修改精选全文完整版马铃薯茎尖脱毒技术作者：刘学武方大雨关永明来源：《吉林蔬菜》2014年第03期马铃薯（Solanurn tuberosurn），茄科、茄属作物，作为一种蔬菜，深受人们的喜爱。

目前在我国的栽培面积大约有500多万公顷，已经成为世界上栽培面积最大的国家，但在其繁殖过程中退化问题比较严重，症状是叶片卷缩，产量降低，实验研究表明，病毒浸染是其退化的根源。

因此生产脱毒种薯成了在马铃薯生产过程中的关键环节，常用的马铃薯脱毒技术是茎尖组织培养，下面介绍一下马铃薯的茎尖脱毒技术。

1 取材进行脱毒培养的材料，可以直接从大田取。

一般当苗高约15厘米时，将顶端切下6～8厘米，去掉下面2片叶，在切口处涂上生根激素后，把切条植入一个口径为10厘米、内装有消毒营养土的花盆中，然后用玻璃烧杯罩上，保持10天。

然后将其转入生长箱中，光照3 000～4 000Lx，每天光照16小时。

两周后去掉顶芽，以促使腋芽的生长。

当腋芽长出约1～2厘米时，折下腋生枝，用于消毒，接种。

2 消毒及接种一般来说，茎尖分生组织由于彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，不进行表面消毒也能得到无菌的外植体，但分生组织不带菌，并不等于包在它外面的叶片及其下部的茎段不带菌，将外植体从超净台外面的空间拿进去可能会带进一些菌。

因此，在切取外植体之前仍需对茎芽进行表面消毒。

常用的消毒方法是，先剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒钟左右，用1%～3%次氯酸钠或5%～7%的漂白粉溶液消毒10～20分钟（或用0.1%HgCl2消毒数分钟），最后用无菌水冲洗材料4～5次。

接种时，先把解剖显微镜置于超净工作台，然后把茎芽置于解剖镜下，左手用一把镊子将它按住，右手用解剖针将叶片和叶原基剥掉。

当形似一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来后，用锋利的长颈刀片将分生组织切下来，一般以0.2～0.3毫米，带1～2个叶原基为好，然后再用刀片将其接种到培养基上。

收稿日期:2023-02-15基金项目:宁波市 科技创新2025 重大专项(2019B10017,2021Z106);浙江省农业新品种选育重大科技专项子课题(2021C02064-1-5);慈溪市科技局重大公益项目 马铃薯-晚稻双优主粮轮作高效栽培模式研究与示范作者简介:王芳(1981 ),女,高级农艺师,从事薯类育种与推广研究,E-mail:wangfang811028@㊂通信作者:严成其(1966 ),男,研究员,主要从事粮食作物抗病育种研究,E-mail:yanchengqi@㊂文献著录格式:王芳,鲁宇文,周金波,等.马铃薯茎尖脱毒及病毒鉴定技术研究[J].浙江农业科学,2023,64(7):1736-1739.DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.2020355马铃薯茎尖脱毒及病毒鉴定技术研究王芳1,鲁宇文2,周金波1,郑晓红3,金树权1,毕继安1,严成其1∗(1.宁波市农业科学研究院,浙江宁波㊀315051;2.农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室,浙江宁波㊀315100;3.余姚市第二职业技术学校,浙江余姚㊀315430)㊀㊀摘㊀要:为探讨利用马铃薯茎尖分生组织获得脱毒苗以及脱毒苗鉴定的方法,本实验以马铃薯茎尖分生组织为培养对象,通过外源激素分化愈伤组织形成组培苗,并用分子生物学的手段对病毒进行鉴定㊂实验中将本地小黄皮马铃薯品种的芽通过显微镜切下0.2~0.3mm 的茎尖,在基本培养基(MS)+0.5mg㊃L -16-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.1或0.5mg㊃L -1萘乙酸(NAA)培养基中进行试管苗分化培养,当分化出的试管苗培养到苗长5~10cm 时,转接到MA +6-BA 0.15mg㊃L -1+NAA 0.2mg㊃L -1培养基中进行壮苗培养,然后采用qRT-PCR 的方法对小黄皮马铃薯试管苗进行病毒检测,实验表明,在试管苗中未检测出马铃薯X 病毒(potato virus X,PVX)㊁马铃薯Y 病毒(potato virus Y,PVY)㊁马铃薯H 病毒(potato virus H,PVH)和马铃薯M 病毒(potato virus M,PVM)等,大田种植的脱毒试管苗形成试管薯后,其产量和品质明显优于对照组㊂该研究为马铃薯茎尖脱毒苗生产提供合适的培养基配方以及简易的脱毒鉴定技术,为宁波马铃薯产业的发展提供技术保障㊂关键词:马铃薯;试管苗;脱毒鉴定中图分类号:S532㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:0528-9017(2023)07-1736-04㊀㊀马铃薯是仅次于小麦和玉米的全球第四大主要粮食作物㊂中国作为最大的马铃薯生产国,全年种植面积533万hm 2,其产业化发展备受关注[1]㊂宁波地处亚热带,冬季温光资源较为丰富,马铃薯是有效利用冬闲田㊁开发冬季农业的主要品种,对发展冬季农业,实现绿色过冬,有着重要的促进作用㊂但是马铃薯作为一种无性繁殖作物,常年种植容易受到病毒的侵染㊂从而导致品种退化㊁产量下降㊁品质变差,严重影响马铃薯产业的可持续发展㊂目前已报道的侵染马铃薯的病毒及类病毒有40多种,发生率高㊁危害较大的主要有PVX㊁PVY㊁PVS㊁PVM㊁PVA㊁PVH 等[2-3]㊂因此,采用脱毒种薯是降低病毒病发生的关键技术,而利用茎尖脱毒技术建立脱毒试管苗体系是生产脱毒种薯的前提条件,为保障种薯质量,高效㊁快速㊁经济地进行脱毒苗的病毒检测必不可少㊂本研究通过对宁波本地马铃薯茎尖脱毒,繁育脱毒苗,用qRT-PCR 技术对试管苗进行病毒检测,最终建立一套脱毒及病毒检测体系,为脱毒种薯快繁以及良种良法的推进打下基础㊂1㊀材料与方法1.1㊀试验材料1.1.1㊀毒源材料㊀㊀供试品种本地小黄皮马铃薯由宁波市农业科学研究院提供㊂用血清学DAS-ELISA 方法检测,发现薯块含有PVX㊁PVY㊁PVH㊁PVM 等病毒㊂1.1.2㊀试验试剂㊀㊀培养试管苗的供试培养基为基本培养基(MS),固体培养基加琼脂,液体培养基不加琼脂,120ħ灭菌20min㊂Trizol 购自Invitrogen 公司;反转录酶购自TaKaRa 公司㊂1.2㊀试验方法1.2.1㊀试管苗的诱导㊀㊀茎尖细胞分裂的速度极快,新分裂出来的细胞不带病毒,病毒通过胞间连丝传播的速度远远慢于植物细胞分裂的速度,故分生组织往往不带病毒[3]㊂我们对本地小黄皮马铃薯进行催芽处理,当芽生长到2~3cm时,用自来水冲洗3min,然后转移至超净工作台用75%乙醇消毒处理30s,再将消毒过的芽使用0.2%HgCl2处理7~10min,接着用无菌水冲洗4~5遍㊂在解剖显微镜下切取0.2~0.3mm的小黄皮马铃薯茎尖,然后转接到不同激素浓度的MS诱导培养基上,即MS+6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1㊁0.5㊁1.0㊁1.5㊁2.0mg㊃L-1+萘乙酸(NAA)0.1㊁0.2㊁0.3㊁0.4㊁0.5mg㊃L-1㊂设置培养室温度25ħ,光照时间12h,光照强度2000lx㊂1.2.2㊀试管苗的壮苗培育㊀㊀当诱导出的马铃薯试管苗生长到5~10cm时,接种在5种不同激素浓度的MS中,进行马铃薯试管苗的壮苗培养,即MS+6-BA(0.10,0.15, 0.20mg㊃L-1)+NAA(0.05㊁0.10㊁0.15㊁0.20㊁0.25mg㊃L-1),同时以不加激素的MS作对照㊂待培养2周之后观察记录马铃薯试管苗芽㊁根㊁叶以及苗高㊂1.2.3㊀RNA提取㊀㊀称取0.05~0.10g马铃薯试管苗的叶片,加入1mL TRIzol,按照使用说明书提取RNA㊂将沉淀溶解在25~100μL经DEPC处理的水中,55~ 60ħ放置10min使RNA充分溶解,保存备用㊂1.2.4㊀多重qRT-PCR㊀㊀反转录体系:取有PVX㊁PVY㊁PVH和PVM 病毒的RNA2.5μL,65ħ变性10min,冰上放置2min;接着加入1μL RT buffer和dNTPs,0.5μL 病毒随机引物(100ng㊃μL-1),5U RNase Inhibitor,100U随机反转录酶,用ddH2O补足至10μL,混匀离心㊂反应程序:37ħ反应1h, 85ħ灭活1min,-20ħ保存待用㊂PCR反应体系:取2μL cDNA,加入2.5μL PCR buffer㊁0.5μL dNTPs㊁1.5μL MgCl2,上㊁下游引物(10ng㊃μL-1)各0.5μL,0.05U㊃μL-1Taq DNA聚合酶浓度㊂PCR反应程序:92ħ预变性3min;92ħ变性30s,56ħ退火30s,72ħ延伸45s,循环32次;72ħ延伸10min㊂取5μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析㊂1.2.5㊀用qRT-PCR检测茎尖组织培养获得的马铃薯试管苗的带毒情况㊀㊀目前世界范围内报道的侵染马铃薯的病毒大约有40种[4-6],本实验鉴定危害马铃薯生产的4种主要病毒(P VX㊁P VY㊁P VH㊁P VM)㊂多重qRT-P CR检测技术是将全部需要检测的病毒特异性引物同时加入到一个体系中再进行反应,依此建立的检测技术可以同时检测多种病毒[7],节约时间,提高效率㊂自然环境中生长的马铃薯时常能同时感染多种病毒,所以多重qRT-P CR检测技术在马铃薯病毒检测中较为重要[8]㊂1.2.6㊀马铃薯大田病毒鉴定及产量比较㊀㊀试验地点位于横溪大岙村㊂前茬为甘薯,土壤为砂壤土㊂试验采取随机区组排列,试验地面积54m2,分6个小区,2个小区为一个区组㊂3次重复,1个区组包括2个处理,处理1是组培繁育的原种,处理2是农家自留种,每小区1畦,畦宽连沟1.0m,长9.0m,每畦两行种植,每行30株,每小区60株,每667m2种植4200株㊂四周设保护行㊂肥料一次性作基肥施入,每667m2施用商品有机肥150kg,复合肥80kg㊂2月15日播种,5月7日收获㊂试验过程中对田间每小区的病株及产量进行调查统计㊂2㊀结果与分析2.1㊀马铃薯茎尖诱导培养基筛选㊀㊀以MS培养基为基础,分别加入不同浓度的NAA和6-BA,配制25组培养基,在每组培养基中接种20个茎尖,培养40d后进行调查(表1)㊂由表1可知,6-BA的浓度影响茎尖成苗,随着6-BA浓度的增加,茎尖成苗率逐渐下降㊂当NAA浓度为0.1或0.5mg㊃L-1,6-BA浓度为0.5mg㊃L-1时茎尖成苗率最高,可达75%㊂2.2㊀马铃薯脱毒苗壮苗培养基筛选㊀㊀当诱导成苗的植株长到5~10cm时,转接到加有不同激素浓度的MS壮苗培养基中,每组培养基接种50株苗㊂培养30d后进行调查(表2)㊂MS无激素培养基苗长得较高,茎节较长,但比较细弱㊂MS+6-BA0.15mg㊃L-1+NAA0.2mg㊃L-1培养基中苗长得最好,比较粗壮,根数和叶片数最多(图1)㊂2.3㊀马铃薯试管苗的病毒鉴定㊀㊀分别提取感病马铃薯和脱毒组培苗叶片的总RNA,反转录为cDNA后,用PVX㊁PXY㊁PVH㊁PVM外壳蛋白的特异性引物进行PCR检测㊂结果显示,脱毒组培苗中未能检测到这些病毒的CP基因(图2),说明组培脱毒能有效地清除马铃薯中的PVX㊁PVY㊁PVH和PVM㊂表1㊀茎尖分生组织在不同培养基中成苗情况培养基NAA/(mg㊃L-1)6-BA/(mg㊃L-1)成苗率/%10.10.125 20.10.575 30.1 1.020 40.1 1.55 50.1 2.00 60.20.130 70.20.560 80.2 1.015 90.2 1.55 100.2 2.00 110.30.120 120.30.550 130.3 1.015 140.3 1.55 150.3 2.00 160.40.125 170.40.565 180.4 1.010 190.4 1.50 200.4 2.00 210.50.130 220.50.575 230.5 1.010 240.5 1.55 250.5 2.00 2.4㊀脱毒后的马铃薯大田病毒鉴定及产量比较㊀㊀将小黄皮脱毒后的原种与农家自留种进行大田比较,处理1脱毒后的原种田间鉴定病株数量为0,处理2农家自留种大田鉴定病株率43%(表3)㊂㊀㊀表2㊀马铃薯脱毒苗在不同壮苗培养基中的表现培养基NAA/(mg㊃L-1)6-BA/(mg㊃L-1)每株平均叶片数平均株高/cm根数愈伤组织10.050.10 5.39.1 3.1无20.100.10 6.19.4 3.2无30.150.159.17.8 4.7无40.200.159.48.1 5.3无50.250.20 6.0 6.4 3.7有小块愈伤6007.110.3 2.3无图1㊀马铃薯试管苗培养图2㊀马铃薯试管苗的PVX㊁PVY㊁PVH和PVM病毒鉴定处理1产量和抗性明显优于未脱毒的农家自留种,原种产量比对照提高34.9%,薯块光滑,商品性好(图3)㊂表3㊀病毒病田间抗性和产量处理小区病株数量重复1重复2重复3平均病株率/%小区产量/kg重复1重复2重复3平均667m2产量/kg10000018.721.620.320.21500.1 2272031264314.415.415.215.01111.73㊀结论与讨论㊀㊀病毒病是马铃薯种植生产中的重要病害,由于马铃薯经常被多种病毒复合侵染,单一抗性在生产中很难起到保护作用㊂马铃薯茎尖脱毒技术利用茎尖干细胞抑制病毒增殖的特点,取茎尖的无毒细胞进行组织培养㊂当切取马铃薯试管苗茎尖大于0.3mm时,其带病毒含量随着切取茎尖增长而增加[9]㊂在温室组织培养的条件下,马铃薯试管苗的生长往往受到多种环境因素的调控,光照㊁温度以及培养基类型等都能影响试管苗的生长㊂光照不仅仅作为光合作用的能量来源,而且还作为一种重要的信号分子能够调节基因的表达,影响酶的活性以及光形态建成等[4],光照可以促使植物更好地适应外界生长环境,更是马铃薯试管薯生长的主要影响因素,光照强度对不同品种的试管薯形成和膨大的影响有所不同㊂常规试管薯诱导多是在全黑暗条件下进行,而在本实验中不同品种的试管薯形成对光质(光密度等)的要求有一定差异[5]㊂同时,多种外源激素会影响马铃薯试管苗生长发育,根据马铃薯品种的不同,其对激素的敏感程度也有所不同㊂研究表明,NAA或6-BA单独使用时试管苗生长比较差,NAA利于试管苗的生根, 6-BA对试管苗茎叶的生长有显著促进作用,同时使用这2种激素的试管苗生长状况较好,这与前人研究[3,10]的结果相一致㊂图3㊀脱毒马铃薯与农家自留种马铃薯的田间表现综上所述,针对宁波小黄皮马铃薯病毒长期积累导致的品种退化现象,对该品种进行茎尖组培脱毒,大田种植脱毒后的试管苗后,叶子平坦,有利于光合作用,生长旺盛[11-13],其产量和品质明显优于未脱毒的马铃薯对照组,为宁波马铃薯产业的可持续发展提供了有效保障㊂参考文献:[1]㊀刘丽宅,谢晶,汪洋,等.马铃薯主食产品研究现状及发展㊀㊀前景[J].粮食加工,2016,41(6):64-67.[2]㊀宋进库,万秀云.环境条件对马铃薯生长的影响[J].热带农业工程,2020,44(2):13-15.[3]㊀代欣玉,孙璐.植物组织培养技术在马铃薯上的应用[J].中国果菜,2020,40(12):67-70.[4]㊀李彦军,滕巍,耿伟,等.脱毒马铃薯试管苗生长的影响因素及壮苗措施[J].中国果菜,2020,40(9):113-116.[5]㊀杜荣骞,李德森,罗智敏,等.马铃薯病毒RNA的提取方法:CN1473839A[P].2004-02-11.[6]㊀宋静静,蒙姣荣,邹承武,等.用小RNA深度测序鉴定广西冬种马铃薯病毒[J].中国农业科学,2013,46(19):4075-4081.[7]㊀吴兴泉,时妍,杨庆东,等.马铃薯病毒的RT-PCR检测技术评述[J].中国马铃薯,2011,25(4):251-254. [8]㊀GOPAL J,CHAMAIL A,SARKAR D.In vitro production ofmicrotubers for conservation of potato germplasm:effect ofgenotype,abscisic acid,and sucrose[J].In Vitro Cellular&Developmental Biology-Plant,2004,40:485-490. [9]㊀林佳,杨国荣,严柯雯,等.光照时间对宁波1号脱毒马铃薯试管苗瓶内诱导小种薯的影响[J].浙江农业科学,2021,62(5):907-909.[10]㊀沈升法,吴列洪,项超,等.浙江省马铃薯地方种质资源鉴定[J].浙江农业科学,2019,60(1):83-88. [11]㊀许泳清,许国春,李华伟,等.施肥方式对闽彩薯4号脱毒苗农艺性状及微型薯繁育的影响[J].福建农业科技,2022(6):43-47.[12]㊀蔡章棣.膜下滴灌不同施肥处理对冬种马铃薯生长动态及产量的影响[J].福建农业科技,2022(7):56-60. [13]㊀陆玉霞,张朝成,周天虹.甘薯茎尖脱毒培养技术研究[J].湖北农业科学,1996,35(2):22-25.(责任编辑:王新芳)。