常用菌种的分离、选育和保藏

第三章菌种的分离筛选● 1.菌种来源● 2.分离方法● 3.菌种保藏● 4. 菌种复壮典型的微生物新种分离筛选过程第一节菌种来源1.向菌种保藏机构索取有关菌株，从中筛选所需菌株。

国内主要菌种保藏机构：●AS—中国科学院微生物研究所●CMCC—中国医学细菌保藏管理中心●CVCC—兽医微生物菌种保藏管理中心●IA—中国医学科学院抗菌素研究所●IANP—华北制药厂抗菌素研究所●ID—中国医学科学院皮肤病防治研究所、●CAMS—中国医学科学院流行病学微生物研究所●IFFI—轻工业部食品发酵工业科学研究所等。

国外主要的菌种保藏机构●ATCC—美国标准菌种收藏所●NIH—美国国立卫生研究院●NRRL—美国农业部北方开发利用研究所●CMI—英联邦真菌研究所，CSH—美国冷泉港实验室●IAM—日本东京大学应用微生物研究所，IFO—日本大阪发酵研究所，KCC—日本科研化学有限公司，●NCTC—英国国立标准菌种收藏所●WB—美国威斯康星大学细菌学系等。

2.由自然界（土样、水、动植物体等）采集样品，从中进行分离筛选。

不可培养微生物是指目前尚不能实现人工培养的微生物。

原因可能为尚不了解该类微生物的营养需求和生长需要的理化环境。

目前人类认识和培养的微生物还不到其存在种类的1%。

3.从发酵制品中分离目的菌株。

如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶产生菌等。

采样过程（一）从土壤中采样要考虑土壤的有机质含量和通气状况、酸碱度和植被状况、地理条件和季节条件。

用采样铲采集5-25cm（北方干燥的土壤，采集10-30cm）土样10-25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，并编号，记录采集地点、土壤质地、植被名称、采集时间等。

土样采集后要尽快分离，否则可取3-4g撒到事先准备好的选择性培养基试管斜面，避免菌株因不能及时分离而死亡。

根据微生物生理特点采样1.根据微生物营养类型采样（1）微生物的营养要求和代谢类型与其生长环境有很大的相关性森林土壤富含纤维素，可分离纤维素酶产生菌；肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，能分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌；面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等，容易分离到产生淀粉酶和糖化酶的菌株；从果园土和腐烂的柑橘、草莓及山芋中，容易分离到果胶酶产生菌。

光合细菌菌种分离与保藏随着健康养殖渔业的发展，光合细菌越来越受到养殖者的青睐。

光合细菌广泛分布于生物圈的各个角落，在净化水质、防治疾病和促生长方面效果明显，可作为鱼、虾、贝的饵料、饵料添加剂及浮游动物饵料。

光合细菌的培养首先要有菌种，菌种是从它生活环境中的微生物群中分离出来的。

笔者现以水产养殖和水质净化中常用的红螺菌种为例，简单介绍其分离和保藏技术，以供生产者参考。

菌种的分离采样红螺菌种的种类在自然界中有有机污染的地方广泛存在。

样品可以从河底、湖底、海底以及水田、池塘、沟渠等有污水进入的地方，以及食品工业污水排放处的橙黄色、粉红色泥土中获得。

可以用杯子采集少量泥土，连水放入广口瓶或用采水器、采泥器取样。

为了获得密度较高的样品，也可以采取淡水池塘、池沼及海边的污泥，置入广口瓶中盖紧，分别加入几片海带或其它一些海藻，装满淡水或海水，置入日光下培养。

大约一个月以后，瓶底就可以见到光合细菌的沉淀物。

经过这样的简单培养后，可以直接对此菌作分离后进行纯培养。

富集富集培养时，将采集的样品装入玻璃圆筒或大型试管或具塞磨口玻璃瓶，再倒入配制好的培养液，充分搅拌。

为造成厌气环境，在玻璃瓶或试管中加入液体石蜡以隔绝空气；磨口瓶只需将培养液加满加塞，以排除其中空气，瓶外再用塑料薄膜裹住扎牢，以减少水分蒸发。

培养温度为5℃～35℃。

光照可以利用阳光，夜晚时则利用人工光源，光照强度的适宜范围为5000Lux～10000Lux。

在这样的培养条件下，大约经过2周～8周的培养，在玻璃瓶壁上会出现光合细菌的菌落，或者整个培养液长成红色。

如果是培养海水的光合细菌，因其生长缓慢，需要更长的富集培养时间。

富集操作可以重复进行，方法是将初步富集的光合细菌的菌液或泥土移入磨口玻璃瓶中继续培养，反复多次，光合细菌占绝对优势时可确认富集成功。

为了避免在培养液中藻类和绿杆菌科的细菌的发展，可采用滤光片，使波长800纳米或更长波长的光透过，这样可以更有效地达到富集紫色非硫细菌的目的。

第三章发酵工业微生物菌种微生物发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种有用物质的现代工业，它是以培养微生物进行发酵为主。

而在这个过程中，优良的菌种是一个现代化的发酵工业必不可少的，最为重要的环节。

其他如先进的生产工艺和先进的设备，则是为了更充分发挥优良菌种的性能而设计的。

第一节工业微生物菌种的分离和选育第二节工业微生物菌种的改良第三节发酵工业中菌种的退化第四节工业微生物菌种的保藏第五节工业微生物菌种的扩大培养第一节工业微生物菌种的分离和选育一般来说，从自然界直接分离到的菌种，不能立即适应实际的生产需要，只有通过选育，才能提高代谢产物的产量、改进产品质量直至简化工艺。

在微生物发酵工业中生产菌种的选育方法有：•微生物菌种的分离和选育•菌种的改良第一节工业微生物菌种的分离和选育一、微生物菌种的选育二、微生物常规育种三、根据代谢的调节机理选择高产突变菌株一、微生物菌种的选育从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤：1、采样2、增殖培养3、纯种分离4、性能测定1、采样采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析来决定。

如果不了解某种生产菌的具体来源，一般可以从土壤中分离。

①、确定选好地点取离地面5——15cm处的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等，以备查考。

②、尽快分离一般土壤中芽孢杆菌、放线菌和霉菌孢子忍耐不良环境能力较强，不太容易死亡。

但一般应尽快分离。

③、酵母菌或霉菌类微生物采样酵母菌或霉菌类微生物，它们对碳水化合物的需要量比较多，一般又喜欢偏酸环境，所以在普通植物花朵、瓜果种子及腐植质等上面比较多。

2、增殖培养收集到的样品，如含有所需的菌种较多，可直接进行分离。

如果样品含有所需要的菌种很少，就要设法增加该菌种的数量，进行增殖（富集）培养。

富集培养：富集培养就是指利用不同微生物之间的生命活动特点的不同，制定出特定的环境条件，使仅仅适应于这种条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加的微生物的分离方法。

常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。

2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。

，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。

3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。

材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。

4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。

如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。

5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。

6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。

7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。

分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。

附录2 真菌单孢子分离技术一、目的要求了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。

二、基本原理单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。

振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，置适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。

直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。

三、材料、用具与仪器1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。

实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1。

了解微生物的分离纯化方法。

2.学习检测水中大肠菌群的方法。

3。

学习微生物的保藏及鉴定方法。

4。

熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气.1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养,24小时内小套管中有气体形成,并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群,为阳性结果。

48小时后仍不产气的为阴性结果。

2。

平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。

3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落,经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。

原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

三、实验器材及试剂1。

水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。

3、器材及耗材：双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1。

第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL,并加入产气管.配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。

2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。

于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。

3）称取一定量的液体石蜡,约为锥形瓶的三分之一。

于121℃高温高压灭菌20分钟。