下载文档原格式
实验⼆特殊显微镜的使⽤——相差显微镜实验⼆特殊显微镜的使⽤实验2.1相差显微镜⼀、实验⽬的掌握相差显微镜的原理、构造及其使⽤⽅法。
⼆、实验原理相差显微镜（phase-contrast microscope ）是由P. Zernike 于1932年发明的，P. Zernike于1953年获诺贝尔物理奖。
相差显微镜最⼤的特点就是可以⽤于观察未经染⾊的标本和活细胞。
⼈们在光学显微镜下观察被检标本时，只有在反射光的波长（颜⾊）和振幅（亮度）与周围介质有变化时，⽅能看到被检样品的结构。
活细胞近于⽆⾊透明，光波通过时，透过或反射光的波长和振幅都不发⽣改变，所以⽤普通光学显微镜难以辨清活体的结构。
⼀般对于明暗对⽐很⼩的样品，多借助于固定和染⾊等理化⽅法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发⽣变化，即在颜⾊和亮度上有所差异，才能识别。
但有些样品⼀经染⾊就会引起变形，染⾊也可使有⽣命的样品死亡。
我们可以利⽤相差显微镜来进⾏观察。
相差显微镜利⽤了光的⼲涉现象，将⼈眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，因此它是⼀种应⽤在染⾊困难或不能染⾊的新鲜标本上获得⾼对⽐图像的新型显微镜。
相差⽅法应⽤于⽣物学上的主要价值，在于它能对透明的活体进⾏直接观察，⽆需采⽤使细胞致死的固定和染⾊的⽅法。
染⾊给活体以有害的影响，甚⾄失真。
由此，才使相差法显得异常重要。
相差是指同⼀光线经过折射率不同的介质其相位发⽣变化并产⽣的差异。
相位是指在某⼀时间上，光的波动所达到的位置。
相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差），介质越厚或折射率越⼤，光波减速也越⼤。
为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板（phase plate ）。
在圆形相扳平⾯上，有⼀圈与周围（⾥外）相扳厚度不同的或凸或凹的圆环。
相板分两部分：共轭⾯（conjugate area ）：通常为环状，是通过直射光的部分。
实验3 相差显微镜的使用相差显微镜的原理：在人的视觉中，波长的变化表现为颜色的不同，振幅变化变现为明暗不同，而相位的变化肉眼感觉不到的，即人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），不能区分相位。
当光线通过无色通明的生物标本时，波长和振幅变化不大，只有相位发生了变化，因此在明场观察时很难观察到标本（图？）。
当照明光线通过活细胞时，虽然波长及振幅没有明显的变化，但由于细胞的各部分及细胞与周围介质之间折射率有所差别，光线通过各种界面时，一部分直接通过细胞称为直射光，另一部分变为衍射光，衍射光与直射光的波长一致，但衍射光的相位比直射光大约推迟约1/4个波长(λ)。
从标本某一点发出的直射光和衍射光经物镜会聚以后，在物镜的像场交于一点，衍射光与直射光就会发生干涉，而形成合成光波。
合成光的波长仍和原来相同。
但振幅为两束光的几何叠加。
相差显微镜利用光的衍射和干涉特性，在光学系统中增加了特殊装置：在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜后焦面上加了一个相板，可利用被检物体的光程之差进行镜检，有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，因此，可以观察无色透明的物质，大大便利了活体细胞的观察。
改变相位由相板完成。
如果推迟直射光的相位1/4λ，则直射光和衍射光的相位相同，发生相长干涉，合成光将比直射光明亮，成为负反差。
如果推迟衍射光的相位1/4λ，则直射光比衍射光超前1/2λ，这时发生相消干涉，合成光比直射光暗，成为正反差。
图相差显微镜原理示意图（安利国，2004）相差显微镜的装置：相差显微镜有一些特殊的装置而有别于明视野显微镜。
相差聚光镜：位于镜台之下，由聚光镜和环状光阑（Ring slit）构成。
环状光阑装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为相衬聚光镜。
环状光阑使直射光成筒状射向标本面，然后在物镜后焦面聚焦形成一个光环；在标本面上发散的衍射光在到达物镜后焦面时不能聚焦成光环而是分散在光环之外，这样使直射光和衍射光在后焦面被分开。
相差显微镜的工作原理
相差显微镜是一种常用的光学显微镜，它利用了光波在不同介质中传播速度不同的原理，通过相差干涉效应增强了显微镜的分辨能力。
相差显微镜的工作原理可以简单地分为以下几个步骤：
1. 光源发出光线：相差显微镜通常使用准直光源，例如汞灯或钠灯等。
这些光线经过准直器产生平行光束。
2. 光线通过物镜：平行光束进入物镜系统，物镜是相差显微镜的关键部件之一。
物镜由多个透镜组成，并具有特殊的设计，以便产生相差。
3. 形成相差：进入物镜的光线会经过样品，样品会改变光线的相位和振幅。
不同的部分会对光线产生不同的相位差，形成相差。
4. 再现映像：经过样品后的光线进入目镜，目镜会将光线再次聚焦在目视者的眼睛上，形成放大的映像。
在此过程中，由于相差产生的相位差，样品的细小细节会呈现出明暗差别。
相差显微镜的分辨能力较高，可以观察到常规光学显微镜无法解析的细节。
然而，相差显微镜也有一些局限性，例如对不透明或厚样品的观察存在困难。
总的来说，相差显微镜利用相差干涉原理增强了显微镜的分辨能力，使得我们能够更清晰地观察微小样品的细节。
相差显微镜安全操作及保养规程1. 前言相差显微镜（又称差示显微镜或增强相差显微镜）是一种透射式显微镜，在科研、教学和医学领域有着广泛的应用。
但是，使用相差显微镜需要注意安全操作和保养，以确保实验过程平稳安全、仪器长期使用。
因此，本文旨在介绍相差显微镜的安全操作和保养规程。
2. 使用前的检查在使用相差显微镜进行观察前，需要对设备进行检查，避免出现问题，影响使用效果。
具体检查事项如下：•检查电源线是否损坏或老化。
•检查是否已将显微镜插好电源并接地。
•检查各部位是否松动。
•检查光学仪器是否干净，无杂质，并检查目镜和镜头有无损坏。
3. 安全操作指南3.1. 试样处理在观察样品前，需要对样品进行处理，保证样品垂直于光轴、固定在样品台上并干净无尘。
有机溶剂和高温或强酸强碱等有害物质需保持适当的距离。
3.2. 目镜调整目镜调整是使用相差显微镜前必要的步骤。
具体操作如下：•调整目镜和配套物镜为相同的倍数。
•观察焦距象移是否正常。
•通过调节光阑和中心轴上的白色刻度来调整图像的清晰度。
3.3. 光学调节光学调节是观察样品时必要的操作步骤。
具体操作如下：•点亮光源，调整光亮度。
•将光阑收缩到适当大小。
•调节相差调节旋钮直到清楚观察到了样品，而不是其它的干扰因素。
3.4. 观察样品观察样品时需要遵守以下操作规程：•避免直接插动试样，以免影响其位置和光路。
•不要用手直接触碰样品。
•观察样品时不要移动试管、瓶子等容器。
3.5. 结束操作使用相差显微镜后需要进行如下操作：•关闭光源电源。
•调回目镜，收起试样，放回原处。
•清理样品台，保持干净整洁。
•关闭显微镜电源及主断路器。
•接好防静电线，合好仪器柜门。
4. 设备保养为确保相差显微镜的正常使用寿命，需要注意保养规程。
具体保养措施如下：•每天使用前，定期检查仪器是否正常，避免因设备损坏导致结果不准确、设备无法使用等问题。
•每天结束试验后进行设备清洁，特别是镜面纸巾每次使用后必须更换。
实验一相差显微镜的使用一、实验目的掌握相差显微镜的原理、构造及其使用方法。
二、实验用品试剂：蒸馏水或生理盐水。
器材：相差显微镜（相差物镜、转盘聚光器、调中合轴望远镜、绿色滤色镜）、载玻片、盖玻片、牙签、滤纸条、指甲油。
三、实验原理光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位（指在某一时间上光的波动所能达到的位置）的不同。
当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。
而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化（相应发生的差异即相差），而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。
相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。
因此可用以观察活细胞或未染色标本。
相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜（通常标有PH的标记）代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。
环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。
其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。
相板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。
它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。
调轴望远镜是用来进行合轴调节的。
相差显微镜在使用时，聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。
否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。
1.相差同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。
相位是在某一时间上，光的波动所达到的位置。
一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差太小，我们的眼睛很难分辨出这种差别的，只有变相差为振幅差（明暗之差），才能被分辨。
相差显微镜特点及应用相差显微镜是一种通过利用光的相位差来增强显微镜分辨能力的显微镜种类。
它由光源、物镜、特制的光学装置和目镜等组成。
相差显微镜的主要特点是能够产生高分辨率、高对比度的影像。
相差显微镜的原理是利用了物镜与目镜之间采用特制的相差装置，使得光线在透过不同的物质时，经历不同的相位差。
在物镜和目镜之间形成一个干涉图样，这样可以增强细胞和微生物等的对比度，使其清晰可见。
相差显微镜具有以下几个主要特点：1. 高分辨能力：相差显微镜能够产生高分辨率的图像，可以观察到更加细微的结构特征。
相较于普通光学显微镜，相差显微镜能够辨别更小尺寸的细胞和微生物。
2. 高对比度：相差显微镜通过利用光的相位差来增强对比度，使得样本中的细节更清晰可见。
对于透明物质和无色物质，相差显微镜比普通显微镜更有优势。
3. 无需染色：相差显微镜不需要对样本进行染色处理，可以直接观察样本的原始结构，避免了染色过程对样本产生的影响。
4. 显示立体图像：相差显微镜可以观察到样本的立体图像，使得样本中的三维结构更加清晰可见。
这对于观察生物组织和器官等的结构十分重要。
相差显微镜在生物学、医学、材料科学等领域有广泛的应用。
下面将分别介绍其在这些领域中的应用。
1. 生物学应用：相差显微镜在生物学研究中被广泛使用，可以观察到生物细胞的结构和功能。
例如，在细胞学研究中，相差显微镜可以观察到细胞核、细胞质和细胞器等组成部分的结构，更好地了解细胞的功能和进程。
此外，相差显微镜还可以用于观察细胞的运动、分裂和凋亡等过程。
2. 医学应用：相差显微镜在医学研究和临床诊断中也有重要的应用。
例如，在病理学领域，相差显微镜可以观察到组织样本和细胞样本，帮助医生诊断疾病。
此外，在药物研发过程中，相差显微镜可以观察到药物对细胞的影响，评估药物的疗效和安全性。
3. 材料科学应用：相差显微镜在材料科学研究中也有广泛的应用。
例如，在纳米材料研究中，相差显微镜可以观察到纳米粒子和纳米结构的形貌和分布情况。
实验二 特殊显微镜的使用实验2.1相差显微镜一、实验目的掌握相差显微镜的原理、构造及其使用方法。
二、实验原理相差显微镜（phase-contrast microscope ）是由P. Zernike 于1932年发明的，P. Zernike于1953年获诺贝尔物理奖。
相差显微镜最大的特点就是可以用于观察未经染色的标本和活细胞。
人们在光学显微镜下观察被检标本时，只有在反射光的波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质有变化时，方能看到被检样品的结构。
活细胞近于无色透明，光波通过时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。
一般对于明暗对比很小的样品，多借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所差异，才能识别。
但有些样品一经染色就会引起变形，染色也可使有生命的样品死亡。
我们可以利用相差显微镜来进行观察。
相差显微镜利用了光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，因此它是一种应用在染色困难或不能染色的新鲜标本上获得高对比图像的新型显微镜。
相差方法应用于生物学上的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。
染色给活体以有害的影响，甚至失真。
由此，才使相差法显得异常重要。
相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。
相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。
相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差），介质越厚或折射率越大，光波减速也越大。
为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板（phase plate ）。
在圆形相扳平面上，有一圈与周围（里外）相扳厚度不同的或凸或凹的圆环。
相板分两部分： 共轭面（conjugate area ）：通常为环状，是通过直射光的部分。
其环是凸起的，也可能是凹陷的。
补偿面（complementary area ）：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。
在相板的共轭面或补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质。
当光线通过时，使光波的相位或图1-10 相差显微镜光路图振幅改变，从而达到不同的目的与观察效果。
利用相板把光波相位推迟，振幅改变。
相板的作用，除推迟直射光和衍射光的相位之外有吸收光，从而使亮度改变的作用。
物镜的后焦点位于透镜中间而相板位于物镜的后焦面上，所以相板安装在透镜中间。
相差显微镜的光路图如图1-12所示，光线从聚光镜下的环状光阑的圆形缝隙射入直射光，照射到被检样品上，产生直射光和眼射光两种光波。
衍射光的振幅较小，相位滞后。
在物镜的后焦面上，设有相板，直射光通过共轭面，衍射光通过补偿面，并相互干涉造像。
样品的影像由直射光和衍射光经干涉后的合成波造成；背景仅由直射光形成。
由于直射光和衍射光两种光波的相位差异不同造成不同的反差效果，或明反差或暗反差不等视所用物镜的相板类别而定。
成像光束由物镜射入目镜，在目镜的视场光阑处再次放大。
三、实验装置相差显微镜不同于普通光学显微镜，在装置上有四种必不可缺的部件：相差物镜、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤色镜。
1．相差物镜（phase contrast objective ）相差物镜是显微镜特有的重要装置。
在相差物镜内的后焦面上装有种类不同的相板。
相板由于前述的作用，造成视场中被检样品影像与背景不同的明暗反差，各具不同的效果。
因物镜内相板种类或构成的不同，物镜在明暗反差上可区分为两大类，即明反差（B ）或负反差（N ）物镜和暗反差（D ）或正反差（P ）物镜。
物镜的反差类别，用英文字母B 或N 和D 或P 标志在物镜外壳上，并兼有高H （High ）、中M （Medium ）和低L （Low ）等三种不同的 反差。
有的相差物镜用ph 字样标示。
同一反差类别的物镜，依放大率的不同，又可分为10×、20×、40×和100×数种，因此相差物镜种类颇多，一套可多达20余种。
相差物镜多为消色差物镜或平场消色差物镜（PL ）。
2．转盘聚光器（turret condenser ）位于镜台之下，普通聚光器的所在位置上由聚光镜和环状光阑（annular diaphragm ）构成。
环状光阑位于聚光镜之下，是一种特殊的光阑装置，由大小不同的环状通光孔构成，不同规格的通光孔——环状光阑装配在一个可旋转的转盘上，按需要调转使用（图1-13）。
环状光阑的环宽与直径各不相同，与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配，不可滥用。
转盘前端朝向便用者一面有标示窗（孔），转盘上的不同部位标有0、1、2、3和 4或 0、10、20、40、和100字样，通过标示窗显现。
“0”表示非相差的明视场的普通光阑。
1或10、2或20、3或40和4或100，表示与相应放大率的相差物镜相匹配的相差物镜相匹配的不同规格的环状光阑的标志。
通过手动转入标示窗内之数字，表示该数字所代表的环状光阑已进入光路。
3．合轴调中望远镜（centering telescope ）合轴调中望远镜简称CT ，又名合轴调中目镜。
它是眼透镜，可行升降调节，具有较长焦距的一种望远目镜。
镜筒较长，其直径与观察目镜相同。
它的功用仅作为环状光阑的环孔（亮环）与相差物镜相扳的共轭面环孔（暗环）的调中合轴与调焦之用。
相差显微镜使用时，转盘聚光器的环状光阑与相差目镜必须匹配，且环状光阑的环孔与相差物镜相扳共轭面的环图1-11 转盘聚光器构造图孔在光路中要准确合轴，并完全吻合或重叠以保证直射光和衍射光各行其路，使成像光线的相位差转变为可见的振幅差。
但是，镜体的光路中前述两环的影像较小，一般目镜难以辨清，不能进行调焦与合轴的操作，非借助合轴调中望远镜不可。
4．绿色滤色镜（green filter）相差物镜的种类，从色差消除情况来分，多属消色差物镜（achromatic objective）或ＰＬ物镜。
消色差物镜的最佳清晰范围的光谱区为510~630nm。
欲提高相差显微镜的性能最好以波长范围小的单色光照明，即接物镜最佳清晰范围的波长的光线进行照明。
所以，使用相差物镜时，在光路上加用透射光线波长为500~600nm左右的绿色滤色镜，使照明光线中的红光和蓝光被吸收，只透过绿光，可提高物镜的分辨能力。
该滤色镜有吸热的作用，以利活体观察。
四、实验步骤相差显微镜的使用，较之普通显微镜要复杂些，但亦易于掌握，按下列过程进行操作。
1．相差装置的安装如前所述，相差显微镜区别于普通光学显微镜的装置主要有相差物镜、转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色滤色镜四种部件。
使用时将这些部件调换安装在同型号的普通光学显微镜上，即成为相差显微镜。
（1）相差物镜的调换安装从物镜转换器上拆下普通物镜，旋入相差物镜，与普通目镜配套使用。
（2）转盘聚光器的调换安装旋转聚光器升降螺旋，把普通明视场聚光器至最低位，旋松固紧螺丝，卸下聚光器。
把转盘聚光器安放到相应位置上，旋紧固紧螺丝，转动聚光器升降螺旋，使聚光器升至最高位置。
转盘聚光器的标示孔，朝向操作者。
此时，转盘聚光器上面的聚光镜部分，进入光路；下面的环状光阑转盘，可视需要转动使用，把与物镜匹配的环孔旋入光路，使之处于转盘聚光镜下。
（3）把绿色滤色镜放入镜座的滤色镜架上。
2．聚光器调中转盘聚光器调换安装后，要进行合轴调中，使聚光器的光轴与显微镜的主光轴合一。
其步骤如下；（1）把转盘聚光器的环状光阑调至“O”位，明视场照明用的普通可变光阑进入光路。
（2）旋转聚光器升降螺旋，聚光器升至最高位。
（3）接通照明光源，使视场明亮。
（4）把被检样品放到载物台上，用低倍（4×）物镜聚焦。
（5）缩小镜座上的视场光阑开孔，至最小。
（6）从目镜观察，在暗视场中可见一缩小的、明亮的、多角形的视场光阑图像。
（7）转动转盘聚光器的两个调中杆，推动聚光器，把视场中的明亮的多角形的视场光阑图像，调至视场中央。
（8）开放视场光阑至视场同大，视两者周边是否完全重合；否则，复用调中螺杆，使聚光器精确调中。
3．相板圆环与环状光阑圆环的合轴调中相差物镜的后焦面装有相板。
按物镜放大率与反差效果的不同，相板圆环（共轭面）的大小与结构亦不同。
转盘聚光器的环状光阑为一系列的透光的，不同大小的明亮环孔，与不同放大率的物镜相应。
使用时严格匹配，当物镜更换时，环状光阑亦作相应的更换或调整。
在视场中观察所见，环状光阑为一明亮的圆环，而相板的圆环为一暗环。
互相匹配的明环与暗环大小一致。
在使用时两者要合轴，互相重叠。
两环的重叠．须通过合轴调节方能取得。
其方法如下：（1）相差物镜与环状光阑的匹配：正确地匹配取决于所用物镜放大率。
例如，当使用40×相差物镜时，环状光阑转向ph3或40位，使相应地环状光阑进入光路。
（2）把CT放入目镜筒：从目镜简取出一个目镜，换入调中合轴望远镜（CT）。
CT 为一眼透镜，也是可行升降调节的望远目镜，专为观察视场中明环与暗环图像之用。
因为用一般目镜着不见两环的清晰图像。
CT在使用前眼透镜应处于最低位．即CT为最短小的状态。
（3）明环与暗环的聚焦：一手固定位于目镜筒中的CT镜筒，使其场透镜位置不能上移，另一手逆时针转动CT上部可调的眼透镜部分。
转动的同时，通过CT向现场中观察，即边旋转边观察。
初始，两环可能为模糊的图像，继续转动CT目镜可调部分至清晰地窥见明环与暗环止。
（4）明环与暗环的调中重叠：相扳的暗环是固定不动的，处于光路之中，暗环的中心，即显微镜光轴的中心。
环状光阑的亮环可调节移动。
转盘聚光器环状光阑的位置，因聚光器的可调，其中心位置往往偏离光轴轴心，需调整，使其归中。
环状光阑的调中装置或部件，因厂家或型号的不同而有别。
如OL YMPUS BH－PC型相差显微镜，环状光阑调中装置为位于转盘聚光器两侧的两个伸缩自如的调中螺杆，用以操纵改换环状光阑的方位，达到调中；而Nikon FIVOPHOT型显微镜的相差装置，其环状光阑的调中部件为位于转盘聚光器表面，可向任一方向滑动的环状钮。
调中时，手捏调中装置，移动明环，使之与暗环合一。
在两环调中过程，始终在通过CT的观察下进行。
在调节过程中，如亮环比暗环小，并位于暗环内侧时，应降低聚光器位置，使亮环放大。
若亮环大于暗环时，应提升聚光器，使亮环缩小，如聚光器已升至最顶点还不能完全重合可能是载玻片过厚之故。
（5）回装观察目镜：待相差物镜的暗环与环状光阑的亮环调中、重叠后，从目镜筒中取出CT，放回观察用的接目镜，以便镜检观察。
4．相差物镜的选择相差物镜有不同倍率、不同反差类别和反差程度之分。
相差物镜的反差类别和反差程度以及放大倍数，皆用英文字母和数字标示在物镜壳外。
