单克隆抗体制备系统常用液体配制标准SOP操作规程样本

常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至7.4(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。

2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至1.5％，高压蒸汽灭菌15min后使用。

3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。

注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。

4、2.5%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含0.5g卡那霉素。

取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。

注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。

5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。

剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。

6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。

单抗制备免疫一、材料准备：弗式完全佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）弗氏不完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant，IFA）实验动物：小鼠（Balb/c）雌性，8周以上,体重20g以上每种抗原蛋白免疫小鼠4只靶抗原：具有免疫原性的抗原或蛋白质、多肽，生理盐水抗原要求：抗原要尽量在无毒无刺激溶液中（PBS或生理盐水），纯度大于80%，浓度1mg/ml以上，总量大于2mg。

抗原尽量是可溶性抗原，溶液为PBS，如必需加入刺激物质，SDS浓度在0.5%以下，尿素在2M以下，不含咪唑，丙烯酰胺等变性剂，要求溶液澄清，无沉淀。

二、实验步骤1.抗原准备：每只小鼠按照100ug/100ul蛋白质或多肽置于生理盐水中制备成抗原。

2.抗原-佐剂的准备：将抗原液与佐剂混合制成乳状液，抗原与佐剂混合按照1：1比例进行，加入搅拌子后于4度搅拌过夜。

注射量为200ul 每只小鼠，抗原量为100ug。

第一次免疫使用弗氏完全佐剂，以后加强使用弗氏不完全佐剂，最后一次加强不加佐剂，免疫前采集阴性血做为对照，乳化因考虑损失，多计算两只小鼠的量。

乳化完全判断标准：挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否稳定，如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。

将乳状液移入1ml注射器。

3.小鼠免疫：将小鼠放在鼠笼上，拉住小鼠尾尖部，背部75%酒精消毒，针头15度角刺入小鼠皮下，挑起注射。

皮下注射共200ul，分5个点（背部皮下任意点）4.冲击免疫：如计划在免疫3d后进行细胞融合实验，则使用水相溶解的游离抗原进行直接脾脏免疫。

过程：将小鼠在固定架上固定，脾脏位置毛剪掉并消毒，快速分别剪开外皮和内皮，将脾脏拉出，吸取100ul/100ug抗原注入脾脏内，并快速用手术线分别缝合内皮和外皮。

5.小鼠阳性血清采集：尾部剪尾采血20ul，用生理盐水稀释10倍，离心收集上清。

6.效价检测：间接法检测小鼠多抗血清效价。

单克隆抗体制备细胞融合实验操作步骤脾细胞融合培养基：RPMI(500ml)：无血清和其它添加物融合培养基（无HAT）：RPMI（500ml），2mM 谷氨酰胺, 1×NEAA（非必需氨基酸），1×丙酮酸钠，15％FBS（胎牛血清），1×青链霉素溶液，1％杂交瘤克隆因子，1×OPI选择培养基－1（含1×HA T）：RPMI（500ml），2mM 谷氨酰胺，1×HAT，1×NEAA（非必需氨基酸），1×丙酮酸钠，15％FBS（胎牛血清），1×青链霉素溶液，1％杂交瘤克隆因子，1×OPI选择培养基－2（含2×HA T）：(每次融合15个板需150ml)RPMI（ml），2mM 谷氨酰胺，2×HA T，1×NEAA，1×丙酮酸钠，15％FBS，1×青链霉素溶液，1％杂交瘤克隆因子，1×OPI 脾细胞处理：1 应用无菌技术从免疫的兔子身上取出脾2 在100mm 的培养皿中，把脾浸在10ml 不含血清的RPMI培养基中（培养基需是刚从4℃冰箱拿出），并用筛网分离脾细胞。

3 转移所有的脾细胞到一支50ml的离心管中，并用10ml不含血清的RPMI培养基洗培养皿以收取更多的细胞。

4 离心使细胞沉下来，弃去上清，以20ml不含血清的RPMI培养基重新悬浮细胞，让团块下沉下来，并把不下沉的细胞转移至一支新的50ml的离心管中。

5 离心使细胞沉下来，以20ml不含血清的RPMI培养基清洗细胞。

再离心一次，以20ml 不含血清的RPMI培养基重新悬浮细胞，并计数。

6 取300×106脾细胞用于一次融合。

同用于融合的骨髓瘤细胞1 通过离心，收集融合同用的细胞2 弃去上清，并以20ml不含血清的RPMI培养基重悬以洗细胞。

再离心，以20ml不含血清的RPMI培养基重新悬浮细胞，并计数。

单克隆抗体染色方法参考（用于流式）一、基本操作流程1. 根据细胞密度，计算出5×105 细胞所要吸取细胞悬液的量，把相应量悬液加到流式管中。

1700 rpm离心5 min，弃去上清。

2. 染色（1）CD8单染：计算出本次CD8单染所需抗体的总量，1:50稀释后，往流式管加入50 μL，4℃避光孵育30 min。

（2）CD4单染：计算出本次CD4单染所需抗体的总量，抗体1:25稀释后，往流式管加入50 μL，4°C避光孵育30 min。

（3）CD8、CD4双染：计算出本次CD4、CD8双染所需抗体的总量，按照CD4:CD8:PBS=2.5:1:50比例稀释液加入到流式管中，4°C避光孵育30 min。

3. 往流式管加入1 mL PBS，1700 rpm离心5 min，去除未结合的抗体，离心后小心吸取上清。

加80~150 μL 流式缓冲液混匀上机检测，流式细胞仪分析染色结果（不超过4 h），当仪器读取到10×104个细胞数就可以分析数据。

如果暂时无法检测，避光储存在4℃。

附：96孔板染色操作步骤：1. 根据细胞密度，计算出5×105 细胞所要吸取细胞悬液的量，把相应量悬液加到96孔板中（U型孔），1700 rpm离心5 min。

2. 抗体稀释按照上述方法，每孔加50 μL抗体稀释液染色，4°C避光孵育30 min。

3. 往孔板中加入200 μL PBS，1700 rpm离心5 min，去除未结合的抗体，离心后小心吸取上清。

每孔加入80 μL流式缓冲液混匀后转移到流式管中。

备注：（1）流式缓冲液：含2% FBS和0.4% 0.5 M EDTA的PBS 溶液；（2）用96孔板板进行染色要注意不同样本要隔开2~3个孔避免交叉污染；（3）染色细胞数量为5×10 5，假设悬液细胞计数为6×106 细胞/1000 μL；（4）我们要取5÷60×1000=83.3 μL悬液才是5×105个细胞数。

v1.0 可编辑可修改常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨 10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。

2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至％，高压蒸汽灭菌15min后使用。

3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。

注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。

4、%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含卡那霉素。

取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。

注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。

5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。

剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。

6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。

常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至7.4(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。

2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至1.5％，高压蒸汽灭菌15min后使用。

3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。

注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。

4、2.5%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含0.5g卡那霉素。

取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。

注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。

5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。

剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。

6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。

单抗的制备方法1，免疫BALB/c 小鼠的免疫 BALB/c 小鼠的免疫按常规方法进行，二免后一个星期分别用断尾抽真空法采血200μL 进行抗体检测，二免采血后让小鼠休息两周进行加强免疫，三天后融合。

表1 BALB/c 小鼠的免疫方案（供参考）免疫次数 时间免疫剂量（μg/ mL ） 免疫方法 佐 剂 首免 二免 加强0d21d42d (融合前三天) 100 100 200 颈背部皮下 腹腔注射 腹腔注射 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 不加佐剂2，BALB/c 小鼠的抗体检测2.1 BALB/c 小鼠血清的制备将采集的全血样品于37℃温箱放置30min 后，4℃放置半天，待血清析出后， 4 500r/min ，离心10min ，用移液器吸出血清，4℃放置待检。

2.2 间接ELISA 法的建立BALB/c 小鼠免疫后，用间接ELISA 法对其血清抗体水平进行检测，间接ELISA 法步骤如下：包被： 4℃包被过夜。

洗板：弃去包被液，拍干，向酶标板内加入洗涤液，每孔200μL ，3～5min 后倒掉洗涤液，再拍干。

如此重复三次。

加待检血清：将血清用ELISA 洗涤液从1：10 000开始进行倍比稀释(即 1：10 000、20 000、40 000、80 000、160 000、320 000、640 000、1 280 000)，共8个浓度。

将稀释好的血清按浓度由低至高的顺序加入酶标板内，每孔100μL ，每只小鼠的血清做两列，在37℃温箱内孵育30min 。

同时设阴性血清对照。

洗板：同上。

加HRP 标二抗：工作浓度1：10 000，每孔100μL ，在37 ℃温箱内孵育30min 后，洗板三次。

显色：加底物(TMB-过氧化氢脲)，每孔100μL ，37℃温箱放置10min ，加2mol/L H 2SO 4终止显色反应，每孔50μL ，用酶标仪测定OD 450值。

结果判定：P/N ≥2，判为阳性(P 、N 分别为待检和阴性血清的OD450值)。

DNA操作系统常用液体配制标准SOP操作规程样本1、溶液 I:葡萄糖50mmol/L，EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 25mmol/L，pH8.0。

2、溶液 II:NaOH 0.2mol/L，SDS 1%，用ddH2O现配现用。

3、溶液Ⅲ:取5mol/L NaAc 60mL，冰乙酸11.5mL，混合后加ddH2O至100mL。

4、酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)以25：24：1的比例混匀平衡酚、氯仿、异戊醇，保存于棕色玻璃瓶中，上覆一层Tris-Cl水相，4℃储存备用。

5、TE缓冲液:10mmol/L Tris-Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，灭菌后使用。

实验室中配有100×的TE母液，用时可用ddH2O稀释成1×使用液，灭菌后使用。

6、0.1mol/L CaCl2:在适量纯水中溶解54g CaCl2.6H2O，定容至100mL，高压除菌后保存于4℃备用。

7、10×DNA上样buffer：母液：以500ml为例：蔗糖：200g，溴酚蓝：0.2g，取去离子水定容至500ml，完全溶解后放置于4℃保存。

*该母液配制完正常颜色为棕红色，颜色与pH值有关；存储时间较长，每次使用时需摇匀，并注意是否长菌。

染料：SYBER Green I（Molecular Probe）10,000×每次取50ul染料加入50ml母液中，充分摇匀。

分装于避光管中，即为10×DNA上样buffer，配制好的buffer均需避光4℃保存。

*配制者需督促使用者及时将避光管放回4℃，并经常检查溶液存量，染料需提前订购。

8、RNase A（DNase free）：RNase A干粉（Ameresco）溶解于0.01mol/L的CH3COONa（pH 5.2）中，使终浓度为1mg/ml，加热至100℃，15min，室温冷却。

用0.1体积的1M Tris-Cl调pH至7.4后，分装，于-20℃冻存。

单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。

无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。

2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。

3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。

再以同样的方法洗涤离心一次。

4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。

注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。

2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。

3.制备细胞悬液，计活细胞数。

4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。

注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。

➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。

➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。

小牛血清的浓度一般在10～20%。

细胞的最大密度不得超过106个/mL。

➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。

细胞的倍增时间为16～20小时。

➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。

➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。

三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。

2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。

单克隆抗体制备流程一、免疫准备1）试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂2）常用免疫原：纯化蛋白、融合蛋白、多肽。

3）耗材：1ml、2ml注射器，橡胶管，1.5ml EP管，刀片（或毛细玻璃管），酒精棉球。

4）免疫动物：小鼠（BALB/c,雌性6-8周）5）乳化器（或者手动推）二、免疫过程1）免疫前取血取血方式：酒精棉擦拭尾部后（酒精多了伤口挤压出来的血液易分散），用锋利的刀片在小鼠尾部靠近静脉处划开小口，如下图箭头所示方向从上往下挤压血管，血从伤口处流出后用枪吸取放入EP管中（30ul血够用）离心取上清放冰箱备用。

此方法取血最为简单易行，避免眼球取血毛细管扎瞎老鼠眼睛。

注意点：①避免切断老鼠尾巴②切口劲量靠近尾末端，方便挤压血管③伤口消毒酒精不要太多，不利于伤口血液凝固。

2）免疫原制备：一支2ml注射器吸抗原，另一支注射器吸等量体积佐剂，橡胶管连接两支注射器来回推几下混匀，然后放乳化器上乳化（为防止蛋白变性，乳化器上可放置冰袋），大约来回推1500次左右可乳化完全（滴一小滴到静水中若不扩散说明乳化完全）。

换上1ml注射器针头免疫小鼠（2ml注射器免疫不好控制，可将乳化液转移到1ml注射器中免疫，但这样会损失部分抗原）。

注：①每只老鼠免疫蛋白量10-100ug,初次免疫参考量50ug蛋白/只，加强免疫及融合前冲击免疫25ug蛋白/只。

初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前冲击免疫不使用佐剂可用缓冲液如PBS等稀释抗原（如果需要）。

②免疫量100ul-300ul/每只小鼠。

③多点免疫，一针不要打太多。

3）免疫方式和免疫时间根据免疫原决定免疫方式，皮下免疫和腹腔注射较为常见(纯化蛋白、融合蛋白多肽)。

皮下注射免疫，免疫时间间隔为2周，第三次免疫一周后（8-10d）采血测效价，决定是继续加强免疫还是冲击免疫后做融合。

较好的效价应该在10W以上，附表1 免疫接种时间表天数操作佐剂免疫方式0 初次免疫CFA 皮下14 第二次免疫IFA 皮下28 第三次免疫IFA 皮下36-38 收集血清测效价＿＿42 第四次免疫（如果需要）IFA 皮下50 收集血清测效价＿＿52 融合前冲击免疫＿腹腔55 收获脾细胞和融合＿＿注：如果第四面免疫血清效价仍然达不到要求可以继续加强免疫，如果免疫超过6次仍然达不到要求免疫基本失败。