病毒TCID50测定方案

tcid50法TCID50法是一种常用的病毒感染力测定方法，用于评估病毒的感染力和浓度。

TCID50法全称为50%细胞传染病毒感染量法，是通过观察细胞感染情况来确定病毒的感染量。

下面将介绍TCID50法的原理、步骤和应用。

一、原理TCID50法是通过连续稀释病毒悬液，将其与细胞共培养，观察细胞感染情况，最后根据感染阳性和阴性的比例计算病毒的感染量。

具体原理如下：1. 取一定量的病毒悬液，进行连续稀释。

2. 将不同稀释度的病毒悬液与细胞共培养。

3. 观察培养后的细胞，根据细胞的感染情况判断阳性和阴性。

4. 根据阳性和阴性的比例，使用统计学方法计算出病毒的感染量。

二、步骤TCID50法的操作步骤如下：1. 准备好所需的培养基、细胞和病毒悬液。

2. 进行病毒的连续稀释，一般为10倍稀释。

3. 将不同稀释度的病毒悬液分别与细胞共培养，通常为96孔板形式。

4. 培养一定时间后，观察细胞的感染情况，记录阳性和阴性的孔数。

5. 根据阳性和阴性的比例，使用统计学方法计算出病毒的感染量。

三、应用TCID50法广泛应用于病毒学研究和生物制品生产中，具有以下几个方面的应用：1. 评估病毒的感染力：通过TCID50法可以确定病毒的感染力大小，对于病毒学研究和防控具有重要意义。

2. 测定病毒的浓度：通过TCID50法可以估算病毒的浓度，为病毒制备和应用提供参考。

3. 监测疫苗效果：通过TCID50法可以评估疫苗的效果，判断其对病毒的抑制作用。

4. 生物制品质量控制：TCID50法可以用于生物制品的质量控制，保证产品的安全有效性。

总结：TCID50法是一种常用的病毒感染力测定方法，通过观察细胞的感染情况来评估病毒的感染量。

其原理简单易懂，步骤清晰明了。

TCID50法在病毒学研究和生物制品生产中具有重要应用价值，可以评估病毒的感染力和浓度，监测疫苗效果，并用于生物制品的质量控制。

通过TCID50法的应用，可以更好地了解和控制病毒的感染过程，为病毒学研究和疫苗生产提供科学依据。

TCID50的测定：材料：RPMI-1640 含10% NCS；PBS或蒸馏水（灭菌）；C8166细胞；病毒培养上清;96孔细胞培养板；200μl加样头；加样盒；加样槽；方法：1、选择HIV敏感的细胞进行滴定，病毒上清可以保存在-70℃待用，可以以1.5ml/只的装量大量保存。

2、准备96孔板，但只用中间的60个孔，若病毒滴度高，则准备两块板。

3、每块板准备5ml R-10培养液，培养液中含4×105/mlC8166细胞4、在第一列的六孔中加入133μl R-10培养液，在2-10列中每孔加入150ul R-10培养液5、室温溶解病毒上清并立即加67μl到第一列的每个孔中，第一列的六个孔成为1：3稀释的上清，然后，用排枪将其混匀，每孔吸50μl到第二列的六个孔中，注意混匀6、换掉枪头，再吸50μl到第三列的六个孔去，依次类推7、继续做每一列的四倍稀释，右边第十列的六个孔，每孔丢弃50μl，总之，每孔应有150μl培养液8、重悬C8166细胞，装在无菌器皿中（加样槽），用排枪按50μl/孔加入C8166细胞悬液，（加细胞时从右向左即从低浓度相高浓度加），每次加细胞是要确定细胞悬液已混匀9、铺完板后，用倒置显微镜观察，确定每孔都加入了细胞10、加入灭菌蒸馏水到周围孔防止边缘效应11、37℃，5% CO2培养箱孵育12、每天观察CPE的形成13、第四天，取上清100μl14、从右至左加入100μl R-2015、培养两周，直到CPE不再形成16、对每个病毒稀释度的CPE形成孔数计数17、用Reed和Muench的方法进行计算TCID50MOI=TCID50×病毒体积/细胞数TCID50计算：举例感染未感染总感染数总未感染数感染率4-7 6 0 13 0 1004-8 4 2 7 2 77.84-9 3 3 3 5 37.54-10 0 6 0 11 0X=（77.8-50）/（77.8-37.5）=10-5.23105.23TCID50/50μl =XTCID50/1ml X即为所滴定病毒的TCID50。

查看文章病毒TCID50测定（组织半数感染量）方法步骤2009-11-27 21:50操作步骤(1) 准备细胞取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。

每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。

细胞对照选取16个孔即可。

滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。

也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。

(2) 稀释待测病毒液。

A法为参考书上标准的操作方法B法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。

A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。

向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。

B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。

首次滴定可以多稀释几个滴度。

根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1为50µl 加入450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100µl加入900µl 孵育液中。

若接种8个孔，则相应增加液体量。

上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。

【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。

2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。

2）此过程中需要使用加样器和tip头。

使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。

使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。

】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。

病毒TCID50测定（组织半数感染量一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。

二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100μl。

3、在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2~3×105个/ml。

4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。

（100μl生长液+100μl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法五、TCID50的计算方法1、Reed-Muench两氏法咱们一般情况下用这个计算病毒的TCID2、Karber法含义：将该病毒稀释103.875接种100μl可使50%的细胞发生病变。

操作步骤(1) 准备细胞取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。

每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。

细胞对照选取16个孔即可。

滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。

也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。

病毒TCID50测定操作步骤(1) 准备细胞取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。

每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。

细胞对照选取16个孔即可。

滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。

也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。

(2) 稀释待测病毒液。

A法为参考书上标准的操作方法B法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。

A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。

向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。

B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。

首次滴定可以多稀释几个滴度。

根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1为50µl加入450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100µl加入900µl孵育液中。

若接种8个孔，则相应增加液体量。

上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。

【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。

2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。

2）此过程中需要使用加样器和tip头。

使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。

使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。

】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。

将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。

TCID50测定方案20121123391 简介TCID50(Tissue Culture Infective Dose)，半数组织培养感染量，又称50%组织细胞感染量，指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(Cytopathic effect，CPE)的病毒量。

将不同稀释度的病毒接种到96孔板上培养的单层细胞上。

观察细胞病变，待细胞不再病变时记录每个稀释度出现病变和未出现病变的孔数，按照Reed-Muench公式计算TCID50值。

2 试剂试剂来源保存条件DMEM-basic培养基Gibco，上海4℃保存胰蛋白酶Gibco，-20℃冻存胎牛血清Fetal bovine serum Hyclone，-20℃冻存PBS Hyclone，-20℃冻存3 仪器与耗材仪器规格耗材规格CO2培养箱细胞培养瓶25cm2生物安全柜无菌离心管15mL，50mL倒置显微镜一次性移液管1mL，2mL，5mL，10mL显微照相系统细胞培养板96孔高速冷冻离心机电子天平移液器液氮罐电冰箱4 细胞及培养基DF-1细胞株细胞生长液（500mL）：20%FBS（胎牛血清）+1%双抗（青链霉素）+剩余用DMEM100mL 5mL 395mL细胞维持液（50mL）：1%双抗（青链霉素）+ DMEM（无血清）+1%FBS 0.5mL49mL 0.5mL细胞冻存液（50mL）：70%DMEM-basic + 20%FBS + 10%DMSO35mL 10mL 5mL4℃保存备用5 病毒株及培养方法禽流感病毒（Avian influenza virus ，AIV），H5N1株；禽白血病病毒（Avian leukosis virus ，ALV），HPRS-103株；禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus ，IBV），H52株；禽传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus ，IBDV），B87株。

病毒TCID50测定之公保含烟创作把持步伐(1) 准备细胞取出一块细胞培养板，每个孔年夜约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）.每个孔的细胞铺成单层年夜约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）.细胞对照选取16个孔即可.滴定与对照可以在一块培养板上停止，把持中注意不要窜孔.也可以辨别在分歧的细胞培养板上停止，但要担保实验条件一致.(2) 稀释待测病毒液.A法为参考书上标准的把持办法B法参照书将液体量增加后的后果病毒稀释液依据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清.A向每支试管中参加释液.向1号试管中参加0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管.B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，依据病毒年夜致的滴度确定稀释的倍数.首次滴定可以多稀释几个滴度.依据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1为50µl参加450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100µl参加900µl孵育液中.若接种8个孔，则相应增加液体量.上述的配液其实不是固定不变的，可以依据接种的量自行调整.【！此步把持注意事项：1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计剖析则还要增加至16个孔.2）病毒稀释进程中一定将病毒液与孵育液充沛混匀.2）此进程中需要使用加样器和tip头.使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌.使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或平安柜中翻开）.】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能搅扰病毒的吸附）.将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，依据察看的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样.【切记：设置正常的细胞对照.每次实验要重复4次，计算标准差.】37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），参加维持液200µl持续在37℃ CO2培养箱中培养.(4) 培养将培养板放置于CO2培养箱.培养温度，培养天.(5) 测定后果取出培养板，显微镜下察看细胞病变.计算办法1) Spearman-Karber 法LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + d×∑R1/N1）X0 = 全部病变最低稀释度对数d = 稀释因数对数N1 = 每个稀释度所种的孔数R1 = 病变孔数∑ = 积和2) Reed-Muench法察看CPE,找出能引起对折细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50TCID50 是指组织培养物（细胞）对折致死计量.它有几特性质我们必需理解?理睬：1）它暗示的是计量，不是浓度；2）它是一个单元；3）它的值等于1，实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说出的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1.了解这三特性质关于了解TCID50十分重要，然则这三特性质常常被误解，所以招致对TCID50的了解呈现偏差.首先我们来看一下这个暗示法的意思：病毒浓度为它暗示的是每个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为个mol的氯化钠是一样的事理.常常可以听到人说我的病毒的TCID50是10^xx.这个说法是不迷信的，应该说我这个溶液里含有多少个TCID50的病毒或许说我这个溶液的病毒溶度是xxTCID50/ml.了解了TCID50的概念之后，我们再来看看TCID50是如何计算的？请看例子：每个所加液体的体积是0.08ml.图中给出的计算办法是有问题的，请先疏忽不看.从图中我们可以知道对折致死的稀释度一定是介于10^-6到10^－7之间，一定可以暗示成10^-6.xx.那么这个.xx到究竟是多少呢？这实际上是一个线性插值的问题.求解见下图：PD/[log(dilution above 50%)-log(dilution below 50%)]=[(%next above 50%)-50%]/[(%next above 50%)-(%next below 50%)]＊注意：如果你的病毒是以3倍3倍地稀释那么上面这个公式的log就应该是以3为底的log，其他稀释度与此相相似.在本例子中PD/[(-6)-(-7)]=(80%-50%)/(80%-0%)log(50％的致死的稀释度求解失掉50％的致死的稀释度为依据TCID50的定义，就把这个稀释度所含的病毒的量定义为1个TCID50.在本例中即定义把病毒稀释到为1个TCID50.接下来我们就可以依据这个定义来求原液的病毒溶度.通常求解每ml含有多少个TCID50的病毒.我们先要来求解这个问题：已知把病毒稀释到为1个TCID50，那么病毒原液直接取个TCID50.很显然个TCID50.再求解1ml有多少个TCID50就复杂了：设1ml这样的病毒原液就有x个TCID50x=10^6.375/0.08=2.9*10^8所以每ml这样的病毒原液有2.9＊10^8个TCID50，即该病毒原液的溶度为2.9*10^8TCID50/ml[如果关于上面我说的“很显然“你一时显然不起来的话，我可以帮你举这样的一个例子：你把溶度未知的DNA溶液稀释100倍(即稀释到10^-2稀释度测0D值后果发现这释液含有1个ug的DNA，那么很显然可以知道如果直接取应该含有100ug 的DNA，该DNA 溶液的溶度为100ug/0.080ml=1250ug/ml.如果你还很显然不起来的话，建议你不要从事和理工科相关的任务，你可去当总统什么的，千万别当财政部部长！]说明：我们已经证实，TCID50法测到的滴度d=log10值比标准空斑法高0.7.将TCID50/ml转换为PFU/ml：T=1×108.3 TCID50/ml=1×108.3-0.7 PFU/ml=1×107.6 PFU/ml≈4×107 PFU/ml.两次重复试验失掉的滴度值应相差个log10值（100.7）. MOI 是multiplicity ofinfection的缩写，中文译为感染单数.传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究.其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量.噬菌体的数量单元为pfu.一般认为MOI是一个比值，没有单元，其实其隐含的单元是pfu number/cell。

TCID50可用Reed-Muench法、内插法、或Karber1、Reed-Muench法将病毒液在灭菌小试管内作连续的10倍稀释,即用1ml吸管吸取0.2ml病毒液,加入已装有1.8ml的hanks液或earle液的第一支小试管内,将混合液充分振荡,并另换1支新的1ml 吸管,吹打混合后,吸取0.2ml移入第二管1.8ml的hanks液管中,更换吸管,如上充分振荡和吹打混匀后,再吸取0.2ml移于第三管。

连续如此操作,即可作成连续的一系列10×稀释液。

吸取每一稀释度的病毒液0.1ml,加入于小试管内已长成单层的敏感细胞培养物中,每个稀释度的病毒液接种4-10个细胞管。

于37℃旋转或静置培养,逐日观察（一般需7-10天左右）,直至终点,也就是看到能够引起病毒增殖（根据细胞病变或血凝素测定等）的病毒最高稀释度。

按表14-2所举例子（每个病毒稀释液接种8个细胞管）计算TCID50数分别列于第四和第五列（根据箭头所示方向）,第六列为细胞管总数,第七列为出现细胞病在10-3（91.6％）和10-4（40％）变的细胞管数占细胞管总数的百分率。

可见该病毒株的TCID50之间,其确切稀释倍数可按下列公式计算：91.6（高于50％的百分数）-5091.6（高于50％的百分数）-40（低于50％的百分数）＝41.6/51.6＝0.8应是0.1ml 将由上式获得0.8加在高于50%死亡的稀释度的对数（3）上,因此该病毒的TCID50。

10-3.8稀释的病毒液。

查反对数得6310,即该病毒6310倍稀释液0.1ml等于1个TCID502、内插法在计算出表14-2第七列,即出现细胞病变的细胞管数的基础上,也可按内插法计算：91.6（高于50％的百分数）-40（低于50％的百分数）50（半数量的比率）-40（低于50％的百分数）＝（相应的病毒液稀释度的对数）-（-4）（40％相应的病毒液稀释度的对数）/TCID50的对数-（-4）（40％相应的病毒液稀释度的对数）解上式得TCID的对数为0.8,结果与Reed-Muench503、Karber法按表14-3及5 Karber公式计算TCID效价：50s＝阳性管比率总和。

病毒TCID50测定操作步骤(1) 准备细胞取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。

每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。

细胞对照选取16个孔即可。

滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。

也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。

(2) 稀释待测病毒液。

A法为参考书上标准的操作方法B法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。

A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。

向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。

B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。

首次滴定可以多稀释几个滴度。

根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1为50µl加入450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100µl加入900µl孵育液中。

若接种8个孔，则相应增加液体量。

上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。

【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。

2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。

2）此过程中需要使用加样器和tip头。

使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。

使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。

】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。

将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。

病毒TCID50测定病毒TCID50 测定操作步骤(1) 准备细胞取出⼀块细胞培养板，每个孔⼤约传8000?10000个细胞(⼀个T25瓶的细胞消化后加10ml 培养液正好传⼀块96 孔板，要传匀)。

每个孔的细胞铺成单层⼤约60 ％丰度即可接种病毒(下午传好板第⼆天早上就能⽤)。

细胞对照选取16 个孔即可。

滴定与对照可以在⼀块培养板上进⾏，操作中注意不要窜孔。

也可以分别在不同的细胞培养板上进⾏，但要保证实验条件⼀致。

(2) 稀释待测病毒液。

A 法为参考书上标准的操作⽅法B 法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，⽆论哪种都⽆⾎清。

A 向每⽀试管中加⼊1.8ml 病毒稀释液。

向1 号试管中加⼊0.2ml 病毒，依次10 倍系列稀释⾄适宜浓度，最后⼀⽀试管。

B在EP管中⽤⽆⾎清的孵育液10倍倍⽐稀释病毒原液(10-1 , 10- 2…10-10等)，根据病毒⼤致的滴度确定稀释的倍数。

⾸次滴定可以多稀释⼏个滴度。

根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500⼝l，即10-1 为50 ⼝1加⼊450⼝1的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100⼝1加⼊900^1孵育液中。

若接种8个孔，则相应增加液体量。

上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量⾃⾏调整。

【！此步操作注意事项：1)建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加⾄16 个孔。

2)病毒稀释过程中⼀定将病毒液与孵育液充分混匀2）此过程中需要使⽤加样器和tip头。

使⽤前⽤75%⼄醇擦拭加样器，并⽤紫外线照射20min ，确保⽆菌。

使⽤新⾼压的tip 头，外包装⼀定在超净台（或安全柜中打开）。

】（3）接种取细胞培养板，⽤多道加样器（⼜称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打⼀次，然后吸出孵育液（此步⽬的是去除⾎清，因为⾎清能⼲扰病毒的吸附）。