纤维素酶产生菌的分离和筛选专业大实验

农家参谋科技研究-220-NONG JIA CAN MOU高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用概述王琪（河南师范大学生命科学学院，河南新乡，453007）【摘 要】纤维素作为自然界最丰富的可再生资源之一，具有易获得、廉价等优点。

近年来，随着全球经济的迅速发展，能源消耗巨大，地球环境遭到严重破坏；因此，寻找可再生的清洁能源迫在眉睫，所以高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用得到了人们广泛的关注，也是当今微生物学、农业科学、生态学的研究热点。

本文对之前高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用的研究进行进行整合归总，展望今后的研究方向。

【关键词】高产纤维素；酶菌；筛选；鉴定1 高产纤维素酶自然界中纤维素广泛存在，但是降解过程生产成本高、环境污染问题，效果不理想。

经大量研究发现，纤维素酶是酶的一种，能够有效降解纤维素。

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。

细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶，所以近年来各界学者致力于筛选及鉴定高产的纤维素酶菌的研究。

2 高产纤维素酶的筛选与鉴定经查阅资料与分析，从一定地区取样如：土样、常年堆积干枯腐败植物茎秆、东亚飞蝗肠道内等；取一定量样品在三角瓶中富集培养；先梯度稀释，然后通过常规的稀释法或划线法接种涂布于马铃薯平板与牛肉膏蛋白胨分离培养基之上，37℃恒温培养24d,菌落计数,然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落,重复划线接种于相应的琼脂平板上,直至纯化得到单菌落。

根据菌落形态观察，保存不同种的菌落，利用牙签蘸取菌落，放入离心管进一步富集；之后取富集液滴在圆形滤纸片上然后分别接种与刚果红培养基，保持对应关系，进行培养；继而用游标卡尺测量菌落周围水解透明圈的直径,并以其大小作为初步判断分解能力的指标；接下来把筛选出的菌株用单染色法、复染色法和指纹代谢法进行初步确定菌株类别；最后用16SrDNA 鉴定，通过PCR 电泳比对后送公司进行测序；确定菌株后进行酶活测定以及优化其酶活力的条件探究。

目前经大量实验，从陕北花马盐湖分离得到一株黑曲霉Aspergillusniger6MA1，发酵条件优化后酶活可达到47.8U/mL；从常年堆积干枯腐败植物茎秆中筛选出一株肠杆菌属Enterobactersp，在未进行发酵条件优化的情况下酶活达到为0.44u/mL；从湿润木屑中分离和筛选获得１株高产纤维素酶目的菌株ＬＹＷ－１等。

一株纤维素高效分解性细菌的分离和筛选的开题报
告
选题意义：
纤维素是植物细胞壁中最主要的成分，也是地球上最丰富的可再生
能源之一，其含量达到全球植被的40%以上。

但纤维素的高结晶度和难
降解性，使其无法被直接利用。

纤维素高效分解性细菌可以通过生物方
法将固体废弃物、能源作物等转化为生物质燃料和有机酸，具有被广泛
利用的潜力。

因此，本实验旨在筛选出纤维素高效分解性细菌，为纤维
素的利用提供理论基础和技术支持。

实验方法：
1. 样品的原料：从自然环境中采集土壤、水体等样品，用0.9% NaCl溶液过滤。

2. 样品的分离：分别取10μL、100μL等不同的样品，平板涂布在含有纤维素的LB琼脂平板上，并在30°C下孵育48-72小时。

3. 筛选纤维素分解性细菌：通过碘酸钾和怀尔德染色法筛选出纤维
素分解性细菌。

4. 纤维素水解酶产酶活呼吸速率测定：取纤维素分解性细菌培养物，分别在含有纤维素、葡萄糖和对照培养基中培养，同时进行产酶活和呼
吸速率的测定。

预期结果：
通过本实验可以得出纤维素高效分解性细菌的特点和产酶酶活呼吸
速率等重要性质，为纤维素的利用提供理论基础和技术支持，对环境保
护和资源利用具有重要意义。

产纤维素酶霉菌的分离和筛选班级:09生物技术指导老师：黄志华组别: 第五小组组员：吴志娟、戴剑鹤、柯佳宝、潘凯仑、王志辉（24-29号）组长：吴志娟一．实验目的1.进一步复习生物化学、微生物学等相关专业知识。

2.掌握产纤维素酶细菌的筛选、纯化和保藏的方法。

3.学会设计实验计划。

4．综合培养动手操作能力及创新精神。

二. 实验原理纤维素（cellulose）作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源, 探索纤维素资源的有效利用方法具有重要的意义。

纤维素酶的来源很广泛，自然界中能产生纤维素酶的物种非常多。

在过去的半个世纪内，人们在各种原生动物、圆虫类、软体动物、甲壳类、昆虫、藻类、真菌类、细菌及放线菌中都发现了纤维素酶，近年来陆续在古菌中也发现很多纤维素酶的存在，但微生物是纤维素酶的主要来源，其中主要有真菌（霉菌）、细菌和放线菌。

菌种采集:产纤维素酶霉菌的采集选择在纤维素含量较高的地方，如花园表层土壤、腐烂的木头、造纸厂废水及反刍动物的瘤胃及其排泄物等。

本次实验拟从森林土中获得产酶菌株。

采样的土层太深则厌氧菌占优，而浅层土受紫外线照射，细菌难以存活。

故实验选取距表层土壤8cm处的土壤进行筛选。

纤维素刚果红培养基筛选菌种的原理：通过刚果红鉴定板来鉴定产纤维素酶霉菌是一种快速简便的筛选方法,透明圈直径和鉴定板孔径大小的比值能够直接反映该霉菌产纤维素酶的能力,其原理是刚果红是一种能够和大分子多糖相结合的染色剂,染色之后能和纤维素结合形成红色,产纤维素酶霉菌在培养基平板上培养后产的生纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖和纤维二糖等小分子糖,在用刚果红染色之后没有被水解的纤维素能够和刚果红结合显红色,而水解的部位则不能和刚果红结合而出现透明圈。

三．实验器材与试剂1.样品：后山植物林地土壤，于地下8cm左右。

2.培养基：（1）富集培养基：配制查氏培养基的原料（硝酸钠2g 、磷酸氢二钾1g 、硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g、氯化钾0.5g 、硫酸亚铁0.01g 、蔗糖30g 、琼脂15~20g 加水1000mL、pH 自然）及链霉素。

纤维素酶高产菌株的分离筛选基地一班王木兰 201630123017一、研究意义21世纪，人类面临的最主要的挑战就是资源与环境问题，生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用产物达1.5x1011 ~2.0x1011t，是人类赖以生存的基本物质来源，其中纤维素是地球上最丰富的物质之一，然而这部分资源尚未得到充分开发利用，目前主要用于燃料、畜牧饲料与积肥，利用率低，对环境污染严重。

纤维素酶的研究为纤维素更有效利用开辟了一条新途径，纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，根据其作用方式可分为外切β-1，4-葡聚糖苷酶、内切β-1，4-葡聚糖苷酶和β-1，4-葡萄糖苷酶3类，在这三种酶协同下，纤维素最终被完全降解为葡萄糖。

研究表明纤维素酶在食品、饲料、医药、纺织和造纸等领域有广阔的应用前景。

利用纤维素酶降解天然纤维素，对于解决世界环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。

但目前纤维素酶的生产存在着酶活力低，生产周期长等问题，还未能真正应用于大规模工业生产，因此选育具有高酶活的纤维素分解菌株成为关键之一。

二、国内外研究动态目前获得纤维素酶高产菌株主要是通过自然界选育、诱变育种以及利用基因工程技术改造菌株。

其中，研究较多的是通过对已知纤维素产生菌进行诱变，以增加产酶微生物菌种，提高酶活力。

迄今为止，产纤维素酶能力最强的是里氏木霉，它是产纤维素酶和半纤维素酶最主要的工业生产菌种，国内外已有很多这方面的报道，1971年，Mandels等通过绿色木霉QW60获得了产酶活力提高一倍的QW9123；上海植生所纤维素酶组采用野生木霉As3.3002和拟康氏木霉，经物理、化学诱变，获得了高活力的菌株Ea3-967和N2-78。

纤维素酶基因克隆的研究始于20世纪70年代末，自1982年Whittle等人首次报道Cellulomonas fimi的纤维素酶基因被克隆以来，人们不断从细菌和真菌中发现分离纤维素酶系，迄今为止，据报道已经有近100多纤维素酶及木聚糖酶基因都可在大肠杆菌中克隆表达。

纤维素酶是一种多组分的复合酶系，由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三种组分组成。

由于纤维素在自然界广泛分布，很多细菌、放线菌、酵母和霉菌都具有降解纤维素的能力。

此前纤维素降解菌的研究多以霉菌为主，而对细菌的研究着力较少。

近年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，通过细菌发酵生产纤维素酶制剂已显示出良好的应用前景。

本文拟从土壤中筛选出产纤维素酶的细菌并进行初步鉴定，以期为纤维素酶制剂的生产提供可能的细菌菌种。

一、材料与方法1.材料（1）土壤样品。

从南京科技职业学院校园小树林堆放枯枝和落叶处采集腐殖土土样，五点取样，混匀，放入无菌的袋中备用。

（2）富集培养基。

牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，加水至1000mL，调pH7.0-7.2。

（3）初筛培养基。

羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5g，(NH4)2SO44g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨1g，琼脂15g，加蒸馏水至l000mL，pH自然。

（4）复筛培养基。

CMC-Na 2g，(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，刚果红0.4g 琼脂15g，加蒸馏水至l000mL，pH自然。

（5）液体发酵培养基。

CMC-Na 10g，蛋白胨10g，酵母粉10g，NaCl 5g，KH2PO4 1g，加蒸馏水至l000mL，灭菌后用无菌Na2CO3溶液调pH至10。

2.方法（1）土壤细菌的富集。

称取土样10g，放入装有玻璃珠和90mL无菌水的锥形瓶中，充分振摇。

取5mL悬液放入含45mL富集培养基的250mL锥形瓶中，37℃，150r/min振荡培养一昼夜。

（2）初筛培养基稀释涂布。

将富集后的土壤细菌培养物进行梯度稀释，取10-4,10-5,10-6三个稀释度各0.1mL于初筛培养基平板上进行稀释涂布，37℃倒置培养一昼夜，得到单菌落。

从土壤中分离产几丁质酶的真菌作者：王春学号:11101680摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株.1 材料与方法1.1 培养基1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.(2)纯几丁质培养基:胶体几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂1.2 菌株的分离1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h.1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养.1.3 菌种的鉴定1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r・min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用.1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’.1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水12.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol・L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol・L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol・L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU・L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min.1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果.1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到pMD182T上,送北京奥科生物公司进行测序.然后,将测序结果通过GeneBank进行BLAST序列比对,得出结果参考文献[1] BROGLIEKE.Chitinaseandplantprotection[J].RevPlantPathol,1993,2:4112421.[2] 李力,黄胜元,关雄.产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究[J].中国病毒学,2000,15(51):94297.[3] CHANGYu2cheng,YANGChiyea,LIChin,etal.IdentificationofBacillussp,Escherichiacoli,Salmonellasp,StaphylococcusspandVibriospwith16SribosomalDNA2basedoligonucleotidearrayhybridization[J].Internation2 alJournalofFoodMicrobiology,2006,107:1312137.[4] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验技术[M].北京:高教出版社,1997:1112116.[5] MOOREER,KRUGERAS,HAUBENL,etal.16SrRNAgenesequenceanalysesandinter2andintragenericre2lationshipsofXanthomonasspeciesandStenotrophomonasmaltophilia[J].FEMSMicrobiolLett,1997,151(2):1452 153.[6] MIYAJIT,OTTAY,SHIBATAT,etal.PurificationandcharacterizationofextracellularalkalineserineproteasefromStenotrophomonasmaltophiliastrainS21[J].LettApplMicrobiol,2005,41(3):2532257.[7] MADHA VAPNK,BAIJUTV,SANDHYAC,etal.ProcessoptimizationforantifungalchitinaseproductionbyTrichodermaharzianum[J].ProcessBiochem,2004,39:158321590.[8] NAWANINN,KAPADNISBP.Optimizationofchitinaseproductionusingstatisticsbasedexperimentaldesigns[J].ProcessBiochem,2005,40:6512660。

纤维素酶产生菌的分离和筛选方案目标：从自然界采用选择性分离的方法，获得纤维素酶的高产菌株。

意义：把含纤维的自然资源及纤维废料加以充分利用，转化成糖类作为食品工业和发酵工业的原料或制成优质饲料，具有深远的现实意义。

1.材料与方法1.1材料与仪器1.1.1原辅料土壤品来自南阳理工学院以下各处离地表3-8cm深处泥土装入塑料瓶中，带回实验室处理。

（1）新校区竹林腐叶下的土壤（2）校门口东边的松树林腐叶子下的土壤（3）青年公寓外小树林（4）2号教学楼后面花园的土壤1.1.2试剂羧甲基纤维素CMC、NaCl、MgS04·7H20、KH2P04、酵母浸粉、蛋白胨、蒸馏水、琼脂、Na2HP04、酵母膏、刚果红试剂。

1.1.3仪器小铁铲和无菌纸或袋（可省）、小烧杯、100ml量筒、滤纸、漏斗、棕色试剂瓶、1000ml三角烧瓶1个、500ml三角烧瓶1个、试管24个、高压蒸汽灭菌锅、培养皿24个、36支1mm无菌吸管、无菌玻璃涂棒12支、显微镜、无菌水。

1.2培养基及试剂的配制1.2.1培养基配制初筛培养基A：羧甲基纤维素CMC 20g、NaCl 5．0g、MgS04·7H20 0．2g、KH2P041．0g、酵母浸粉 5.0g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL、琼脂20g，pH自然，121℃湿热灭菌20min。

复筛培养基B：CMC 10g、Na2HP04 1.25g、KH2P040.75g、MgSO4·7H2O 0.1g、蛋白胨1.25g、酵母膏O.25g、蒸馏水500mL、琼脂10g，pH自然，121℃灭菌20min。

2.2.2试剂配制1％刚果红试剂：称取刚果红试剂1g于干净的小烧杯中，用量筒量取蒸馏水100ml使之溶解，过滤，贮于棕色试剂瓶中。

2.3方法2.3.1初筛的方法步骤(1)配初筛培养基A，灭菌，倒平板。

(2)用稀释涂平板的方法分离纤维素分解菌。

稀释涂布平板法步骤：A．倒平板将配好的琼脂培养基溶化，待冷至55—600C时，用右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶盖，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，瓶口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。

纤维素酶产生菌的筛选\鉴定和产酶条件优化摘要:采用稀释平板法分离马铃薯瓢虫肠道菌,利用刚果红平板法对产纤维素酶菌株进行初筛,选取透明圈较大的菌株进行摇瓶发酵复筛,根据菌株形态､生理生化特征对菌株进行初步鉴定,通过正交法优化产酶条件｡结果表明,经初筛和复筛得到1株酶活相对较高的菌株B-12,经初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡1.25%麦芽浸粉为碳源､1.5%KNO3为氮源､0.2%的NaCl､0.1%的CMC-Na､接种量6%､培养时间44 h为B-12产酶的适宜条件｡优化后发酵液中的内切葡聚糖酶活(CMCA)为111.710 U/mL,较培养44 h后的酶活提高了8.78%;滤纸酶活(FPA)为35.017 U/mL,提高了387.23%;β-葡萄糖苷酶酶活(BGL)为116.799 U/mL,提高了700.38%｡关键词:马铃薯瓢虫;肠道菌;纤维素酶;优化Screening,Identification and Cultural Condition Optimization of Cellulase-producing Strains from the Intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata Abstract: The bacteria from the intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata were isolated through the pour plate method. They were preliminarily screened using Congo red medium plate method, and then screened according to their cellulase activities by flask shaking fermentation method. The strain was identified based on morphological and physiological characters. In addition, the culture substrates and fermentation conditions were optimized by orthogonal experiment method. A high cellulase-producing strain B-12 was screened from the intestine of H. vigintioctomaculata and it was identified as Bacillus sp.. The best culture conditions were as follows: substrate were 1.25% malt meal, 1.5% KNO3, 0.2% NaCl, and 0.1% CMC-Na, inoculation quantity was 6%, culture time was 44 h. In this condition, the enzyme activity of CMCase, filter paper enzyme (FPA), and β-glucosidase (BGL) were 111.710, 35.017, and 116.799 U/mL respectively, which were 8.78%, 387.23% and 700.38% higher than those of the initial strain respectively.Key words: Henosepilachna vigintioctomaculata; intestinal bacteria; cellulase; optimization地球上的生物资源主要来自光合生物,其中90%以上为木质纤维素类物质,它们代表了生态系统中营养金字塔最庞大的基层[1]｡天然的木质纤维素材料含有纤维素､半纤维素和木质素等｡其中纤维素是地球上最丰富的多糖物质,这类物质是植物细胞壁的主要成分,也是地球上最廉价的可再生资源｡另外,人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素[2]｡目前,人们对纤维素的降解和利用主要通过纤维素酶的分解来实现｡纤维素酶在再生能源利用方面具有广阔的应用前景,可应用于农业､酿造工业､发酵工业､食品工业以及其他领域[3-9]｡因此研究纤维素酶有着十分重要的意义｡昆虫肠道菌是指能定植于昆虫肠道的微生物,包括土著的昆虫肠道菌和能定植于昆虫肠道环境的微生物[10]｡研究表明一些昆虫肠道菌能帮助昆虫消化食物[10]｡对喜食含纤维素食物的昆虫,我们推测其消化纤维素可能与其肠道菌分泌纤维素酶有关｡马铃薯瓢虫主要为害茄科植物,喜食茄科植物叶片,它消化叶片中的纤维素可能与其肠道菌有关｡本试验从马铃薯瓢虫肠道中分离筛选产纤维素酶菌株并对其产酶条件进行优化,旨在为发现新的纤维素酶高产菌株奠定基础｡1材料与方法1.1材料1.1.1菌株采自浙江省金华市婺城区高村附近马铃薯田地的马铃薯瓢虫肠道中的菌株｡1.1.2培养基①菌种保藏培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.30%,蛋白胨1.00%,NaCl 0.50%,琼脂 1.50%~2.00%,pH值7.4~7.6)｡②初筛培养基:米糠2.00%,NaCl 0.10%,K2HPO4 0.50%,MgSO4·7H2O 0.02%,(NH4)2SO4 0.06%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡③刚果红纤维素鉴定培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)0.30%,NaCl 0.50%,牛肉浸膏0.15%,蛋白胨0.50%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡④种子培养液:酵母膏 1.00%,蛋白胨 1.00%,NaCl0.50%,CMC-Na 0.50%,pH值7.0~7.2｡⑤液体产酶发酵培养液:配方同种子培养液｡⑥鉴定用培养基:糖发酵试验培养基､葡萄糖蛋白胨水培养基､蛋白胨水解培养基､Simons氏柠檬酸盐培养基､明胶水解试验培养基等｡1.1.3主要试剂葡萄糖､pH值4.6的醋酸缓冲液､DNS､2% CMC-Na底物溶液､0.05%水杨苷的醋酸缓冲液､蛋白胨､牛肉膏等｡1.1.4主要仪器立式电热压力蒸汽灭菌锅,上海中安医疗器械厂生产;LRH-250生化培养箱,上海一恒科技有限公司生产;D-78532台式冷冻离心机,德国Hettich 公司生产;UV-7504紫外可见分光光度计,上海欣茂仪器有限公司生产;SW-CJ-1B 型单人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司生产;电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产;HH-4数显恒温水浴锅,山东鄞城科源仪器设备厂生产;远红外快速恒温干燥箱,上海跃进医疗器械厂生产｡1.2方法1.2.1纤维素酶产生菌的分离､纯化和初筛马铃薯瓢虫饥饿24 h后,无菌条件下在75%酒精中表面消毒2 min,去离子水漂洗3次,采用稀释平板法分离肠道菌｡待菌长出后用无菌牙签挑选单菌落于刚果红纤维素鉴定培养基上影印2~3皿,37℃下培养2~3 d｡取其中1皿采用刚果红染色法鉴定其产酶能力[11]｡对产生透明圈的菌株进行测量并记录D/d值(D为透明圈直径,d为菌落直径,下同),挑选D/d值大于1的菌株作为初筛菌种,通过连续划线法,分离纯化｡得到的初筛菌株转接到保藏斜面,4℃条件下保藏备用｡1.2.2纤维素酶产生菌的复筛将初筛到的菌株活化后接种于30/250 mL(250 mL 三角瓶装30 mL培养液,下同)种子培养基中,37℃､180 r/min摇床培养过夜｡以2%接种量转接于30/250 mL产酶培养基中,37℃､180r/min培养2~3 d,10 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液测定酶活,筛选产纤维素酶最高的菌株｡1.2.3酶活力测定测定方法参照文献[12-16]修正得到｡1)标准曲线绘制｡反应的总体系为3.5 mL,1 mg/mL葡萄糖溶液和去离子水共2 mL,DNS试剂1.5 mL｡取10支试管编号分别为1~10｡分别吸取0､0.2､0.4､0.6､0.8､1.0､1.2､1.4､1.6､1.8 mL葡萄糖溶液至1~10号试管中;然后分别吸取2.0､1.8､1.6､1.4､1.2､1.0､0.8､0.6､0.4､0.2 mL去离子水至相应的1~10号试管中｡向1~10号试管中分别加入1.5 mL DNS试剂｡将上述试管一同沸水浴5 min,冷却后稀释至10 mL,在540 nm下用分光光度计测吸光值,绘制葡萄糖标准曲线｡2)内切葡聚糖酶活力(CMCase activity,CMCA)测定｡取4支干净试管,编号(分别为1~4)后加入1.5 mL底物溶液,并向1号试管中加入1.5 mL DNS溶液以钝化其中的纤维素酶,作为空白对照,比色调零｡4支试管置于50℃水浴中预热5 min,再加入0.5 mL酶液(液体发酵液的离心上清液),50℃水浴30 min后立即向2､3､4号试管加入1.5 mL DNS溶液以终止酶反应｡充分摇匀后沸水浴5 min,取出冷却后,加入去离子水定容至10 mL,充分混匀｡以1号试管为空白对照,540 nm测吸光值,2､3､4号3支试管数值取平均值｡3)滤纸酶活力(FPA)测定｡方法同上,将底物溶液换成1 mL缓冲液和50 mg滤纸,加入的酶液量为1 mL,反应时间为1 h｡4)β-葡萄糖苷酶活力(BGL)的测定｡方法同上,将底物溶液换成1.5 mL含0.05%水杨苷的醋酸缓冲液,反应时间为1 h｡5)酶活定义｡在上述条件下,1 mL粗酶液所产生的1 μg葡萄糖定义为一个酶活力单位(U)｡以上的测定中均已扣除了粗酶液中所含有的还原糖量｡1.2.4产纤维素酶菌株的鉴定①菌株的形态特征:菌株平板培养2~3 d,观察菌落形态特征,菌体形态经染色(革兰氏染色､鞭毛染色､芽孢染色等)后,于显微镜的100倍油镜下观察并照像｡②菌株的生理生化特性:生理生化试验包括糖发酵试验､V. P试验､甲基红试验､吲哚试验､柠檬酸盐利用试验､淀粉水解试验､明胶水解试验等｡1.2.5产酶条件的优化对复筛得到的菌株进行产酶条件的优化试验｡1)摇瓶生长曲线的测定｡在基础培养基的基础上,对复筛得到的菌株测定其在摇瓶培养中的生长曲线和产酶曲线,考察菌体生长状况与菌株产酶能力在时间上的相关性｡2)接种量的确定｡将培养12 h的种子液分别以1%､2%､3%､4%､5%､6%､7%､8%､9%､10%､11%､12%､13%､14%､15%､16%的接种量转接入30/250 mL产酶培养基中,置于37℃,180 r/min摇床培养,测定酶活,考察不同接种量对菌株产酶的影响｡3)培养基成分的优化｡①碳源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的CMC-Na､葡萄糖､蔗糖､乳糖､酵母膏､牛肉膏､酵母粉､麦芽浸粉､秸秆汁､米糠作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察碳源种类对菌株产酶的影响｡②氮源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的(NH4)2SO4､NH4NO3､KNO3､蛋白胨､尿素､酵母膏､酪蛋白胨作为氮源,以1%葡萄糖作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察氮源种类对菌株产酶的影响｡③NaCl浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的NaCl,摇瓶培养后测定酶活,考察NaCl浓度水平对菌株产酶的影响｡④底物(CMC-Na)浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的CMC-Na,摇瓶培养后测定酶活,考察底物浓度水平对菌株产酶的影响｡⑤根据上述试验得到的最适培养基组成,选取L9(34)型正交表设计正交试验,试验因素和水平见表1,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡2结果与分析2.1纤维素酶产生菌的初筛采用刚果红染色法从瓢虫肠道中分离纯化得到16株透明圈较大的细菌,细菌编号及其D/d值分别为:B-1,6.167;B-35,5.667;B-11,5.000;B-19,4.750;B-9,4.000;B-26,3.750;B-37,3.000;B -27,1.833;B-53,3.000;B-47,2.714;B-36,2.667;B-42,2.571;B-32,2.500;B-46,2.429;B-1 2,2.083;B-10,1.420｡2.2纤维素酶产生菌的复筛对初筛得到的16株菌株进行摇瓶复筛,以CMCA为指标,筛选出B-12､B-10､B-53､B-11等4株产纤维素酶活力较高的菌株,CMCA(3次测定的平均值)分别为76.85､68.85､53.94､71.27 U/mL｡菌株B-12的CMCA最高,该菌株用以后续的试验｡2.3DNS法葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线如图1所示,得到方程y=0.916 9x-0.110 4,r2=0.991 4｡2.4菌株B-12的初步鉴定2.4.1形态特征菌株B-12在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上菌落较大､圆形､边缘整齐､不透明､乳白色､微隆起､湿润､生长较快｡显微镜观察细胞呈杆状,两头稍平;周生鞭毛,革兰氏染色呈阳性;芽孢椭圆形或柱状,中生或偏端生,芽孢囊不膨大｡2.4.2生理生化特征V.P反应为阴性,吲哚反应､甲基红反应为阳性｡该菌株可利用葡萄糖产酸,能水解淀粉,分解明胶,不能利用柠檬酸盐｡结合形态特征和生理生化特征,参考《伯杰细菌鉴定手册》第八版,将菌株B-12鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡2.5产酶条件的优化2.5.1摇瓶生长曲线的确定在原始培养基基础上从发酵开始至72 h,连续取样,在600 nm下测定生物量,离心后取上清液测定酶活,得到与时间相关的该菌株的生长曲线以及产酶曲线(图2､图3)｡由图2､图3可知,在3 h左右菌株进入对数生长期,16 h左右菌株生长开始进入稳定期,44 h以后开始进入衰亡期｡CMCA､FPA､BGL开始时增长较为缓慢,CMCA､BGL在44 h时达到最大值,FPA在47 h时达到最大,综合考虑将最佳培养时间定为44 h｡总体趋势表明菌株B-12的产酶能力与菌体生长状况有耦连相关性｡在44 h时CMCA为102.694 U/mL,FPA为7.187 U/mL,BGL为14.593 U/mL｡2.5.2不同接种量对菌株酶活力的影响不同接种量对菌株酶活力的影响结果见图4｡综合考虑,在接种量为6%时3个酶活指标均较高,CMCA为73.901 U/mL,FPA 为8.232 U/mL,BGL为7.140 U/mL｡因此最佳接种量选择6%｡2.5.3不同碳源对菌株B-12酶活力的影响碳源对微生物生长代谢的作用主要是提供细胞碳架､细胞生命活动所需的能量以及合成产物的碳架｡根据微生物所能产生的酶系不同,不同的微生物可利用的碳源不同｡在产酶培养基的基础上改变不同的碳源检测菌株B-12的产酶情况｡由图5可知,不同种类的碳源对菌株产纤维素酶影响不同,其中麦芽浸粉作为碳源时3个酶活指标均较高,CMCA为74.592 U/mL,FPA为6.778 U/mL,BGL为7.667 U/mL｡因此确定麦芽浸粉作为菌株B-12的产酶培养基的适宜碳源｡2.5.4不同氮源对菌株酶活力的影响氮源是合成菌体蛋白质､核酸及其他含氮化合物的重要组成成分｡不同种类的氮源对菌株的产酶影响结果见图6｡当KNO3作为氮源时,3个酶活指标均较高,CMCA为230.080 U/mL,FPA为101.636 U/mL,BGL 为93.009 U/mL｡因此确定该菌株的产酶培养基的适宜氮源为KNO3(图6)｡2.5.5NaCl浓度对菌株酶活力的影响试验设置了0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%等10个NaCl浓度梯度,在不同NaCl浓度下测定纤维素酶的3个酶活指标｡由图7可知,当NaCl浓度为0.2%时,CMCA活性最高,为75.137 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为5.533 U/mL和7.485 U/mL｡因此,NaCl浓度为0.2%时菌株B-12的酶活较大｡2.5.6底物(CMC-Na)含量对菌株酶活力的影响试验测定CMC-Na不同添加量(0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%)时菌株B-12的产酶水平｡由图8可知,当CMC-Na浓度达到0.2%时,CMCA活性最高,为90.043 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为7.287 U/mL和7.213 U/mL;表明菌株B-12适宜底物(CMC-Na)浓度为0.2%｡2.5.7最适培养基组成确定选取L9(34)型正交表设计正交试验,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡对正交试验结果进行极差分析(表2)可以发现对于CMCA酶活而言,主要因素的影响顺序为:麦芽浸粉>NaCl>KNO3>CMC-Na,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.0% KNO3､0.1% NaCl､0.2% CMC-Na｡对于FPA酶活,主要因素的影响顺序为:CMC-Na>NaCl>KNO3>麦芽浸粉,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡对于BGL酶活,主要因素的影响顺序为:KNO3>CMC-Na>麦芽浸粉>NaCl,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡综合考虑,最终确定最佳培养基配方为:1.25%麦芽浸粉,1.5%KNO3,0.2%NaCl,0.1% CMC-Na｡此时,CMCA､FPA和BGL分别为111.710 U/mL､35.017 U/mL和116.799 U/mL,较菌株培养44 h时的酶活分别提高了8.78%､387.23%和700.38%｡3讨论利用刚果红平板法初筛得到的透明圈比值大的菌株,其酶活并不一定高｡试验中我们发现菌株B-1的透明圈比值高达 6.167,而菌株B-12的透明圈比值仅为2.083,但从摇瓶发酵复筛结果看,菌株B-12的酶活要高于B-1的｡因此,在筛选纤维素酶高产菌株时,摇瓶发酵复筛是必要的｡我们首次从马铃薯瓢虫肠道中分离得到多株产纤维素酶肠道菌并筛选到1株酶活性较高的菌株B-12,产酶条件经优化后,其CMCA为111.710 U/mL,FPA为35.017 U/mL,BGL为116.799 U/mL｡而采用同样的酶活测试方法,林祥木等[17]从土壤中分离得到的最好的菌株其CMCA为36 U/mL,FPA为31 U/mL,BGL不足41 U/mL｡昆虫是地球生物圈中已知种类最多的一群生物[18,19],昆虫种类､数量及分布范围的多样性意味着昆虫肠道菌的多样性[20]｡研究表明昆虫肠道菌是微生物新种的潜在资源[21,22]｡因此,昆虫肠道菌可能是新高产纤维素酶的广泛来源,而从昆虫肠道菌分离产纤维素酶菌还鲜有报道,亟待研究开发｡参考文献:[1] TOMME P, WARREN R A J, GILKES N R. 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本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级：2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。

据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。

我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。

纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。

但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。

目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。

随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。

采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。

因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。

关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (2)1.2.1 实验材料 (2)1.2.2 实验仪器 (2)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (4)2.3 复筛 (4)2.4 酶活的测定 (4)2.4.1原理 (4)2.4.2溶液配制 (4)2.4.3实验步骤 (5)第3章实验结果 (7)3.1 标准曲线的绘制 (7)3.2 菌株复筛结果 (8)3.3 测定纤维素酶活力结果 (9)结束语 (10)参考文献 (11)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。