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第五章 分子生物学研究法-酶工具

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分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版

分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版

限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。

工具酶的名词解释

工具酶的名词解释

工具酶的名词解释工具酶（enzyme）是一类在生物体内起着催化反应作用的蛋白质分子。

它们广泛存在于人类和其他生物体中，参与了许多生物化学反应，如代谢过程、细胞分裂以及信号转导等。

工具酶以其高效催化、高度特异性和可逆性的特点而备受关注。

一、工具酶的基本结构和功能工具酶通常由氨基酸链组成，它们的功能部分是由特定的氨基酸序列决定的。

不同的氨基酸序列会导致工具酶具有不同的功能和特性。

工具酶具有酶活性中心，也称为活性位点，它是催化反应发生的地方。

酶活性中心通常由几个氨基酸残基组成，这些残基在反应中扮演特定的角色。

例如，存在于酶活性中心的催化三明治模型（catalytic triad）分别由赖氨酸、组氨酸和丝氨酸残基组成，它们通过电子变迁和氢键来催化反应的进行。

工具酶的功能是通过与底物结合并催化底物转化为产物来实现的。

工具酶与底物之间的结合是高度特异的，这种特异性保证了催化反应的效率和准确性。

工具酶可以通过调整底物的构象或降低活化能来促进反应的进行。

二、工具酶的种类和应用工具酶根据其催化反应的类型可以分为多个类别，如氧化还原酶、转移酶、水解酶和连接酶等。

每个类别的工具酶在不同的反应中发挥着不同的作用。

氧化还原酶（oxidoreductase）催化氧化还原反应，如细胞呼吸和光合作用中的反应。

转移酶（transferase）催化底物中的某些基团转移到另一分子上。

水解酶（hydrolase）催化水解反应，例如消化系统中的酶。

连接酶（ligase）催化两个分子的连接反应等等。

工具酶的应用非常广泛。

在生物技术和医药领域，工具酶常用于生物合成和药物开发中。

例如，工具酶可以用于产生大量的特定蛋白质、合成某些药物或者用于药物代谢学研究。

此外，工具酶还可以被用作制造工业用途中的化学品或生物燃料。

三、工具酶的调控和调节工具酶的活性可以通过多种因素调控和调节。

其中最常见的方式是基因表达调控和化学修饰。

基因表达调控是指工具酶基因的转录和翻译的调控。

现代分子生物学(第三版)课后答案 第五章分子生物学研究方法(上)

现代分子生物学(第三版)课后答案 第五章分子生物学研究方法(上)

第五章分子生物学的研究方法（上）西南大学生命科学学院09级XX(仅代表个人观点)1，哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生和发展？答：1，确定遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；2，DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机制的提出；3，中心法则，操纵子学说的提出和密码子的破译；4，重组工具酶的发现；5，运载体重组质粒的发现。

2，如何理解PCR扩增的原理和过程。

答：原理：DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

过程：1，变性，将DNA在临近沸点的温度下加热使变性，双链打开；2，退火，引物与模版的相结合；3，链的延伸，DNA合成。

3，简述定量PCR的原理和过程。

答：实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接头孤傲管盖，使其中的荧光探针被激发。

一逛探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA 结合之后，才能被激发发出荧光。

随着新和成DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光增加。

4，基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么？答：基因组DNA是把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞形成克隆。

应用：主要用于基因组作图、测序和克隆序列的对比。

cDNA文库是以mRNA为模版反转录而成的序列，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增。

应用：筛选目的基因、大规模测序、金银芯片杂交等功能基因组学的研究。

5，基因克隆的方法主要有哪几种？简述各种方法的作用和用途。

答：1，RACE技术，用于在已知cDNA序列的基础上克隆5’端和3’端缺失的序列；2，应用cDNA差示分析法克隆基因，在没有任何探针的情况下，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDAN两端接头的方法特异性的扩增目的基因片段。

分子生物学-第五章--蛋白质的生物合成可编辑全文

分子生物学-第五章--蛋白质的生物合成可编辑全文

遗传密码的连续性
遗传密码的摆动配对
密码的简并性具有的生物学意义
它允许生物体的DNA碱基有较大变异 的余地，使基因突变可能造成的为害降至 最低程度，而不影响物种形状的表达，对 环境的适应和物种遗传的稳定。
例如细菌DNA中G+C含量变动很大， 但不同G+C含量的细菌却可以编码出相同 的多肽链。
这归因于同义密码子的分布规则。
摇摆假说
由于同义密码子的第1、2个碱基是保守的，第3个碱 基是可变的，因此解读同义密码子的tRNA的反密码子的 第1个碱基必定具有最小的专一性，也就是说它与密码子 第3个碱基之间的配对原则具有一定范围的灵活性。
由于反密码子位于tRNA的突环上，因此反密码子三 联体的排列就会呈弯曲弧线，不能与密码子保持完全的平 行，加上反密码子的第1个核苷酸位于非双链结构的松弛 环内，摇摆的自由度较大，从而导致密码子的第3个核苷 酸和反密码子的第1个核苷酸之间可能形成非标准的碱基 配对，反密码子的这一位点也被称为摇摆位点（一般为第 34位碱基）。
在原核生物和真核生物中，均存在另一种 携带蛋氨酸的tRNA，识别非起始部位的蛋氨 酸密码，AUG。
tRNA在将密码的信息及排列转换为多肽链中 的氨基酸序列的过程中起着中心及桥梁的作用。
最简单的tRNA只有74个核苷酸，而最大的也 很少超过94个核苷酸。这个特点使得tRNA成为最 先被定序的核酸。
序列测定的结果揭示tRNA是同源性相对较高 的RNA分子，tRNA分子含有大量修饰核苷酸和可 能存在各种碱基配对的二级结构。
能 够 识 别 mRNA 中 5′ 端 起 始 密 码 AUG 的 tRNA是一种特殊的tRNA，称为起始tRNA。
在 原 核 生 物 中 ， 起 始 tRNA 是 一 种 携 带 甲 酰蛋氨酸的tRNA，即tRNAifmet；

分子生物学第五章分子生物学研究法(上)

分子生物学第五章分子生物学研究法(上)

分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。

基因工程-工具酶

基因工程-工具酶

基因敲入
2
能。
利用工具酶将外源DNA片段整合到目标基
因中，实现新基因的表达。
3
基因编辑
通过工具酶修饰目标基因的特定碱基， 实现精确的基因改造。
农业、医药和工业领域的应用
农业
利用基因工程和工具酶，开发抗 虫、抗病、耐旱和高产的转基因 作物。
医药
工具酶在基因治疗中起着关键作 用，用于修复人类遗传病和癌症 等疾病的基因。
基因工程-工具酶
基因工程是利用DNA技术对生物体进行改造的科学，工具酶在基因工程中起 着至关重要的作用。
工具酶的作用
工具酶是基因工程中的重要工具，用于切割、连接和修饰DNA分子，使得科 学家能够精确操控基因。
常用的工具酶类型
限制酶
识别和切割DNA序列，用于定位和克隆特定基因。
连接酶
将不同DNA片段连接在一起，构建重组DNA分子。
修饰酶
对DNA分子进行修饰，如甲基化、去甲基化等。
造极酶
用于扩增DNA序列，如聚合酶链反应（PCR）中 的DNA聚合酶。
工具酶的工作原理
工具酶通过与DNA特定序列的互作用，识别并结合到目标序列上，然后以特 定的方式切割、连接或修饰DNA分子。
பைடு நூலகம்
基因修饰的方法
1
基因敲除
通过工具酶切割目标基因，使其失去功
工业
利用工具酶进行工业发酵，生产 各种化学品、药物和生物燃料。
挑战和限制
• 技术限制：某些DNA序列难以切割或修饰。 • 安全问题：基因修饰可能带来意想不到的风险和后果。 • 伦理考虑：对基因工程的道德和伦理问题需引起广泛关注。 • 法律和监管：基因工程面临严格的法律和监管要求。

分子克隆中常用的四种工具酶及其应用

分子克隆中常用的四种工具酶及其应用分子克隆是利用分子生物学技术对目标DNA进行扩增及克隆的过程。

在分子克隆的过程中，常常需要使用许多酶类工具来完成不同的任务。

以下介绍了分子克隆过程中最常用的四种酶类工具及其应用。

1. 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction endonuclease）又称限制酶，是一类可特异性切割DNA特定序列的酶。

它可以在DNA的特定位置切割成不同的碎片，而不会破坏DNA的结构。

因此，限制酶被广泛应用于DNA的纯化、分析和重组等领域。

在分子克隆中，限制酶通常用于切割DNA的特定序列，以获得所需的DNA片段。

同时，也可以用于制备载体DNA的端部修饰，方便插入外来DNA片段。

此外，限制酶还可以用于分析DNA序列的变异和同源性等特征。

2. DNA连接酶DNA连接酶（DNA ligase）是一种催化DNA连结软帽酶，用于连接具有互补末端的DNA片段。

连接酶广泛应用于DNA重组、引物连接、克隆和测序等领域。

在分子克隆中，DNA连接酶通常使用于将外来DNA片段连接到载体 DNA 上。

此外，为了克隆具有完整DNA序列的目标基因，连接酶还可以用于连接PCR扩增出来的目标DNA序列。

3. PCR酶聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种快速、有效、敏感的DNA扩增技术。

在PCR过程中，通过PCR酶催化下的DNA扩增反应，能够在很短的时间内扩增目标DNA的数量。

在分子克隆中，PCR酶通常用于扩增目标DNA片段。

利用PCR技术，可以选择性增加目标DNA的数量并在容易处理的基本DNA片段之间产生特定的限制酶切断部位，为后续分子克隆实验提供方便。

4. 接头酶接头酶（T4 DNA ligase）是一种针对DNA单链断裂或缺口进行修复和连接的酶。

在分子克隆中，接头酶主要用于将外来DNA片段和载体DNA粘到一起。

在分子克隆的过程中，外来DNA片段和载体DNA之间通常存在一些不兼容的末端或过于短的重叠部分。

分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】

分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。

但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。

其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。

DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下：1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。

1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。

1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。

1970 年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。

H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。

1972-1973 年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。

1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。

1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。

1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。

2013-2014分子生物学章节练习题第5-6章练习题

第五、六章分子生物学研究方法练习题1一、【单项选择题】1.一般的限制性核酸内切酶II作用的特点不包括A.在对称序列处切开DNAB.DNA两链的切点常不在同一位点C.酶切后产生的DNA片段多半具有粘性末端D. DNA两链的切点常在同一位点，E.酶辨认的碱基一般为4-6个4.下列关于建立cDNA文库的叙述哪项是错误的A.从特定组织或细胞中提取mRNAB.将特定细胞的DNA用限制性核酸内切酶切割后，克隆到噬菌体或质粒中,C.用逆转录酶合成mRNA的对应单股DNAD.用DNA聚合酶，以单股DNA为模板合成双链DNA5.限制性核酸内切酶的通常识别序列是A.粘性末端B.RNA聚合酶附着点C.回文对称序列,D.多聚腺苷酸E.甲基化的“帽”结构9.基因工程的操作程序可简单地概括为A.载体和目的基因的分离、提纯与鉴定B.分、切、连、转、筛，C.将重组体导入宿主细胞，筛选出含目的基因的菌株D.将载体和目的基因接合成重组体E.限制性核酸内切酶的应用11.常用质粒有以下特征A.是线性双链DNAB.插入片段的容量比λ噬菌体DNA大C.含有抗生素抗性基因，D.含有同一限制性核酸内切酶的多个切口E.不随细菌繁殖而进行自我复制14.表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是A.大肠杆菌表达体系B.原核表达体系C.酵母表达体系D.昆虫E.哺乳类细胞表达体系，18.在分子生物学上“重组DNA技术”又称为A.酶工程B.蛋白质工程C.细胞工程D.发酵工程E.分子克隆技术22.基因组代表一个细胞或生物的A.部分遗传信息B.整套遗传信息，C.可转录基因D.非转录基因E.可表达基因25.在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A.化学合成法B.基因组文库法C.cDNA文库法D.PCRE.差异显示法27.PCR主要的酶是A.DNA连接酶B.反转录酶C.末端转移酶D.碱性磷酸酶E. Taq DNA聚合酶28.重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶A.DNA聚合酶B.RNA聚合酶C.DNA连接酶D.RNA连接酶E.限制性核酸内切酶30.最常用的筛选转化细菌是否含重组质粒的方法是A.营养互补筛选B.抗药性筛选，C.免疫化学筛选D.PCR筛选E.分子杂交筛选33.用于重组DNA的限制性核酸内切酶，识别核苷酸序列的A.正超螺旋结构B.负超螺旋结构C.α-螺旋结构D.回文结构，E.锌指结构58、基因治疗是指A．对有基因缺陷的细胞进行修复，从而使其恢复正常，达到治疗疾病的目的B．把健康的外源基因导入到有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的C．运用人工诱变的方法，使有基因缺陷的细胞发生基因突变恢复正常D．运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的93．PCR实验的特异性主要取决于A．DNA聚合酶的种类B．反应体系中模板DNA的量C．引物序列的结构和长度D．四种dNTP的浓度E．循环周期的次数94．基因剔除（knock out）的方法主要被用来研究A．基因的结构B．基因的功能C．基因的表达D．基因的调控E．基因的突变95．反义核酸作用主要是A．封闭DNA B．封闭RNAC．降解DNA D．降解DNA E．封闭核糖体的功能105. 酵母单杂交技术是分析【】的实验系统。

5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术


DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
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引言
基因工程的主要内容或步骤:
1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目 的基因的DNA片段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到 能够自我复制的并具有选 择记号的载 体分子上，形成重组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞 （亦称寄主细胞）并与之一起增殖。
4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得 了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出 已经得到扩增的目的基因。 5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄 主细胞，使之在新的遗传背景下实现功 能表达。

修饰酶的作用是保护细胞自身的DNA不被限制性内切 酶破坏, 修饰酶是通过甲基化修饰酶切位点中的每条链 上的一个碱。 限制性内切酶识别位点处的甲基基团伸入到双螺旋的 大沟中去, 阻碍了限制性内切酶的作用。

第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
限制-修饰系统 ：
在一些R-M系统中, 限制性内切酶和修饰酶是两种 不同的蛋白, 各自发挥自己的功能;
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具 例： 流感嗜血杆菌中三个酶的命名： Haemophilus influenzae d
属名 H
种名 in
株系 d
I II III
Hind I
Hind II
Hind III
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
- 填平双链 DNA 的 3’缩进末端和水解去除双
链 DNA的 3’ 突出末端 - cDNA 克隆中合成第二链
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
3 ) T4 噬菌体 DNA 聚合酶 来源于T4 噬菌体感染的大肠杆菌, 与 Klenow 片段 相似, 具有5’-3’聚合酶活性和 3’-5’ 外切酶活性。 用途： - 填平双链 DNA 的 3’缩进末端 - 水解去除双链 DNA 的 3’ 突出末端。
问题: - 为什么细菌自身的DNA不被破坏??
- 限制性内切酶如何区分内源DNA和外源DNA???
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
限制-修饰系统 (R-M系统) 在细菌体内, 限制性核酸内切酶常常伴随1-2种修饰酶 (甲基化酶)出现, 这一现象被称之为限制-修饰系统 。
Hind III
切割 补平 连接
5’ AAGCT T 3’ T TCGAA
AAGCT TTCGA
Xba I 5’ TCTAG A 3’ A GATCT
CTAGA GATCT
5’ AAGCTCTAGA TTCGAGATCT 5’
缺点: 片段可自身连接。
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
- II 型酶 识别位点和切割位点相同, 识别序列在 4-12bp。 具有甲基化修饰酶功能, 酶作用时不需要 ATP, 一般只 需要Mg 2+。
- III 型酶 酶的识别位和切割位点不一致, 两位点距离近, 其作用 辅助因子与 I 型酶相同。 具有甲基化修饰酶的功能, 但无ATP 酶和 DNA 解旋酶 的活性。

第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
（2） 3’-5’外切酶活性 从DNA链的 3’-OH 末端开始向5’的方向水解DNA, 并释放 出单核苷酸分子。 作用底物,可以是双链DNA, 也可是单链DNA。 当反应物中缺乏dNTPs时, 该酶表现出3’-5’外切酶活性；在 具有dNTPs时, 这种活性被5’-3’聚合酶活性抑制。 DNA 的修复中发挥作用, 可识别和消除不配对的核苷酸。 （3）5’-3’ 外切酶活性 从 5’ 末端降解 DNA 成单核苷酸或寡核苷酸
第五章 分子生物学研究法
基因操作技术主要包括:
引言
- DNA (基因组和质粒) 分子的提取和纯化 - 基因片段扩增 （聚合酶链反应，PCR) - DNA 分子的切割和连接 - 凝胶电泳 - 核酸序列分析 - 细菌转化 - 核酸分子杂交
分子生物学研究的核心技术
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
切割 部分补平 连接
优点: 可防止片段的自身连接。
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
②
平末端连接 任何内切酶(产生平末端) 切割后所得到的片段都可以 由连接酶直接连接。
注意:
片段可自身连接, 连接效率比粘性末端低得多。
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
限制性核酸内切酶 - 识别DNA双链中特定的核苷酸序列, 并进行切割 - 限制位点:由限制性内切酶所识别 的DNA双链中特定的核苷酸序列. 可由4、5、6或更多核苷酸所组成 - 限制片段: 由限制性核酸内切酶 水解得到的DNA片段 - 水解产物 5’-P 和 3’- OH
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具 来源: 目前在DNA重组操作中所用的限制性核酸内切酶 主要是从细菌或霉菌中分离纯化出来。 命名: 用寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成 寄主菌的物种名称。 EcoR I中Eco是 代表大肠杆菌( Escherichia coli) , R代表菌 株, I 代表限制与修饰体系。
注意: 连接后切割位点序列改变不能被 BamH I 和 Bgl II 酶所识别!!
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
c. 不匹配粘性末端连接 不匹对粘性末端的连接, 可采用下面两种方法: - 用 Klenow 酶先将两个片段的粘性末端补平, 或用SI 酶切除 突出的核苷酸, 将粘性末端修平, 再用连接酶连接。
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
1. 限制性核酸内切酶 是能够识别DNA双链中特定的核苷酸序列, 并进行 切割的一类核酸水解酶。


30多年前, 在对噬菌体的宿主进行研究时发现的。
细菌可以抵御病毒的入侵, 主要是由于细胞内部存 在着可以摧毁外源DNA的限制性内切酶。
- 用 Klenow 酶将粘性末端部分补平 如 Hind III 和 Xba I 产生的粘性端不能匹配, 但可分别用两 种核苷酸 (Hind III 用 A 和 G, Xba I 用 T 和 C) 填补, 使之产生 匹配粘性末端后, 再用连接酶连接。 Hind III 5’ AAGCT T 3’ T TCGAA AAG TTCGA 5’ AAGCTAGA TTCGATCT 5’ Xba I 5’ TCTAG A 3’ A GATCT CTAGA TCT
T4 噬菌体 DNA 连接酶 (T4 DNA Ligase)
底物:
3’末端带-OH、5’末端带磷酸基团的DNA片段
反应条件：
Mg++，ATP
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具 3. DNA 聚合酶 DNA 聚合酶在细胞中参与 DNA 的复制, 在重组 DNA 操作中DNA 聚合酶催化DNA 体外合成反应。
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具 2) Klenow 片段 (大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 大片段) 是用枯草杆菌蛋白酶水解大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 得 到的该酶大片段, Klenow片段保留了 5’-3’ DNA 聚合酶 活性和 3’-5’ 外切酶活性，而5’-3’ 外切酶活性被去除 用途:
DNA 聚合酶的种类很多, 有: -大肠杆菌 DNA 聚合酶 (全酶) - Klenow 片段 - T4 噬菌体 DNA 聚合酶 - T7 噬菌体 DNA 聚合酶 - Taq DNA 聚合酶 - Pfu DNA 聚合酶 - 反转录酶
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
1）大肠杆菌 DNA 聚合酶 (E.coli DNA pol I) 具有3 种活性:
注意: 连接后的识别和切割的序列不变, 仍可被 BamH I 切开!!
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
b. 用不同的酶切割, 产生带有相同突出端的限制性片段, 这些 片段在连接酶作用下可连接. 这些酶被称之为同尾酶。 如: BamH I 5’G|GATCC Bgl II C CTAG|G5’ 连接后: 5’ GGATCT CCTAGA 5’ 5’A|GATCT T CTAG|A 5’
第五章 分子生物学研究法
引言
-DNA 片段的切割
-DNA 分子克隆载体的切割
-DNA 片段与载体的连接
图: DNA 片段与载体相连过程示意图
第五章 分子生物学研究法
- 质粒、基因的切割 - 基因片段插入质粒 - 重组质粒 - 细菌转化
引言
- 转化子选择
图: 细菌转化及转化子选择
第五章 分子生物学研究法
1） 限制性内切酶的种类 根据限制性内切酶的识别序列和切割位点是否一致, 可分三类。 - I 型酶 是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基的蛋 白复合体。它们的识别位点和切割位点不一致, 在识 别位点很远处切割DNA。 除了内切酶和甲基化酶的活性外, 还具有ATP 酶和 DNA 解旋酶的活力。作用时需要 ATP 和 Mg2+。
5’-3’ DNA 聚合酶活性
3’-5’ DNA 外切酶活性 5’-3’ DNA 外切酶活性
第五章 分子生物学研究法 一. 重组 DNA 实验中主要的酶工具
（1） 5’-3’聚合酶活性 需要单链的 DNA 模板、引物、 dNTP 和 Mg++ 催化结合在 DNA 模板链上的引物核酸 3’-OH 与底物 dNTP 的5’-P 之间形成磷酸二酯键, 使新链延长, 新链 的合成方向是 5’-3’。 可补平 DNA 双链中的缺口