乳杆菌质粒基因工具的发展概况

1.4.1 乳酸菌基因敲除原理概述1980年左右，科学家研究出了一种非常有意义的生物学技术，也就是基因敲除技术。

它的技术原理是在特定的环境下，对指定的基因序列进行删除并修改染色体将细胞内所含的遗传信息改变。

这项技术的开发使得细菌正常反应和吸收过程发生变化，减少了多余新陈代谢物质的生成和发酵成本浪费，在某种水平上增加了产物的生产效率。

而且，其对于细菌结构的研究也有一定的帮助，如乳酸菌错误!未找到引用源。

经典基因敲除技术是利用DNA同源重组原理。

同源重组依赖于基因同源序列的结合，并且重组发生在DNA分子或分子内交换等价物之间。

根据同源重组原理，通过酶切连接和PCR等方法合理构建不同结构的重组载体，然后通过电转化等手段导入宿主细胞，实现宿主染色体DNA序列的片段缺失、定点突变或插入突变等。

乳酸菌中的同源重组是一个复杂的过程，通常分为四个阶段，即初始阶段、同源序列配对、同源片段交换和异源片段交换以及Holiday中间体的分离，其间需要RecA，RecBCD，RecF，RecR ，RuvAB等重要蛋白质的参与错误!未找到引用源。

此外，基于位点特异性重组，乳酸菌也可以进行敲除。

敲除的原理是在重组酶的催化下，两条DNA链将在特定位点进行重组。

根据特定位点的顺序和方向，重组后可能会出现三个结果：整合（integration），切除（excision），倒位（inversion）。

位点特异性重组酶由两个主要家族，整合酶系和解离酶系组成。

整合酶家族的两种代表性重组酶系统分别是Cre / loxP和FLP / FRT重组酶系统。

在解离酶家族中，乳酸菌中常用的重组酶是乳酸菌噬菌体TP901-1整合酶，其特异性介导attP位点与attB位点之间的重组反应。

1.4.2 乳酸菌基因敲除策略（1）利用同源重组单交换双交换进行敲除单交换和双交换同源重组的主要条件是构建重组载体，并利用PCR扩增靶基因的上游和下游片段或不完整的靶基因，将其连接到敲除载体，然后将其转化到宿主细胞中。

一个植物乳杆菌隐蔽质粒的测序和注释（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：潘渠胡袁邓林雷舜胡晓梅胡福泉【摘要】在植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum CICC 6002）中发现了1个隐蔽质粒（pLP2111），并将其克隆到pUC 18质粒上进行测序。

序列分析表明pLP2111大小为2 111 bp；仅有1个ORF，编码1个37.0 kDa的复制蛋白；有1个17 bp的重复序列重复了13次。

BLAST结果显示pLp 2111和植物乳杆菌CCM 1904菌株的pLP1质粒相似性最高，为99 %，pLP2111比pLP1大18 bp.pLP2111可能构建为良好的乳杆菌或乳球菌异源蛋白表达载体。

【关键词】植物乳杆菌；隐蔽质粒；测序；注释【Abstract】 The complete nucleotide sequence of a cryptic plasmid isolated from Lactobacillus plantarum strain CICC 6002 has been determined.The plasmid,designated pLP2111,has 2,111 bp,encodes a 37.0 kDa Rep protein and has a 17 bp sequence repeated 13 times.The result of BLAST showed that pLP2111 is 99 % identical to pLP1 (2,093 bp) of Lactobacillus plantarum strain CCM 1904.The pLP2111 may be constructed as a goodhetero expression vector.【Key words】 Lactobacillus plantarum； cryptic plasmid；sequence; analysis植物乳杆菌作为乳杆菌的一员，具有增强机体免疫力、降低机体胆固醇水平、帮助消化和维持肠道微生态平衡的生理功能，对人体健康有益；而且该菌已被广泛用于青贮饲料、肉类和蔬菜的乳酸发酵中。

乳酸杆菌表达系统的研究进展丁轲程安春(四川农业大学动物科技学院四川雅安625014)乳酸杆菌是一种常见的益生菌，它的应用已有几百年的历史，是一种公认的具有GRAS(Generally Regarded As Safe)有益微生物。

该菌广泛存在于人、动物和植物中，可以产生多种物质，如短链脂肪酸、过氧化氢、细菌素、蛋白质和各种酶类等。

尤其重要的是它是人和动物肠道中最重要的优势菌群之一，对于机体的代谢、免疫调节等方面起着极其重要的作用。

但随着基因工程技术的发展日趋完善，人们已不再满足于乳酸杆菌自身固有的功能，特别是当前由于疫苗免疫和菌(毒)株的残留毒力之间的矛盾，促使人们寻求能良好表达外源抗原且安全的疫苗载体候选菌株，乳酸杆菌便自然成为最佳选择菌株之一，因此近年来在疫苗载体的研究中日益受到重视，但其研究却远远落后于病原微生物。

现就这一方面作一综述。

1 乳酸杆菌表达载体的优点乳酸杆菌作为表达载体有许多独特的优势，这主要是因为乳酸杆菌是人和动物体内最优势的益生菌株之一，许多研究都表明它的有无和多寡都对机体有着至关重要的影响，以它为表达系统有其它菌株不可比拟的优点，主要表现在以下方面：①乳酸杆菌是至今发现的唯一没有致病性的一个种；②它在人和动物体内占绝对优势，以它为表达系统，较其它菌株更易达到较高的表达量；③若选择非抗性标记，则该表达系统中的菌体、选择性标记、诱导物均为食品级，为生产绿色安全的食品提供了可能；④乳酸杆菌菌体本身就对机体有益生作用，其分泌多种物质更是机体必不可少的，若再在其载体上克隆入外源基因，这样就可集菌体、自泌物质和外源蛋白于一体；⑤乳酸杆菌对机体粘膜有极强的粘附作用，因此构建的乳酸杆菌基因工程菌就可在粘膜处不断繁殖，持续向机体释放目的蛋白；⑥乳酸杆菌可直接口服，能够耐受胃液中的强酸和小肠上段的胆盐，这样就免去了目的蛋白的体外提纯等后加工。

2 乳酸杆菌质粒1976年Chassy[1]首先发现乳酸杆菌中存在质粒，质粒在不同的乳酸杆菌中分布不均，Vescovo等[2]对159株乳酸杆菌进行质粒抽提，发现L. reuteri、L. helveticus 和L. acidophilus 含质粒的比率较高，分别为63%、27%和20%，L. casei仅有4%的菌株含有质粒，L.plantarum、L. brevis 和L. coryniformis没有发现质粒。

乳酸菌基因组学与基因工程的研究新进展薛迎迎，杨汝德（华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006）摘要：本文对乳酸菌基因组学的研究新进展，包括乳酸菌基因组测序、基因组的进化和基因转移、乳酸菌重要的功能基因等以及乳酸菌基因工程的研究新进展，包括乳酸菌食品级表达载体、食品级载体选择标记、活体疫苗载体等方面进行了概述。

关键词：乳酸菌；基因组学；基因工程中图分类号：Q939.1；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2008)06-0617-04Advances in Genomics and Genetic Engineering of Lactic Acid BacteriaXUE Ying-ying, YANG Ru-de（College of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China）Abstract: In this paper, research advances in genomics of lactic acid bacteria were reviewed, including genome sequencing, evolution, gene transfer and functional gene. The recent advances in genetic engineering of lactic acid bacteria were also introduced, including food-grade expression vector, selective marker, and live vaccine vector.Key words: lactic acid bacteria; genomics; genetic engineering乳酸菌( lactic acid bacteria , LAB)，是一类能利用碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称，广泛存在于自然界中，被公认为是安全的食品级微生物。

乳酸菌DNA序列分析与功能基因研究现状作者：叶巍来源：《江苏农业科学》2014年第10期摘要：乳酸菌在食品发酵业中得到广泛的应用，被认为是加强健康食品生产的益生菌。

关于多种乳酸菌的基因组测序和功能基因组的研究加快了对乳酸菌多样性和进化的理解，并且揭示了重要特性的分子基础。

随着目标试验的证实、代谢工具的开发、网络工具的利用，生物信息学工具以及数据库重新构建代谢途径为食品和饲料菌种提供了新的开发途径。

关键词：乳酸菌；基因组；生物信息学；多样性；代谢重建中图分类号： Q789文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0040-02收稿日期：2013-12-05基金项目：上海理工大学科研启动基金（编号：A2500130104）。

作者简介：叶巍（1981—），女，黑龙江大庆人，博士，讲师，主要从事生物工程研究。

E-mail：beatificy@。

含有乳酸菌的发酵剂，如乳杆菌、乳球菌等，对于很多食物如牛奶、肉类、蔬菜、谷类的发酵起重要作用。

这些菌种发酵主要产生有防腐作用的乳酸，影响产品的风味及质地[1-3]。

乳酸菌在发酵中还有其他重要的功能，人们在不同的环境中发现了各种特性的菌种[4-6]。

随着乳酸菌基因组数据的公布，生物信息学对乳酸菌功能特性研究作用越发重要。

本研究介绍了乳酸菌DNA序列分析与功能基因研究现状，旨在为开发利用乳酸菌资源提供依据。

1基因组、质粒乳酸菌全基因组大小相对一致，约为1.8～2.6 Mb，植物乳杆菌全基因组大小约为3.3 Mb。

过去20年，分子遗传学家一直青睐的不含质粒的ctis ssp. Cremoris MG1363测序已经完成。

通过将其与ctis ssp. Lactis IL1403染色体共线性绑定，以非常相近的菌种或菌种的全基因组为模板完成原核基因组定位。

对Lactobacillus brevis KB290的9个质粒测序分析表明，L. brevis KB290有很好的稳定性[7]。

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乳酸杆菌的研究进展摘要乳酸杆菌是一类近年来研究较多的益生素,大量试验结果表明，乳酸杆菌中的一部分菌种对人和动物的保健和疾病治疗有效果。

本文主要介绍了乳酸杆菌的分离与鉴定，菌种的保藏，代谢产物，生理功能及应用研究，是一种前景广阔的微生态制剂。

乳酸杆菌乳酸杆菌，是一类能使糖类发酵产生乳酸的细菌,是一群生活在机体内益于宿主健康的微生物。

乳酸杆菌存在广泛,其生长温度在20～53℃ ，最适温度为30~40 ℃；嗜酸性，最适合pH5.5～6.0,在pH3.0～4.5中仍然能生存,在无芽胞杆菌中其耐酸力最强。

乳酸杆菌是一群杆状或球状的革兰氏阳性细菌,不形成芽孢，触媒阴性,细胞色素缺失，其DNA中G+C含量少于55%。

乳酸杆菌绝大多数是厌氧菌或者兼性厌氧的化能营养菌，生长繁殖于厌氧或微好氧、矿物质和有机营养物丰富的微酸性环境中。

在污水、发酵生产（如青贮饲料、果酒啤酒、泡菜、酱油、酸奶、干酪)培养物、动物消化道等中乳酸杆菌含量较高。

乳酸菌不仅已广泛应用于畜牧业、食品加工业, 随着研究的深入，也在一些疾病治疗中得以应用，用于增强患者的免疫、营养、生长刺激等。

乳酸杆菌的分离与鉴定1 乳酸杆菌的分离从不同的基质中分离乳酸杆菌时，根据乳酸杆菌所在生长环境的不同以及是否为优势菌可选择不同组分的培养基。

主要有以下几种常用的培养基[1］：（1) MRS 培养基当乳酸杆菌是待分离区系的优势菌时，常用MRS 培养基对其进行分离。

Rep-PCR技术及其应用现状赵燕梅;张吉明;许庆方【摘要】文章着重介绍了Rep-PCR技术原理、特点及其在细菌、真菌、环境微生物遗传多样性研究方面的应用.Rep-PCR目前发展迅速并被广泛应用于多种细菌基因分类,此方法操作方便,可以大样本进行,且Rep-PCR分辨效果好,可重复性强.现在Rep-PCR可自动化分型,并可建立各种细菌REP、ERIC-PCR分型标准数据库.但Rep-PCR也存在一定问题,不同来源的或不同批次的引物和酶,对Rep-PCR结果都有一定的影响.【期刊名称】《中国草食动物科学》【年(卷),期】2014(034)003【总页数】3页(P55-57)【关键词】Rep-PCR;细菌;真菌;环境微生物;遗传多样性【作者】赵燕梅;张吉明;许庆方【作者单位】山西农业大学动物科技学院,太谷030801;山西农业大学动物科技学院,太谷030801;山西农业大学动物科技学院,太谷030801【正文语种】中文【中图分类】Q3-3细菌基因组重复序列PCR（repetitive extragenic palindromic PCR，Rep-PCR）是由 Versalovic于 1991年描述的一种细菌基因组指纹分析方法。

该方法是通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，来揭示基因组间的差异。

细菌的重复序列是一类在维护基因组DNA结构和遗传进化方面起重要作用的高度保守的DNA序列，在细菌基因组中广泛分布，约占细菌基因组的5%［1］。

在不同种细菌或同种不同菌株中，重复序列单元的数量和在染色体上的分布各具特点。

这些序列单元的功能大部分尚未明确，但最新研究表明，它们可能参与RNA或DNA的合成与代谢［2］，也可能与细菌基因组的进化有关［3］。

当前，在多态性研究中应用较多的重复序列有（GTG）5序列、REP序列（repetitive extragenic palindromic，REP，35～40 bp）、ERIC序列（enterobaeterial repetitive intergenic consensus，ERIC，124～127 bp）以及 BOX序列（154 bp）等［4-5］。

乳杆菌噬菌体及其裂解机制的研究一、简述乳杆菌噬菌体(Lactobacillus phage)是一种能够裂解和侵染乳杆菌的病毒。

自19世纪末发现以来，乳杆菌噬菌体的研究一直受到科学家们的关注。

随着分子生物学技术的发展，对乳杆菌噬菌体的基因组、结构、裂解机制等方面的研究逐渐深入。

本文将对乳杆菌噬菌体及其裂解机制进行综述，以期为乳杆菌噬菌体的应用提供理论依据。

乳杆菌噬菌体是一种单链环状DNA病毒，具有高度保守的基因组结构。

其基因组由一个长末端重复序列(LTR)和一个开放阅读框(ORF)组成。

LTR编码病毒的外壳蛋白和糖蛋白，而ORF编码病毒的核酸酶(Nucleolysin),用于裂解被感染的乳杆菌细胞。

乳杆菌噬菌体的裂解机制主要包括以下几个方面：首先，病毒进入宿主细胞后，通过与宿主细胞表面的受体结合，进入宿主细胞；其次，病毒利用Nucleolysin切割宿主细胞的核糖体，破坏宿主细胞的翻译系统；病毒利用宿主细胞的资源合成新的外壳蛋白和糖蛋白，组装成新的病毒颗粒并释放到宿主细胞外。

乳杆菌噬菌体的研究对于了解病原微生物的致病机制、开发新型抗菌药物以及提高食品安全等方面具有重要意义。

近年来随着基因编辑技术的发展，研究人员已经成功地利用CRISPRCas9等方法对乳杆菌噬菌体的基因组进行了编辑，为其研究提供了新的途径。

1. 研究背景和意义随着生物技术的不断发展，乳杆菌噬菌体作为一种新型的基因治疗载体在生物医学领域引起了广泛关注。

乳杆菌噬菌体是一种能够感染并裂解乳杆菌的病毒，其独特的裂解机制使得它成为一种理想的基因治疗工具。

然而乳杆菌噬菌体的裂解机制尚不完全清楚，这限制了其在基因治疗领域的应用。

因此深入研究乳杆菌噬菌体的裂解机制，对于揭示其在基因治疗中的作用机制具有重要的理论和实践意义。

首先研究乳杆菌噬菌体的裂解机制有助于优化其作为基因治疗载体的性能。

通过了解乳杆菌噬菌体的裂解机制，可以为设计更有效的基因治疗载体提供理论依据。

· 287 ·《生命的化学》２００９年２９卷２期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　２００９，２９（２）●　知识介绍文章编号： １０００－１３３６（２００９）02－0287-04基因工程乳酸杆菌及其应用程小广 元冬娟 江黎明（广东医学院生物化学与分子生物学研究所，湛江　５２４０２３）摘要：乳酸菌中的乳酸杆菌是一类具有较好应用前景的重要微生物。

近年来对乳酸杆菌的研究逐渐增多，发现很多种类中有质粒存在，并发展了相应的表达系统。

本文概述了乳酸杆菌基因组特点、乳酸杆菌质粒、以乳酸杆菌质粒为载体的外源蛋白表达系统研究进展，并介绍了乳酸杆菌作为微生态制剂、活菌疫苗等的潜在应用价值。

关键词：乳酸杆菌；质粒；外源蛋白中图分类号：Ｑ９３９．９收稿日期：２００９－０１－０７作者简介：程小广（１９８０－），男，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：　ｄｕｑｕａｎ２００７００３＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ；元冬娟（１９８０－），女，硕士，科研助理，Ｅ－ｍａｉｌ：　ｙｕａｎｄｊ＠ｇｄｍｃ．ｅｄｕ．ｃｎ；江黎明（１９５７－），男，硕士，主任技师，硕士生导师，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：　ｌｍｊｉａｎｇ９＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）是一种常见的益生菌，它的应用已有上千年的历史，是一种公认的具有ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ　Ｒｅｇａｒｄｅｄ　Ａｓ　Ｓａｆｅ）的有益微生物。

近一二十年来，人们已致力于乳酸杆菌的生物学性质和分子机制的研究，并且建立和发展了一系列乳酸杆菌基因表达和呈递系统，乳酸杆菌作为肠道的微生态制剂和免疫接种的疫苗载体也显示了新的应用前景。

本文就乳酸杆菌基因组特点及外源蛋白表达系统的研究进展作一综述。

１． 乳酸杆菌基因组特点近年来，通过对比基因组学分析揭示出乳酸杆菌种属的多样性。

Ｃａｎｃｈａｙａ等通过对Ｌ．　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ　和　Ｌ．　ｓａｋｅｉ五种已知序列的乳酸杆菌基因组进行对比分析，显示出它们的基因组序列间没有广泛的同线性［１］。