重组质粒pRSET DNA纯化方法的比较

重组质粒的连接、转化及筛选概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。

如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。

在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。

但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。

通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。

外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。

也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。

2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。

由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。

所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。

还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。

带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。

质粒DNA的抽提与纯化（附注问题非常详细）第一篇：质粒DNA的抽提与纯化 (附注问题非常详细)质粒DNA的抽提与纯化(附注问题非常详细)目的：采用碱变性法，学习小规模制备质粒DNA的技术原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

仪器与主要试剂仪器（见附录）：主要试剂：溶液I：50 mmol/L 葡萄糖10 mmol/L EDTA 25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)2毫克/毫升溶菌酶溶液II：200 mmol/L NaOH 1% SDS 溶液III：3 mol/L NaAc(pH4.8)溶液TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 1 mmol/L EDTA实验方法：1．将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB 液体培养基的10毫升试管里，37℃振培过夜，16～18小时2．转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒3．小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀4．加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟5．加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟6．加入溶液III 150μl，将EP管盖紧后累累来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟7．12000rpm离心15分钟8．将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。

【实验目的】1、掌握碱变性提取质粒DNA法的原理、过程及各种试剂的作用。

2、掌握凝胶电泳对DNA分离纯化的原理和方法。

【实验原理】1、提取、纯化质粒DNA（碱变性提取法）提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。

其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。

该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。

提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。

细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。

在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。

当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。

这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。

溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。

由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA 沉淀，可利用RNase A将RNA降解。

质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

2、琼脂糖凝胶电泳电泳（electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。

各种生物大分子在一定条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。

质粒的纯化方法【最新版4篇】目录（篇1）I.质粒纯化的重要性II.质粒纯化的方法III.质粒纯化的注意事项正文（篇1）质粒纯化的重要性质粒是生物学实验中常用的载体，用于转移目的基因或表达特定的蛋白质。

质粒纯化的质量直接影响到实验结果的可靠性和准确性。

因此，在进行质粒纯化时需要特别注意。

质粒纯化的方法质粒纯化通常采用的方法包括超速离心、过滤和凝胶电泳。

超速离心法是一种常用的方法，通过将质粒DNA与其它杂质分开，从而达到纯化的目的。

过滤法则是通过滤膜过滤溶液，去除悬浮的杂质。

凝胶电泳则是通过分子量的大小来分离不同的DNA片段，从而得到纯度较高的质粒DNA。

质粒纯化的注意事项在进行质粒纯化时，需要注意以下几点：1.确保所使用的质粒DNA是新鲜的，避免使用已经降解的DNA。

2.在操作过程中，要避免手部接触DNA，以防止污染。

3.在离心或过滤过程中，要保证设备的清洁度，避免引入杂质。

4.在凝胶电泳时，要注意选择合适的凝胶浓度和电泳条件，以保证分离效果。

5.在得到纯度较高的质粒DNA后，要进行定量和测序分析，以确保其质量和可靠性。

总之，质粒纯化是生物学实验中不可或缺的一步，需要特别注意。

目录（篇2）I.质粒纯化的必要性1.实验中需要用到质粒DNA2.质粒DNA的纯化是进行基因克隆、转录和表达等实验的基础II.质粒纯化的方法1.酚氯仿抽提法2.乙醇沉淀法3.琼脂糖凝胶电泳分离法III.质粒纯化的步骤1.收集细胞破碎液2.加酚氯仿抽提3.沉淀加乙醇或NaAc4.溶于缓冲液或水中，电泳分离正文（篇2）质粒的纯化对于基因克隆、转录和表达等实验至关重要。

由于质粒DNA的浓度和纯度会影响实验结果，因此需要进行质粒纯化。

质粒纯化的方法有多种，包括酚氯仿抽提法、乙醇沉淀法以及琼脂糖凝胶电泳分离法等。

酚氯仿抽提法是一种常用的质粒纯化方法。

首先，收集细胞破碎液，加入酚和氯仿进行抽提。

接着，将混合物离心，上层液体为水相，而下层液体为有机相。

DNA重组常见问题TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些？参考见解： TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。

NEB公司的酶的活性很高，切出两条小带可能是因为出现星活性，可以试试把酶量减半。

NEB的酶很多都是克隆的，所以纯度比较高。

应用磁性微球提取人全血基因组DNA，将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应，应用Taq1酶，但发现酶切后产生的是smier片断，即切碎的状态。

不知原因是什么？在做这类实验时，一般是将PCR产物进行酶切，这与实验结果有联系吗？是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增，才能应用酶切？参考见解：1. 为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.关于文库建立园内资料很多.lyz703lyz战友感兴趣的话可以自己搜索下.2. 电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点,由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.3. 一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一,在了解了被切DNA上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切(Alu1酶)后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了,回收还是达不到浓度(大约只有0.06微克\微升),又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。

请教该怎么办？参考见解：回收酶切产物浓度低的原因可能是：苯酚/氯仿抽提时损失太多。

说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次，这样经过四次抽提DNA损失得非常多，解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水，然后再抽提，损失会减少很多；另外乙醇沉淀时可以延长，低温沉淀会提高得率；还有用80％乙醇洗涤沉淀弃上清时，要轻轻用移液枪吸出，防止将沉淀随上清倒出。

猪卵泡抑素基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达刘玉鹏;陈瑞爱;李超;施振旦【摘要】根据猪卵泡抑素(follistatin,FS)基因编码区序列(GenBank登录号:M36512.1)设计并合成1对引物,经PCR扩增获得了FS基因成熟肽序列,将其克隆入pMD18-T载体并转化E.coli DH5α感受态细胞,进行PCR、双酶切及测序验证.然后将其克隆到表达载体pRSET-A的BamH I和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pR-FS并转化E.coli BL21 (DE3)感受态细胞,再经PCR、双酶切和测序验证.转化重组质粒pR-FS的重组菌经IPTG诱导后的表达产物进行SDS-PAGE分析,分子质量与预期相符,为26.1 ku左右,经0.2 mmol/L IPTG诱导3h之后表达量达到最高,约占总菌体蛋白的30％.表达产物可经Ni-NTA凝胶纯化.以上结果表明正确完成了猪FS基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达及纯化.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)011【总页数】4页(P12-15)【关键词】卵泡抑素;成熟肽序列;克隆;表达【作者】刘玉鹏;陈瑞爱;李超;施振旦【作者单位】肇庆大华农生物药品有限公司,广东省兽用生物制品生物技术研究与应用企业重点实验室,广东肇庆 526238;华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;肇庆大华农生物药品有限公司,广东省兽用生物制品生物技术研究与应用企业重点实验室,广东肇庆 526238;华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;江苏省农业科学院畜牧研究所,江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】Q78卵泡抑素（follistatin，FS）是1987年由Robertson和Ueno分别从牛和猪的卵泡液中分离出的一种富含半胱氨酸的糖基化单链多肽，对促卵泡素（follicle-stimulating hormone，FSH）具有较强的抑制作用，因此又称为FSH抑制蛋白（FSH-suppressing protein，FSP）。

实验三：质粒DNA的提取和纯化整合外源DNA并将其带入宿主细胞的过程是分子克隆的关键。

而在此过程中携带外源基因的工具为质粒载体。

质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒有1）在宿主细胞中具独立复制能力；2)带抗性等选择标记；3)有合适的限制性内切酶位点，可插入一定片段长度的外源DNA而不影响自身复制的特点。

质粒具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息，但它的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，离开宿主细胞则不能存活。

质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性、对一些有机物的降解利用等。

F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型:严紧型(Stringent control)和松驰型(Relaxed control)，严紧型只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子；松驰型在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。

在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,宿主细胞蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。

同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)；但不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。

质粒载体是在天然质粒的基础上人工构建而成的。

与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因和一个有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点,去除了大部分非必需序列,分子量尽可能小。