ELISA的原理
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Elisa检测原理及注意事项
3.Elisa的样本提取液裂解能力比较差，或没有裂解能力，尽量将样 本磨碎。
4.试剂使用前要恢复到室温。
5.加样过程中枪头不要触碰到孔壁。
谢谢大家
5. Elisa实验注意事项：
1.加显色液要迅速，前后不要超过5min, 如果样本过多可以用排枪 加。
显色液加入以后，颜色反应就开始了，反应时间越长，颜色越深。
2.要通过预实验确定样本的稀释倍数，保证样本的吸光度在标准曲线 的量程内。吸光度超过量程，测出的浓度可能会偏低。公司的酶标仪 最高能测到4。
4. Elisa显色原理
Ab-HRP
PH<1
TMB+H2O2
H2O+OX-TMB
联苯醌 （450nm 测OD值）
蓝色 2M硫酸 黄色
酶标抗体：Ab-HRP HRP:辣根过氧化物酶 TMB：四甲基联苯胺(TMB) H2O2：过氧化氢 OX-TMB：一种氧化后的蓝色色物质
辣根过氧化物酶底物：鲁米诺、TMB 碱性磷酸酶底物：AMPPD β-D-半乳糖苷酶底物：甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷
洗
洗
涤
涤
颜色越深，待测抗 原浓度越低
标准曲线
6000
5000 4000
y = 7741.3e-1.255x R²= 0.996
3000
2000
1000
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
2.抗原、抗体与固相载体（Elisa 板底）结合原理
固相载体 聚苯乙烯，具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其 上后仍保留原来的免疫学活性。
洗
洗
洗
涤
涤
涤
抗原（待测蛋白）含量和颜色深 浅呈正相关，颜色越深，抗原含 量越高。
4.试剂使用前要恢复到室温。
5.加样过程中枪头不要触碰到孔壁。
谢谢大家
5. Elisa实验注意事项：
1.加显色液要迅速，前后不要超过5min, 如果样本过多可以用排枪 加。
显色液加入以后，颜色反应就开始了，反应时间越长，颜色越深。
2.要通过预实验确定样本的稀释倍数，保证样本的吸光度在标准曲线 的量程内。吸光度超过量程，测出的浓度可能会偏低。公司的酶标仪 最高能测到4。
4. Elisa显色原理
Ab-HRP
PH<1
TMB+H2O2
H2O+OX-TMB
联苯醌 （450nm 测OD值）
蓝色 2M硫酸 黄色
酶标抗体：Ab-HRP HRP:辣根过氧化物酶 TMB：四甲基联苯胺(TMB) H2O2：过氧化氢 OX-TMB：一种氧化后的蓝色色物质
辣根过氧化物酶底物：鲁米诺、TMB 碱性磷酸酶底物：AMPPD β-D-半乳糖苷酶底物：甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷
洗
洗
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颜色越深，待测抗 原浓度越低
标准曲线
6000
5000 4000
y = 7741.3e-1.255x R²= 0.996
3000
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1.5
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2.抗原、抗体与固相载体（Elisa 板底）结合原理
固相载体 聚苯乙烯，具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其 上后仍保留原来的免疫学活性。
洗
洗
洗
涤
涤
涤
抗原（待测蛋白）含量和颜色深 浅呈正相关，颜色越深，抗原含 量越高。
elisa过程原理
elisa过程原理
ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学检测方法，其过程原理如下：
1. 将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，保持其免疫学活性。
2. 利用酶标记（偶联）的抗体或抗原与之孵育，结合在固相载体上的酶标抗体或抗原仍保持其免疫学活性及酶的活性。
3. 加入显色剂显色，通过酶标仪测定待测物颜色与标准物颜色的差异，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
4. 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
具体的ELISA实验方法包括直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA法等。
其中直接ELISA将抗原固定于ELISA板上，然后用酶标抗体直检测抗原；间接ELISA先加入检测抗体与抗原特异性结合，再加入酶标二抗检测并利用底物显色；夹心ELISA先固定捕获抗体于ELISA板孔中，然后
加入样品，接着加入检测抗体；竞争ELISA法预先将抗原包被在固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体。
在测定的过程中，还需要注意洗涤的步骤，通过洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化水解或氧化还原反应而成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询专业医生。
elisa原理
elisa原理
Elisa原理。
酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测样本中特定蛋白质的存在。
它的原理基于抗体与抗原的特异性结合，利用酶的底物转化来定量检测目标分子。
下面将详细介绍ELISA 的原理及其应用。
ELISA的原理主要包括固相抗原或抗体的吸附、酶标记抗体或抗原的结合、底物的添加和反应物的检测。
首先，在微孔板或其他固相载体上吸附抗原或抗体，形成固相。
然后加入待检样品，目标分子与固相上的抗体结合。
接着，加入酶标记的抗体或抗原，与待检样品中的目标分子结合。
最后，加入底物，酶催化底物转化产生可测量的信号。
通过测量反应物的光密度或荧光强度，可以定量检测样品中的目标分子含量。
ELISA广泛应用于医学、生物学、环境监测等领域。
在临床诊断中，ELISA可用于检测病毒、细菌、荷尔蒙、肿瘤标志物等，具有高灵敏度和特异性。
在生物学研究中，ELISA可用于检测蛋白质相互作用、药物筛选、细胞因子浓度测定等。
此外，ELISA还可用于食品安全监测、环境污染检测等领域。
总之，ELISA作为一种高灵敏度、高特异性的实验方法，已成为科研和临床诊断中不可或缺的工具。
它的原理简单清晰，操作方便，结果稳定可靠。
随着技术的不断发展，ELISA在生物医学领域的应用将会更加广泛，为人类健康和生命科学研究提供更多可能性。
elisa检测原理
elisa检测原理Elisa检测原理。
ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学检测方法，广泛应用于医学、生物学、环境监测等领域。
它通过酶标记抗体与抗原结合，再用底物染色来检测抗原或抗体的存在。
ELISA检测原理主要包括固相吸附、特异性结合、酶标记、底物反应和测定等步骤。
首先，固相吸附是ELISA的第一步，将抗原或抗体固定在微孔板上。
通常使用多孔板，将待检样品加入微孔板后，待样品中的抗原或抗体与微孔板表面的特异性抗体结合。
接下来是特异性结合，待测物与固相上的特异性抗体结合形成抗原-抗体复合物。
这一步骤是ELISA检测的关键，只有特异性结合才能保证检测结果的准确性。
然后是酶标记，将与待检物特异性结合的酶标记抗体加入微孔板，与待检物形成“夹心式”结合。
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
接着是底物反应，加入底物后，酶与底物发生反应产生显色物质。
底物的种类与酶的种类有关，常用的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）和PNPP（对硝基苯磷酸）等。
最后是测定，测定产生的显色物质的光密度，根据光密度值来定量测定待检物的含量。
ELISA检测结果通常通过比较待检样品的吸光度值与标准曲线上的吸光度值来得出。
总的来说，ELISA检测原理是利用抗原与抗体的特异性结合，再通过酶标记和底物反应来产生显色物质，最终测定显色物质的光密度来定量测定待检物的含量。
这种方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单的优点，因此在医学诊断、生物学研究等领域得到了广泛应用。
ELISA原理及操作注意事项
ELISA原理及操作注意事项ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用于检测抗体或抗原的实验技术。
其原理是将待测物（抗体或抗原）通过特定的酶标记结合物与固定在试板上的配体结合，然后用底物与酶催化出彩色或荧光产物，从而通过测量产物的光学密度或荧光信号来定量检测待测物的含量。
1.实验仪器消毒：实验前应将使用的仪器、试剂瓶和器皿进行消毒，以避免实验中的污染。
2.条件优化：不同的ELISA实验条件可能有所不同，包括涂被物、孵育温度和时间、洗涤时间等，必须根据实验需要进行条件的优化。
3.阻断剂：在ELISA实验中，通常需要加入阻断剂（例如牛血清蛋白、鱼胶等）来减少非特异性的结合。
不同的样品可能需要不同的阻断剂浓度进行优化。
4.样品处理：对于待测物的检测，样品的处理包括稀释、加入试剂、混合等步骤。
处理时要注意对待测物的保存温度、避免阳性和阴性样品污染，以及避免样品的重复冻融过程，这可能会降低样品的稳定性。
5.孵育和洗涤步骤：酶标记物与涂被物结合的步骤通常需要进行一定的孵育时间和温度。
此外，洗涤步骤是为了去除不结合的物质，洗涤次数和洗涤液的成分必须根据实验需要进行优化。
6.制备酶标荧光物：在选择酶标物时，需要确保酶的活性和稳定性，并对荧光标记物的浓度和稀释倍数进行优化。
7.底物反应：根据所选择的酶，确定底物反应的最佳时间和温度。
避免底物超过反应时间，以防止过度反应导致结果不准确。
8.光学密度或荧光信号测定：ELISA的结果通常通过测量产物的光学密度（OD）或荧光信号来定量。
在测定前，必须确保光学和荧光仪器的正常工作，并根据实验条件和要求进行仪器校准。
9.数据分析：根据实验设计和实验目的，将ELISA的结果进行统计学分析，包括计算均值、标准差、相关系数等。
总结来说，ELISA是一种常用的实验技术，其原理基于酶催化反应。
在操作ELISA时需要注意实验仪器的消毒、条件的优化、样品的处理、酶标反应的制备和测定、以及数据的分析等方面。
elisa基本原理
elisa基本原理
ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定抗原或抗体的存在和浓度。
它的基本原理如下：
1. 固相吸附：首先，在试验板上吸附抗原或抗体。
通常使用多孔板（如96孔板），将要检测的抗原或抗体溶液加入到孔中，然后孔中的溶液经过吸附和固定，使抗原或抗体附着在孔壁上。
2. 样品处理：将待测样品加入到试验板中，与固定的抗原或抗体发生特异性的结合反应。
如果样品中存在目标抗原或抗体，它们将与固定在试验板上的抗体或抗原结合形成复合物。
3. 洗涤：通过洗涤步骤，将未结合的物质洗掉，以去除非特异性的成分，使只有特异性结合的复合物留在孔中。
4. 酶标记：加入酶标记的抗体或抗原，它们与目标抗原或抗体发生特异性的结合。
5. 洗涤：再次进行洗涤步骤，去除未结合的酶标记物。
6. 反应物添加：加入适当的底物，使酶标记物催化反应，产生可测量的信号。
常用的底物是染色剂，其颜色与酶标记物的酶活性成正比。
7. 反应停止：加入反应停止剂，停止底物的反应，防止颜色进一步发展。
8. 信号测量：使用光谱仪或酶标仪等设备测量反应产生的信号强度。
信号强度与目标抗原或抗体的浓度成正比。
通过比较待测样品与已知浓度标准曲线的信号强度，可以确定待测样品中目标抗原或抗体的浓度。
ELISA技术在生物医学研究、诊断和药物开发等领域广泛应用，可以检测多种疾病标志物和生物分子。
elisa实验原理
elisa实验原理Elisa实验原理。
Elisa（酶联免疫吸附实验）是一种常用的生物化学分析方法，主要用于检测和定量分析样品中的蛋白质、抗体、荷尔蒙、细胞因子等生物分子。
Elisa实验原理基于抗体与抗原特异性结合的原理，通过酶标记的二抗或底物来检测抗原-抗体结合物质。
下面我们来详细了解一下Elisa实验的原理。
首先，Elisa实验的基本原理是利用抗体与抗原的特异性结合。
在实验中，首先需要将待检测的抗原或抗体样品吸附在微孔板上，然后加入特异性的一抗，使其与待检测物质结合。
接着，加入酶标记的二抗，使其与一抗结合，形成抗原-抗体-酶标记二抗的复合物。
随后，加入底物，酶与底物发生反应产生显色物质，其光密度与待检测物质的浓度成正比。
最后，用酶标仪测定显色物质的光密度，从而定量分析待检测物质的浓度。
其次，Elisa实验的原理还涉及到酶标记技术。
在实验中，常用的酶标记方法有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
这些酶标记的二抗在与抗原-抗体复合物结合后，能够与底物发生化学反应，产生显色物质或荧光物质。
通过测定显色物质或荧光物质的光密度，可以间接反映待检测物质的浓度。
此外，Elisa实验的原理还涉及到微孔板的使用。
微孔板通常采用聚丙烯或聚碳酸酯材料制成，具有多孔结构，能够同时检测多个样品。
在实验中，将待检测的样品加入微孔板孔道中，利用微孔板的高通量特性，可以快速、准确地进行多个样品的检测和分析。
最后，Elisa实验的原理还包括数据分析和结果解读。
实验结果通常通过酶标仪或荧光分析仪测定显色或荧光物质的光密度值，然后通过标准曲线法或双对数法等方法，计算出待检测物质的浓度。
最终，根据实验结果，可以对待检测物质的浓度进行定量分析和结果解读。
总之，Elisa实验原理基于抗体与抗原的特异性结合，利用酶标记技术和微孔板的高通量特性，通过测定显色或荧光物质的光密度值，实现对待检测物质的定量分析。
这种实验方法在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用前景，为科研人员和临床医生提供了一种高效、准确的生物分子分析方法。
ELISA原理及步骤
ELISA原理及步骤ELISA，即酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay），是一种常见的免疫学实验技术，在生物医学研究和临床诊断中广泛应用。
它基于抗原与抗体的特异性结合，在酶的催化下，通过颜色的变化来检测和定量分析目标分子的存在。
一、ELISA原理1.包被：将抗原或抗体固定在微孔板表面。
2.孵育：加入待测标本，使抗原和抗体充分结合。
3.清洗：去除未结合的物质。
4.检测：加入酶标记的抗体或底物，与已结合的抗原或抗体反应。
5.测定：加入底物后，产生可测量的信号，如颜色变化。
6.分析：对信号进行测量和定量分析。
二、ELISA步骤1.准备试剂和材料：-抗原或抗体：根据需要选择合适的抗原或抗体。
-微孔板：常用的是96孔或384孔微孔板。
-缓冲液：包括洗涤缓冲液、稀释缓冲液等。
-酶标记二抗和底物：根据需要选择适合的酶标记二抗和底物。
2.包被抗原或抗体：-将抗原或抗体稀释至合适的浓度。
-加入微孔板孔中，使其吸附在孔底。
-孵育在4℃或37℃下，一般需要数小时或过夜孵育。
3.添加标本和控制样品：-将待测标本和控制样品逐孔加入微孔板中。
-孵育一段时间，使抗原和抗体发生特异性结合。
4.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。
-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。
5.加入酶标记二抗：-将酶标记的二抗加入每个孔中。
-孵育一段时间，使其与已结合的抗原或抗体结合。
6.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。
-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。
7.加入底物：-加入适合的底物。
-孵育一段时间，使底物与酶发生反应。
8.反应停止：-加入适当的溶液，停止底物酶反应。
9.测定信号：-使用光密度测定仪读取每个孔的吸光度。
-记录吸光度值，用于后续数据分析和定量结果。
三、ELISA的注意事项-实验过程中需严格控制温度和时间，尤其是孵育和洗涤步骤。
-各个试剂需事先准备好，避免其中一步骤时间过长导致信号的变化。
elisa原理及步骤
elisa原理及步骤Elisa原理及步骤。
ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度。
它的原理基于酶标记的抗体或抗原与待检测样品中的特定分子结合，然后通过酶介体的作用产生可定量检测的信号。
ELISA方法具有高灵敏度、高特异性和简单操作的特点，因此在生物医学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。
ELISA的原理。
ELISA方法的原理是基于抗体-抗原的特异性结合。
在ELISA实验中，待检测的抗原或抗体首先被吸附在微孔板上，然后加入特异性的酶标记抗体或抗原，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。
随后，通过加入底物使酶产生可定量检测的信号，最终通过光度计或荧光计测定信号的强度，从而确定待检测样品中抗原或抗体的浓度。
ELISA的步骤。
1. 样品处理，将待检测的样品（血清、尿液、细胞上清液等）进行处理，如离心、稀释等，以便得到适合实验的样品。
2. 固定抗原或抗体，将待检测的抗原或抗体溶液加入微孔板中，使其吸附在板上，然后对板进行洗涤，以去除未结合的物质。
3. 加入酶标记抗体或抗原，将特异性的酶标记抗体或抗原加入微孔板中，与固定的抗原或抗体结合，形成复合物。
4. 洗涤，对微孔板进行洗涤，以去除未结合的酶标记抗体或抗原。
5. 加入底物，加入适当的底物，使酶产生可定量检测的信号。
6. 反应停止，在适当的时间后，加入反应停止液停止酶的反应。
7. 测定光密度，使用光度计或荧光计测定产生的信号的强度，从而确定待检测样品中抗原或抗体的浓度。
ELISA方法的应用。
ELISA方法在临床诊断、生物医学研究和药物开发等领域得到了广泛的应用。
在临床诊断中，ELISA方法常用于检测感染病原体的抗体、抗原或相关蛋白质，如HIV、乙肝病毒、丙肝病毒等。
在生物医学研究中，ELISA方法常用于检测细胞因子、生长因子、激素等蛋白质的浓度，以及疾病标志物的检测。
elisa四种方法原理
elisa四种方法原理
ELISA（免疫酶联免疫吸附实验）原理：
ELISA（免疫酶联免疫吸附实验）是一种常见的免疫检测技术，可用于检测抗原（病原微生物或其产物）或抗体（就是人体免疫合成的抗体）。
ELISA技术是由美国科学家Engvall和 Perlmann在1971年开发的。
其原理是用待检样品中特异性的抗原或抗体，经过酶标记或免疫吸附后，与特异性的抗体或抗原结合，形成特异性的复合物，然后用酶试剂和酶色物质，利用酶-物质反应的特异性相互作用，使用特异性发光来检测复合物，从而实现抗原或抗体检测的目的。
ELISA可以分为四种：
1、双抗体免疫吸附ELISA法：在试剂盒中，将抗原（如病毒）固定在培养皿内，然后用一抗原特异性的抗体将抗体特异性的抗体结合起来；最后，添加特异性的抗体作为酶色原料，重复几次，即可得出检测结果。
2、双抗原免疫吸附ELISA：该法与上述方法类似，只是将抗原替换为特异性的抗体，而其余程序不变。
3、原位抗原免疫吸附ELISA：该方法与上述两种方法类似，但是在结合的特异性抗体上加入特异性的抗原，并将其结合在一起，用酶试剂和酶色物质来检测抗原-抗体复合物。
elisa实验原理及注意事项
elisa实验原理及注意事项：
一、实验原理
1.包被：抗原或者抗体能以物理性吸附于固相载体表面，原因是蛋白质和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原反应等免疫活性：
2、标记：抗原或者抗体可通过共价键与酶连接成酶结合物而此种酶结合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特点：
3、显色：酶结合物与相应包被在固相载体的抗原或抗体结合后，也被固定在固相载体上，加入酶的底物之后可出现显色反应，根据反应的颜色深浅可计算抗原或者抗体的相对含量。
二、注意事项
1、每个样本量收集体积=100ulx检测种类，如果要做复孔，标本量收集体积=100ulx检测种类x2；
2、样本收集后若在一周内进行检测可保存于2-8°C，若不及时检测，请进行分装，冻存于-20°或-80°C，避免反复冻融；
3、试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本。
4、血清标本采集是应注意避免溶血，红细胞溶解是会释放出具有过氧化物酶活性的物质，溶血标本可能会增加非特异性显色；
5、为了保证尿液检测的准确性，必须正确收集尿液标本和保存，收集尿液的容器必须要清洁干燥，最好使用一次性的容器，避免因用药并清洁不到而造成的污染，尿液样本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存；
6、标本宜在新鲜是检测如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
如在冰箱中保存过久，其中可能发生聚合，间接法ELISA中乐视本底加深；
7、反复冻融会使蛋白效价降低，所以待测样本如需多次检测，宜少量分装冻存；。
elisa法原理
elisa法原理Elisa法原理。
ELISA（酶联免疫吸附测定法）是一种广泛应用于生物化学和免疫学领域的实验技术，它通过测定抗体和抗原之间的相互作用来检测特定的蛋白质或其他分子。
ELISA法的原理基于酶标记抗体和底物的相互作用，通过酶的催化作用产生可定量检测的信号。
下面我们将详细介绍ELISA法的原理。
首先，ELISA法的基本原理是将待测样品中的抗原或抗体与已知的酶标记抗体或抗原结合，形成复合物。
然后，将这些复合物通过洗涤等步骤固定在固相载体（如微孔板）上。
接着，加入底物，酶标记物将催化底物的变化，产生可定量检测的信号。
最后，通过测定信号的强度，可以确定待测样品中抗原或抗体的浓度或存在与否。
其次，ELISA法可以根据酶标记抗体或抗原的不同，分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等类型。
直接ELISA是将酶标记抗体直接与待测样品中的抗原结合；间接ELISA是先与待测样品中的抗原结合，再加入酶标记的二抗；竞争ELISA是将待测样品中的抗原与固相载体上的抗原竞争结合，再加入酶标记的抗体；间接竞争ELISA是将待测样品中的抗原与固相载体上的抗体竞争结合，再加入酶标记的二抗。
不同类型的ELISA法适用于不同的实验需求，可以根据具体的实验目的选择合适的类型。
最后，ELISA法具有高灵敏度、高特异性和高重复性等优点，因此被广泛应用于生物医学研究、临床诊断、药物筛选等领域。
同时，ELISA法也存在一些局限性，如对抗体和抗原的特异性要求较高、操作步骤较多等。
因此，在进行ELISA实验时，需要严格按照操作规程进行，以确保实验结果的准确性和可靠性。
综上所述，ELISA法是一种基于酶标记抗体和抗原相互作用的实验技术，具有广泛的应用前景。
通过对ELISA法的原理和类型的深入了解，可以更好地进行实验设计和数据分析，为科研工作和临床诊断提供有力支持。
elisa包被原理
elisa包被原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用来检测样品中特定的抗原或抗体。
ELISA技术广泛应用于医学诊断、疾病监测、生物药物检测等领域。
本文将从ELISA的原理、步骤和应用方面进行阐述。
1. ELISA的原理ELISA的原理是通过特异性抗体与待测物（抗原或抗体）的相互作用来检测目标分子。
ELISA可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等几种类型。
以下以间接ELISA为例进行介绍。
间接ELISA的原理可以概括为以下几个步骤：(1) 吸附：将含有待测抗原的样品加入到微孔板中，使其吸附在孔底。
(2) 阻断：使用非特异性蛋白质（如牛血清蛋白）阻断孔底未被绑定的活性位点，减少非特异性吸附。
(3) 反应：加入特异性抗体与待测抗原发生特异性结合反应，形成抗原-抗体复合物。
(4) 探针：加入标记物（如酶）标记的另一种特异性抗体，与抗原-抗体复合物结合，形成新的复合物。
(5) 反应物：加入底物，底物被标记的酶催化转化，产生可检测的信号（如颜色变化）。
(6) 测量：测量底物转化的信号强度，与待测物的浓度成正比。
2. ELISA的步骤不同类型的ELISA可以有微小的差异，但通常包括以下几个基本步骤：(1) 孔板涂层：将特异性抗体或抗原溶液加入到微孔板中，使其吸附在孔底。
(2) 阻断：使用非特异性蛋白质阻断孔底未被绑定的活性位点。
(3) 样品加入：将待测样品加入到孔中与抗原或抗体相互作用。
(4) 洗涤：洗涤孔中的未结合物质，以去除非特异性结合物。
(5) 探针加入：加入标记物标记的特异性抗体与抗原或抗体结合。
(6) 再次洗涤：洗涤孔中的未结合的标记物。
(7) 反应物加入：加入底物，使其与标记物发生反应。
(8) 信号测量：测量底物转化的信号强度，通常使用光密度计或荧光检测仪。
3. ELISA的应用ELISA广泛应用于多个领域，包括医学诊断、疾病监测、生物药物检测等。
ELISA原理方法及操作细节
ELISA原理方法及操作细节一、ELISA的原理1.直接ELISA：将抗原直接附着在固相载体上，通过特异性抗体的结合来检测抗原的存在和浓度。
2.间接ELISA：将已知的抗原附着在固相载体上，再加入待测样品，通过特异性抗体和二抗的结合来检测抗体的存在和浓度。
3.夹心ELISA：分别在固相载体上附着抗原和特异性抗体，再加入待测抗原，通过特异性抗体和二抗的结合来检测抗原的存在和浓度。
4.竞争ELISA：将已知抗原和酶标记的抗原竞争与待测抗原中的特异性抗体结合，通过酶标记抗体的含量来反映待测抗原的浓度。
二、ELISA的方法以下以间接ELISA为例进行详细介绍ELISA的方法步骤：1.固相吸附：将已知抗原溶液加入微孔板孔中，使抗原吸附在孔壁上。
然后用PBS或BSA溶液冲洗孔板孔，以去除未结合的抗原。
2.阻断：加入BSA或牛血清蛋白溶液等阻断剂，封闭孔壁上的非特异性结合位点。
3.添加待测样品：加入待检测的抗体样品，经过适当的孵育后，将孔板洗涤，去除未结合的抗体。
4.加入检测抗体：加入与待测抗体特异性结合的二抗，如抗人IgG的辣根过氧化物酶（HRP）二抗，HRP会与抗体特异性结合，形成复合物。
5.反应缓冲液：加入含有HRP底物的反应缓冲液，允许HRP催化底物，产生荧光或颜色反应。
6.反应停止：加入止反应剂，停止酶反应，停止颜色的产生。
7.读取结果：使用酶标仪或光密度计测量各孔中的荧光或颜色的强度，根据强度值的差异来判断样品中抗原或抗体的存在和浓度。
三、ELISA的操作细节1.实验前准备：准备所需试剂、材料和设备，并确保其干净和无菌。
2.微孔板处理：在操作前检查微孔板的孔是否完整，边沿是否正常。
可事先进行热处理或使用已经处理好的微孔板。
3.孔的布置：根据需要设置对照孔和待测孔，每种样品应设置多个孔位，以保证实验的可靠性。
4.液体处理：液体的加入和去除要注意均匀和充分，特别是在液体去除时需要彻底排空。
5.孔板洗涤：洗涤液的选择要注意是否会影响特异性结合和反应的准确性，同时洗涤液的温度和洗涤次数也需要严格控制。
elisa主要原理
Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样品中的特定分子，如蛋白质、抗体、激素等。
Elisa的主要原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合来检测目标分子的存在和浓度。
Elisa的基本步骤包括以下几个关键步骤：
1. 涂层：将目标分子（抗原）固定在试验板的表面上，通常是通过将抗原溶液加入试验孔中，并在适当的条件下使其吸附在试验板上。
2. 阻断：为了防止非特异性结合，需要在涂层后加入一种阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼胶原等，以阻止未结合的位点。
3. 样品加入：将待测样品加入试验孔中，样品中的目标分子（抗原）与固定在试验板上的抗原结合。
4. 洗涤：通过多次洗涤，去除未结合的物质，以减少非特异性结合的干扰。
5. 二抗加入：加入与目标分子结合的二抗，通常是与目标分
子特异性结合的酶标记抗体。
这些抗体可以与目标分子结合，并形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。
6. 洗涤：再次进行洗涤，以去除未结合的二抗。
7. 底物加入：加入一种底物，通常是一种与酶标记抗体结合后能够产生可测量信号的底物。
酶标记抗体与底物反应后，会产生染色或荧光等信号。
8. 反应停止：通过加入一种反应停止剂，停止底物的反应，以防止信号继续增加。
9. 信号检测：使用光谱仪、荧光仪或酶标仪等设备，测量底物反应产生的信号强度。
信号的强度与目标分子的浓度成正比。
通过比较待测样品与标准曲线上的标准样品的信号强度，可以确定待测样品中目标分子的浓度。
elisa原理
elisa原理Elisa（酶联免疫吸附实验）是一种常用于检测特定抗原或抗体的实验方法。
它基于酶与抗原抗体相互作用的特性，通过检测酶的活性来间接测定待测物质的存在与数量。
Elisa的原理可以分为间接法、直接法和间接夹心法。
以下是介绍这些方法的详细原理：1. 间接法：该方法用于检测抗原。
首先，在试验板上涂布含有待测抗原的物质。
然后加入与该抗原特异性反应的抗体。
这些抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶）结合在一起。
随后，加入试液，其中包含检测样本中的抗体。
样本中的抗体与已有的抗原结合，形成抗原-抗体-酶复合物。
接下来，通过加入底物，酶的活性导致底物发生化学反应，生成可检测的产物。
产物的浓度与样本中的抗体浓度成正比，从而可以确定待测样本中的抗体含量。
2. 直接法：该方法用于检测抗体。
首先，在试验板上涂布已知抗原。
然后加入待测样本，其中的抗体将与试板上的抗原结合形成抗原-抗体复合物。
接下来，加入与该抗体特异性反应的酶标记二抗。
酶标记二抗与抗原-抗体复合物结合，形成双重复合物。
通过加入底物，酶的活性导致底物发生化学反应，生成可检测的产物。
产物的浓度与待测样本中的抗体浓度成正比。
3. 间接夹心法：该方法既可以用于检测抗原，也可以用于检测抗体。
首先，在试验板上涂布已知抗原。
然后加入待测样本，其中特异的抗体与试板上的抗原结合。
接下来，加入与该抗体特异性反应的酶标记二抗，形成抗原-抗体-酶标记二抗复合物。
随后，加入另一抗体（通常是与酶标记二抗相反的抗体）来结合酶标记二抗的未结合部分，形成夹心型复合物。
最后，通过加入底物，酶的活性导致底物发生化学反应，生成可检测的产物。
产物的浓度与待测样本中的抗原/抗体浓度成正比。
Elisa方法因其灵敏度高、特异性好、操作简单等优点而被广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域，用于疾病的诊断、检测生物标志物、药物研发等。
ELISA原理方法操作及注意事项
以生物素标记的抗体（或抗原）代替
原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。
ABS-ELISA法
Title in here
3. ELISA的操作
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制 血清 （定量测定中）； （5）标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液。
一、加样
在 ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本， 加酶结合物，加底物。有的测定（如间接法ELISA ）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释 后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入 血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混 和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道 加液器，使加液过程迅速完成。
ABTS[2,2'-azino-di-(3ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后 ，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便 ，是HRP结合物最常用的底物 。OPD本身难溶于 水，OPD·2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异 变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧 化氢混 合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用
竞争法测抗原
Title in here
捕获包被法
在临床检验中测定抗体IgM 时多采用捕获包被法。如用抗 原包被的间接法直接测定 IgM 抗体，因标本中一般同时存在 较高浓T度itle i的n IgG抗体，后者将 竞争结合here固相抗原而使一部份 IgM抗体不能结合到固相上。
原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。
ABS-ELISA法
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3. ELISA的操作
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制 血清 （定量测定中）； （5）标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液。
一、加样
在 ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本， 加酶结合物，加底物。有的测定（如间接法ELISA ）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释 后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入 血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混 和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道 加液器，使加液过程迅速完成。
ABTS[2,2'-azino-di-(3ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后 ，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便 ，是HRP结合物最常用的底物 。OPD本身难溶于 水，OPD·2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异 变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧 化氢混 合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用
竞争法测抗原
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捕获包被法
在临床检验中测定抗体IgM 时多采用捕获包被法。如用抗 原包被的间接法直接测定 IgM 抗体，因标本中一般同时存在 较高浓T度itle i的n IgG抗体，后者将 竞争结合here固相抗原而使一部份 IgM抗体不能结合到固相上。
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随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。 TMB（四甲基联苯胺）受光照的影响。但为保证实验结果的稳定性，宜在 规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随 即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。
不使用过期显色剂，肉眼可见浅兰色的TMB显色剂不能使用。 显色剂避
6 结果判断
定性测定
定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“ 阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一 系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。
根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不
稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。
在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞
2.分类：
放射免疫测定法：131I，32P
免疫荧光技术：FITC
异硫氰酸荧光素
，PE
藻红蛋白
免疫酶测定法：HRP
辣根过氧化物酶
，AP
碱性磷酸酶
免疫酶测定法
(Enzyme Immuno Assay,EIA)
• 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
– 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)
显色 HRP的底物
DH2+ H2O2 E D+ 2H2O 上式中， DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。 TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试
剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝
标本的采取和保存
（3）冰冻保存的标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。 标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用 ，从而引起假阴性结果。此外，冻结样本溶解后，蛋白质局部浓缩、分布不 均，应上下颠倒轻缓混匀，避免气泡，不要在混匀器上强烈振荡。 反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测， 宜少量分装冰冻保存。
温育
抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等 。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结
合的合适温度。 注意3点： 1． 严格按照说明书要求，按规定的温度和温育时间进行。 2． 为避免孔内液体蒸发，可用封板胶将ELISA板面密封后 进行温育。 3． 温育时尽量少开启恒温箱门，不能人为缩短或延长温育 时间。
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
ELISA的试剂
ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的
底物。
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；
免在空气中暴露时间过长。 加显色剂尽量避免溅出孔外。37度避光显色 。
比色
拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。
以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的 孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔 ），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水 校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进 行计算。
色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm，是HRP结合物 最常用的底物。 。 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物 和尿素过氧化物(urea peroxide)。
显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间
仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则
争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。
4. ELISA的操作要点
严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保 证ELISA必要条件。 严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。
ELISA的优点： 血清学方法有很多种, 如传统的琼脂扩散( A G ID ) 、 血凝抑制( H A / H I ) 、 乳胶凝集、 试管凝集、补体 结合等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。 EILSA技术与其有着不同的特点： 1、灵敏度高。ELI SA是通过酶促反应放大检测信号, 从而提高检测的灵敏度, 其检测限可达 ng 甚至pg 水平, 可做定量测定。 2、特异性强。ELI SA的每一步体的特异性识别过程, 结构类似物、 有色物质、 荧光物质等对检测的影响很 小。 3、样品的预处理过程和 ELI SA的操作步骤简单快捷， 有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可 同时检测数十甚至上百个样品。 4、设备简单，适用于基层。
酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ）
ELISA的基本原理
①使抗原或抗体结合固相载体表面，并保持活性。
②使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原。 ③在测定时，把受检抗体（或抗原）和酶标抗原（或抗 体）按不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体） 起反应。
试剂的准备 1.放冰箱内保存的试剂、在使用前应先恢复到室温。 2.仔细检查试剂各组分是否变质。 3.保存试剂的冰箱应定期检查其贮存温度（正常为28℃），并尽量避免冰箱频繁开关。 4.试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 5. ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应 为新鲜的和高质量的。
④用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原（或抗体），最 后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成 一定的比例。 ⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。 ⑥产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据 颜色反应的深浅来定性或定量分析。
免疫标记
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同 位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标 记物，间接测定未知的抗原或抗体。
1.定义 2.分类
用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）
中未知抗体或抗原的方法。
间接法（Indirect ELISA）：
• • • • 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体
双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：
将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原
洗涤
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验 的成败。 ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰 物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把
这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。 洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手 工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液； （7）酶反应终止液
标本的采取和保存
体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。 未抗凝血标本离心前一般令其自行凝集，不可用木棍等剥离凝血块。通常于室温（ 20－25℃）放置30－60min，血标本可自发完全凝集，析出血清；或37℃水浴20－ 30min，析出血清。 以3000r/min转速离心5－10min，使血清分离完全。 若过早离心，分离不全，血清中会残留部分纤维蛋白原，吸附于反应微孔，并且不 易洗去，可与酶标记物非特异性结合，造成假阳性。
标本的采取和保存
（2）血清标本宜在新鲜时检测，要注意尽量避免细菌污染。 血清标本如在冰箱中保存过久，IgG可发生聚合，AFP可形成二聚体，使本 底加深，产生假阳性反应。 细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；一些细菌 的内源性酶可对以相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。标本在保存 中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。
• 特点：
高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测
定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值
• 分类：
酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体
酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
（1）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗 涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快 速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗 涤。让水流冲击板孔。洗涤液为非离子型洗涤剂 的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的， 非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回 复到水溶液状态，从而脱离固相载体。
竞争法（Competitive ELISA) ：
• • 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
标本的采取和保存
（1）要注意避免出现严重溶血、脂血标本。 血红蛋白中铁卟啉具有类似过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶 （HRP）为标记酶的ELISA测定中，如标本溶血，血清中血红蛋白浓度较高 ，则其很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的底物反应，从而 产生非特异性显色。 脂血标本血清中大量的脂质小粒易黏附于反应孔内壁，非离子型洗涤剂(如 乳化剂OP)难以洗去，易产生非特异性吸附干扰。
加样:
在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底
物。
1． 严格按照说明书要求，按规定的量和顺序进行。 2． 使用的微量加样器应注意保养并定期校正。 3． 加样前应使溶液充分混匀，并将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，注 意不可出现气泡。加样前要看移液器的液面是否平齐。 4． 加样时避免样本溅出，如有样本溅出孔外时，应用吸水纸轻轻拭干，并 做相应记录。 5． 加样后微孔板应及时温育，尽量缩短加样后温育前的等待时间。 6. 如果加样枪漏气以至于加样的量不够，不能用枪吸出再加，避免污染整 条甩掉再重新加。
不使用过期显色剂，肉眼可见浅兰色的TMB显色剂不能使用。 显色剂避
6 结果判断
定性测定
定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“ 阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一 系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。
根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不
稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。
在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞
2.分类：
放射免疫测定法：131I，32P
免疫荧光技术：FITC
异硫氰酸荧光素
，PE
藻红蛋白
免疫酶测定法：HRP
辣根过氧化物酶
，AP
碱性磷酸酶
免疫酶测定法
(Enzyme Immuno Assay,EIA)
• 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
– 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)
显色 HRP的底物
DH2+ H2O2 E D+ 2H2O 上式中， DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。 TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试
剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝
标本的采取和保存
（3）冰冻保存的标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。 标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用 ，从而引起假阴性结果。此外，冻结样本溶解后，蛋白质局部浓缩、分布不 均，应上下颠倒轻缓混匀，避免气泡，不要在混匀器上强烈振荡。 反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测， 宜少量分装冰冻保存。
温育
抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等 。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结
合的合适温度。 注意3点： 1． 严格按照说明书要求，按规定的温度和温育时间进行。 2． 为避免孔内液体蒸发，可用封板胶将ELISA板面密封后 进行温育。 3． 温育时尽量少开启恒温箱门，不能人为缩短或延长温育 时间。
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
ELISA的试剂
ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的
底物。
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；
免在空气中暴露时间过长。 加显色剂尽量避免溅出孔外。37度避光显色 。
比色
拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。
以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的 孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔 ），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水 校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进 行计算。
色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm，是HRP结合物 最常用的底物。 。 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物 和尿素过氧化物(urea peroxide)。
显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间
仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则
争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。
4. ELISA的操作要点
严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保 证ELISA必要条件。 严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。
ELISA的优点： 血清学方法有很多种, 如传统的琼脂扩散( A G ID ) 、 血凝抑制( H A / H I ) 、 乳胶凝集、 试管凝集、补体 结合等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。 EILSA技术与其有着不同的特点： 1、灵敏度高。ELI SA是通过酶促反应放大检测信号, 从而提高检测的灵敏度, 其检测限可达 ng 甚至pg 水平, 可做定量测定。 2、特异性强。ELI SA的每一步体的特异性识别过程, 结构类似物、 有色物质、 荧光物质等对检测的影响很 小。 3、样品的预处理过程和 ELI SA的操作步骤简单快捷， 有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可 同时检测数十甚至上百个样品。 4、设备简单，适用于基层。
酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ）
ELISA的基本原理
①使抗原或抗体结合固相载体表面，并保持活性。
②使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原。 ③在测定时，把受检抗体（或抗原）和酶标抗原（或抗 体）按不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体） 起反应。
试剂的准备 1.放冰箱内保存的试剂、在使用前应先恢复到室温。 2.仔细检查试剂各组分是否变质。 3.保存试剂的冰箱应定期检查其贮存温度（正常为28℃），并尽量避免冰箱频繁开关。 4.试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 5. ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应 为新鲜的和高质量的。
④用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原（或抗体），最 后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成 一定的比例。 ⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。 ⑥产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据 颜色反应的深浅来定性或定量分析。
免疫标记
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同 位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标 记物，间接测定未知的抗原或抗体。
1.定义 2.分类
用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）
中未知抗体或抗原的方法。
间接法（Indirect ELISA）：
• • • • 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体
双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：
将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原
洗涤
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验 的成败。 ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰 物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把
这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。 洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手 工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液； （7）酶反应终止液
标本的采取和保存
体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。 未抗凝血标本离心前一般令其自行凝集，不可用木棍等剥离凝血块。通常于室温（ 20－25℃）放置30－60min，血标本可自发完全凝集，析出血清；或37℃水浴20－ 30min，析出血清。 以3000r/min转速离心5－10min，使血清分离完全。 若过早离心，分离不全，血清中会残留部分纤维蛋白原，吸附于反应微孔，并且不 易洗去，可与酶标记物非特异性结合，造成假阳性。
标本的采取和保存
（2）血清标本宜在新鲜时检测，要注意尽量避免细菌污染。 血清标本如在冰箱中保存过久，IgG可发生聚合，AFP可形成二聚体，使本 底加深，产生假阳性反应。 细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；一些细菌 的内源性酶可对以相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。标本在保存 中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。
• 特点：
高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测
定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值
• 分类：
酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体
酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
（1）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗 涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快 速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗 涤。让水流冲击板孔。洗涤液为非离子型洗涤剂 的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的， 非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回 复到水溶液状态，从而脱离固相载体。
竞争法（Competitive ELISA) ：
• • 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
标本的采取和保存
（1）要注意避免出现严重溶血、脂血标本。 血红蛋白中铁卟啉具有类似过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶 （HRP）为标记酶的ELISA测定中，如标本溶血，血清中血红蛋白浓度较高 ，则其很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的底物反应，从而 产生非特异性显色。 脂血标本血清中大量的脂质小粒易黏附于反应孔内壁，非离子型洗涤剂(如 乳化剂OP)难以洗去，易产生非特异性吸附干扰。
加样:
在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底
物。
1． 严格按照说明书要求，按规定的量和顺序进行。 2． 使用的微量加样器应注意保养并定期校正。 3． 加样前应使溶液充分混匀，并将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，注 意不可出现气泡。加样前要看移液器的液面是否平齐。 4． 加样时避免样本溅出，如有样本溅出孔外时，应用吸水纸轻轻拭干，并 做相应记录。 5． 加样后微孔板应及时温育，尽量缩短加样后温育前的等待时间。 6. 如果加样枪漏气以至于加样的量不够，不能用枪吸出再加，避免污染整 条甩掉再重新加。