蛋白质工程培训课件
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蛋白质工程PPT教学课件
• 干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干 扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干 扰素的抗病毒活性为106 U/mg，只相当于天然 产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的β-干 扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存 在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发 现，β-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、 31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱 氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位 的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸， 结果使大肠杆菌中生产的β-干扰素的抗病性活性 提高到108 U/mg，并且比天然β-干扰素的贮存 稳定性高很多。
1.1774年舍勒研究软锰矿时，偶然发现黄绿色气体。 2.很遗憾，受错误学说影响,他认为是氧化物。 3.1810年，由戴维最终确定其为单质。 舍勒 (1742～1786)瑞典化学 4.氯气的发现到确认为一种新的元素组成的单质，时 间长达三十多年。 5.舍勒（1742-1786），瑞典化学家，44岁去世； 戴维（1778-1829），英国化学家，以电解法研究氯 气、碱金属、碱土金属闻名， 52岁时死于肺部疾病。
案例再现
“果林氯气泄漏案”：1999年10月淮阴县果林乡一个体废 品收购站在切割一废弃的氯气钢瓶时造成氯气泄漏，使 得果林小学30 多名师生中毒。当时情况如图：
风向 西
泄漏点
较高堤坝
果林 小学
洼地
南
问题：若让你指挥果林小学师生疏散，你将怎样指挥以 避免这场灾难？你的依据是什么？
[科学史话]
请阅读P83“科学史话”－“氯气的发现和确 认”，你从这一史实中得到什么启示？
地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;
（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包 括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；
完整版蛋白质工程.pptx
蛋白质工程的崛起
蛋白质工程的概念
享学课堂
是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为 地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去 改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。 或者从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造天 然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以 制造新型的蛋白质。
..分割..
..分割..
9
酶工程简介
酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程 学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护 等方面的一门科学技术。由酶制剂的生产和应用两方 面组成的。 酶工程通常是用工程菌生产酶制剂，重点在于对已存 酶的合理充分利用。 蛋白质工程的重点那么在于对已存在的蛋白质分子的 改造。 随着蛋白质工程的开展，其成果也会应用到酶工程中， 使酶工程成为蛋白质工程的一局部。
..分割..
10
..分割..
5Hale Waihona Puke ..分割..6〔1〕 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。有多少种 16种
〔2〕 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或 改造目的基因〔DNA〕？
确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改 造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。
..分割..
推测氨基酸序列
依据是什么
依赖于什么工程
投入生产
相应的脱氧核苷酸序列（基因）
..分割..
4
讨论
讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是： …—丙氨酸—色氨酸—赖氨酸—甲硫氨酸—苯 丙氨 酸—… 〔1〕 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。有多少种？
〔2〕 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或 改造目的基因〔DNA〕？
蛋白质工程的概念
享学课堂
是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为 地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去 改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。 或者从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造天 然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以 制造新型的蛋白质。
..分割..
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9
酶工程简介
酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程 学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护 等方面的一门科学技术。由酶制剂的生产和应用两方 面组成的。 酶工程通常是用工程菌生产酶制剂，重点在于对已存 酶的合理充分利用。 蛋白质工程的重点那么在于对已存在的蛋白质分子的 改造。 随着蛋白质工程的开展，其成果也会应用到酶工程中， 使酶工程成为蛋白质工程的一局部。
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10
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5Hale Waihona Puke ..分割..6〔1〕 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。有多少种 16种
〔2〕 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或 改造目的基因〔DNA〕？
确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改 造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。
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推测氨基酸序列
依据是什么
依赖于什么工程
投入生产
相应的脱氧核苷酸序列（基因）
..分割..
4
讨论
讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是： …—丙氨酸—色氨酸—赖氨酸—甲硫氨酸—苯 丙氨 酸—… 〔1〕 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。有多少种？
〔2〕 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或 改造目的基因〔DNA〕？
《蛋白质工程》PPT课件
➢基因重组技术：如定位突变技术，盒式突变， PCR技术
整理ppt
14
定向进化 Directed evolution
• 定向进化是一种用在蛋白质工程中的方法
• 利用定向进得到在自然界中未发现发现蛋 白质或RNA。
整理ppt
15
定向进化实验步骤
• 多样化，Diversification: 在此步骤中常用的 技术是易错PCR和DNA改组。突变库
包括数据分析处理算法的研究，蛋白质设计
模拟模型的建立以及计算机程序编写和软件
可用性的研究
整理ppt
12
Protein design
• Protein design is the design of new protein molecules from scratch, or the deliberate design of a new molecule by making calculated variations on a known structure.
整理ppt
5
实际应用
• 提高蛋白质的稳定性 • 融合蛋白质 • 蛋白质活性的改变 • 治疗酶的改造 • 嵌合抗体和人缘化抗体
整理ppt
6
蛋白质工程的研究策略
整理ppt
7
蛋白质工程的基本途径
• 蛋白质结构分析 • • 结构、功能的设计和预测
• 创造和改造
整理ppt
8
两个战略
➢合理设计 蛋白质计算机设计。使用计算机的方 法设计蛋白质是最具挑战性的工作。
整理ppt
24
定向进化的历史
• 1981年，B.G.Hall等定向改变E.coliK12中 ebg酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有 水解能力的酶。
《蛋白质工程》课件
生物医学
蛋白质工程可用于研究 和治疗疾病，例如设计 和优化抗体、酶和细胞
因子等。
农业与食品工业
蛋白质工程可用于改良 农作物和食品品质，提
高产量和营养价值。
环保与能源领域
蛋白质工程可用于设计 和优化微生物，以实现 废物处理、生物燃料生
产等目标。
CHAPTER 02
蛋白质的结构与功能
蛋白质的一级结构
重要性
功能域和活性位点是理解蛋白质功能的关键，对蛋白质工程和药物 设计具有重要意义。
影响因素
功能域和活性位点的形成受一级结构、二级结构和高级结构的影响 ，同时与蛋白质与其他分子的相互作用有关。
CHAPTER 03
蛋白质工程的遗传操作
基因突变技术
随机突变
01
通过化学诱变、物理诱变等方法在基因序列中引入随机突变，
定义
蛋白质的二级结构是指局部主链的折叠方式，常见的二级结构包括 α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等。
重要性
二级结构是构成蛋白质三级结构的重要基础，对蛋白质的功能具有 重要影响。
影响因素
二级结构的形成受一级结构的影响，同时与蛋白质所处的环境条件有 关。
蛋白质的高级结构
定义
蛋白质的高级结构是指整条肽链 中不同二级结构的组合方式，包 括蛋白质的构象、亚基聚合方式 以及与其他分子间的相互作用等
通路分析
通过分析蛋白质在生物体内的相互作用网络，揭示其在信号转导、代谢等通路中的作用，为药物研发 和疾病治疗提供靶点。
CHAPTER 05
蛋白质工程的实验技术
蛋白质的分离与纯化
蛋白质的分离与纯化是蛋白质工程实 验技术的关键步骤之一，其目的是将 目标蛋白质从复杂的生物样本中分离 出来，并提高其纯度。
生物化学课件-protein-engineering蛋白质工程全
Glycosylated cC I66Q/I108T
Fig. Proposals to explain how glycosylation affect the fibrillization mechanism.
17(2)-29
思考题
1、中心法则的含义 2、基因工程的概念及其基本步骤 3、蛋白质工程的概念和基本方法 4、举例说明蛋白质工程在改善蛋白质功能方 面的应用 5、生物工程与基因工程、蛋白质工程的关系
形代表由Thr40, Ile55和Ser91等构
成疏水中心.
17(2)-16
通过蛋白质工程对溶菌酶的改造
• 热稳定性的提高
– 加强疏水中心：S91T – 点突变，引进糖链
• 抗菌范围的扩大
– 融合疏水性短肽片断
17(2)-17
19位和49位氨基酸突变而糖基化的溶菌酶
Asn19-Tyr20-Arg21 Asn19-Tyr20-Thr21
• 枯草杆菌蛋白酶
– 洗衣粉的添加酶制剂 – 工业酶制剂中市场最大
• 增强抗氧化性？
• 理论设计：
– 改进Met222
枯草杆菌蛋白酶活性中心构造图
17(2)-9
增强抗氧化性的定点突变
222位氨基酸单点突对变于枯野草生杆型菌的相蛋白酶与22野2位生氨型基的酸比活比对较于野生型的相
对比活 (％)
对比活 ( ％)
第十七章 基因工程和蛋白质工程
17(2)-1
第三节 蛋白质工程
• 概念：重点 • 一般技术； • 应用示例
17(2)-2
* 蛋白质的广泛功能
• 酶的催化作用: –SOD,植酸酶,酪氨酸酶,角蛋白酶,凝血酶，溶菌酶
• 信号传递：膜受体蛋白把信号传入细胞内部。 • 转运与贮存:
蛋白质工程PPT通用课件.ppt
D．蛋白质工程与基因工程密不可分，又被称为第二 代基因工程
4、蛋白质工程的基本流程正确的是（Ｃ ）
①蛋白质分子结构设计②DNA合成③预期蛋 白质功能④根据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序 列
A．①②③④ B．④②①③ C．③①④② D．③④①②
5、蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出 来的第二代基因工程，其结果产生的蛋白质 是（ Ｄ ）
体外很难保存
干扰素（丝氨酸）
体外可以保存半年
满足人类 生产和生 活的需要
玉米中赖氨酸含量比较低
玉米中赖氨酸含量可提高数倍
天冬氨酸激酶 （352位的苏氨酸）
改造
天冬氨酸激酶（异亮氨酸）
二氢吡啶二羧酸合成酶 改造 （104位的天冬酰胺）
二氢吡啶二羧酸合成酶 （异亮氨酸）
二、蛋白质工程的基本原理
对天然蛋白质进行改造，你认为直接对蛋白质分 子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？
比较基因工程和蛋白质工程
基因工程
蛋白质工程
相同点 操作环境——生物体外；操作对象—— 基因；操作水平——分子
结果 天然存在的蛋白 自然不存在的蛋白
实质
基因重组 基因修饰或基因合成
流程
中心法则
中心法则逆推
蛋白质工程是在基因工程基础上的延伸， 联系 是第二代基因工程
三、蛋白质工程的进展和前景
1.进展 2.前景
目标: 改造或制造新的蛋白质，满足人类的 生产或生活的需要
蛋白质工程的实质： 是对编码蛋白质的基因进行改造
讨论：对照密码表，至少写出三种决定
“—丙氨酸—色氨酸—赖氨酸—甲硫氨酸— 苯丙氨酸—”的脱氧核苷酸序列。（P27）
—丙氨酸—色氨酸—赖氨酸—甲硫氨酸—苯丙氨酸—”的脱氧核苷酸序列 20种氨基酸的密码子表
蛋白质工程课件
04
蛋白质工程的应用
疾病治疗与预防
蛋白质药物设计与优化
疫苗开发
通过蛋白质工程技术，对蛋白质药物 的结构进行改造和优化，提高其稳定 性和药效，降低副作用。
通过蛋白质工程技术，设计和制备新 型疫苗，提高疫苗的免疫原性和保护 效果，有效预防传染病的发生。
靶向治疗
利用蛋白质工程技术，设计和开发具 有特定靶向功能的蛋白质药物，实现 对肿瘤、炎症等疾病的精准治疗。
蛋白质的分离与纯化
总结词
利用各种分离纯化技术，从生物样品中 提取和纯化目标蛋白质。
VS
详细描述
分离与纯化技术是蛋白质工程中的重要环 节之一，其目的是从复杂的生物样品中提 取和纯化目标蛋白质。常用的分离纯化方 法包括离心、沉淀、萃取、电泳、色谱等 技术。通过选择合适的分离纯化方法，可 以获得高纯度、高活性的目标蛋白质，为 后续的结构和功能研究提供基础。
蛋白质工程发展历程
自20世纪80年代初蛋白质工程概念提出以来，该领域经历了从实验室 研究到实际应用的快速发展，目前已成为生物技术领域的重要分支。
感谢您的观看
THANKS
蛋白质的体外定向进化
总结词
通过模拟自然进化过程，在体外对蛋白质进行选择和优化，以获得具有所需性质和功能 的突变体。
详细描述
体外定向进化技术包括体外突变、体外筛选和体外进化三个步骤。通过随机或定点突变 产生变异体库，再利用筛选方法从中选择出具有优良性质的突变体，经过多轮进化可获 得性能显著提高的蛋白质。该技术广泛应用于酶工程领域，用于改进酶的催化活性、稳
特点
蛋白质工程具有高度定向性、可 预测性和可控制性，能够针对特 定需求对蛋白质进行改造，提高 蛋白质的性能和功能。
蛋白质工程的重要性
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的片段 – 将这些片段混合，进行无引物PCR – 加入DNA连接酶，使DNA小片段重新连接，可能获得
有价值的新组合 – 通过合适的表型筛选系统进行选择
• 这种方法甚至能够改变酶分子的底物特异性，还可 以实现酶的稳定性及催化活性的改良。
DNA shuffling
Reshuffle
一组相关的基因
DNase I 随机切割
N MLLQAFLLAGFAAKISA S
• 信号肽的重要性就在于它是蛋白质向细胞外分泌的 充分必要条件，因此研究人员开发了一系列利用信 号肽进行蛋白分泌表达的载体。
• 细菌中B. subtilis 是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵 母S. cerevisiae、P. pastoris和曲霉属的霉菌则是比较
• 这种能够改变蛋白质的功能，或者设计和创造具有 某种功能的新蛋白的技术被称为‘蛋白质工程’。
• 蛋白质工程的终极目标：
① 根据氨基酸序列正确预测蛋白质的结构与功能; ② 使用天然或非天然氨基酸甚至化学合成的分子自由地
创造具有期望结构和功能蛋白质。
蛋白质工程
• 从实际应用来看，酶、抗体、受体、运输蛋白、信 号转导蛋白、转录因子等均可以成为蛋白质工程的 改造对象。
• 先将该序列导入目标基因中想要导入该氨基酸的位 置，同时用‘化学酰胺化’的方法得到该氨基酸的 氨酰tRNA，使携带识别CGGG的反密码子的tRNA 与非天然氨基酸结合。
Ser
tRNA UCG
AGC ·AGC ·ACC
mRNA
硝基苯丙氨酸 (化学酰胺化法）
GCCC AGC ·CGGG ·ACC
在体外无细胞翻译体 mRNA 系中进行蛋白质合成
洗涤剂用酶
• 洗涤剂用酶是洗涤剂中不可或缺 的成分，常添加的酶包括蛋白酶、 淀粉酶、脂肪酶等。其市场需求 量在不断增加。
• 在各种酶制剂联合使用以提高洗 涤效果的同时，科研人员也致力 于通过蛋白质工程手段改善每种 酶的功能。
• 蛋白酶：蛋白酶是洗涤剂中最重 要、使用量最大的酶制剂。
洗涤剂用酶
• 在长期保存的过程中，洗涤剂中的漂白成分会引起 酶的失活，可能是由于位于活性中心附近的Met被 氧化所引起。
• 因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时 才进行强力表达的诱导性启动子。
• E. coli的诱导表达系统几乎全部是利用E. coli 来源 的各种操纵子中的启动子，如lac启动子。
E. coli 的乳糖操纵子lac operon
P lac I
调节基因
启动子
Plac O
操纵 基因
lac Z
lac Y
适合作分泌蛋白生产的真核生物宿主。
宿主的蛋白降解系统
• 影响蛋白质表达量的一个重要的宿主因素是宿主本 身的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋 白酶缺陷的突变株。
• 如E. coli BL21（DE3）是基因表达实验中最常与
pET系列质粒配合使用的宿主菌，B株系天然缺失 lon蛋白酶（K12有）。研究人员又向其引入了蛋白 酶OmpT的缺失突变，有利于提高蛋白产量。
UAS TATA
启动子
• 根据表达的方式可以把启动子分为两类：
– 构成性表达启动子：持续表达 – 诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。
宿主
大肠杆菌E. coli
枯草芽孢杆菌
酿酒酵母S. cerevisiae
启动子
构成性表达
诱导表达
lac, tac, ara pBAD, λPL, T7
蛋白酶、淀粉酶基因 的启动子
savinase的基因进行定点板，进行低温条件下的 酶促反应。获得的突变型酶在15℃时的洗涤效果有 显著提高（Kannase®，Novozymes，1997）。
• 淀粉酶：大量用于餐具的自动化清洗。来源于B. licheniformis 的α-淀粉酶性能优良，但是不抗氧化剂。
• 以融合蛋白形式进行表达的
额外的好处是可以对目标蛋
ampr
表达载体
白进行亲和层析纯化，能大 大简化蛋白的纯化过程。
ori
融合蛋白的亲和层析法纯化
GST
树脂颗粒
GST
结合
谷胱甘肽硫转移酶 谷胱甘肽，GSH 目标蛋白
GST
GST
洗脱
GST
GST
蛋白酶
蛋白质工程
• 随着科学家对蛋白质的结构与功能之间关系的认识 更加深刻，到1980年前后科学家们已经可以根据不 同的目的来设计和创造突变蛋白质分子。
• 原核基因的启动子主要包括-35和-
10区，真核基因启动子则主要是
TATA盒与一些上游转录活化序列 UAS。这些序列被称作顺式作用
真核基因启动子
元件（cis序列）。
RNA聚合酶
• 一般认为启动子的强度与cis序列 的最佳配置相关，在人工构建强 启动子时主要是尝试把不同基因 的启动子的cis序列进行重组。
• 如果把该Met替换为其他氨基酸，可以提高酶分子 的抗氧化性能。
• 例如：来源于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶，将其 Met222替换为Ala后，经100mM H2O2处理15min后残 余活力由野生型的30%提高到70%。（诺维信 Novozymes的产品Esperase®。）
洗涤剂用酶
• 低温蛋白酶的开发：对B. clausii 来源的蛋白酶
启动子 SD
目的基因
终止子
• 当对特定基因进行强力表达时，转录可能会波及该 基因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会 使质粒的稳定性下降。
• 因此为了提高生产性能，往往会在目的基因下游添 加终止子序列。如E. coli中的rRNA基因rrnB的终止 子、T7噬菌体的终止子等。
密码子使用频率
• 不同物种对各种密码子的使用频 率不同，原因之一是细胞中各种 tRNA分子所占的比例不同。
ampr
lacZ’
• 在以E. coli为宿主的生产中，常使 用可以根据培养温度调整拷贝数的 runaway质粒（如pCP3），42 ℃时 拷贝数最高可达几千个。
复制起点ori
启动子的强度
• 启动子的强度是指一个启动子能 够多大程度地结合RNA聚合酶并 引发转录过程。
原核基因启动子
RNA 聚合酶
-35 -10
• 在目前，从头设计具有全新的结构和生物功能的蛋 白质分子相当困难，更多的工作是对现有蛋白质的 改造。蛋白质改造的技术主要有：
① 随机突变法 ② 定点突变法 ③ DNA shuffling ④ 非天然氨基酸导入 ⑤ 基因融合
蛋白质改造技术
• 随机突变法是创造在基因水平上的多样性的重要技 术，包括：
混合这些片段，热变性， 退火（shuffle）
表型筛选
DNA聚合酶，连接酶嵌合体蛋白质改造技术• 非天然氨基酸导入：将20种氨基酸之外的氨基酸 （如硝基苯丙氨酸）导入蛋白质分子中，可以赋予 蛋白质全新的功能。
• 首先必须使一些遗传密码子对应于非天然氨基酸， 通常需要对常规的三联体密码子进行扩展，产生 ‘四联体密码子’，如CGGG。
• 外源蛋白质在宿主菌中表达 时可能会遇到细胞毒性问题， 另一些蛋白则可能因过剩表 达而形成不溶性的包涵体。
• 采用细胞外分泌的方法生产 是避免上述情况发生的有效 手段。
• 分泌至细胞外的目的蛋白不 乳酸克鲁维酵母 仅可以正确折叠，而且表达 量较高，并有利于分离与精 制。
信号肽
• 信号肽位于分泌蛋白质的N-末端，由15~30aa组成， 末端还存在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵 母蔗糖酶信号肽：
PCR进一步扩增 连接到克隆载体中，转化E. coli，挑选克隆，提取质粒，测序
蛋白质改造技术
• DNA shuffling：由Stemmer等人所建立，作为一种 基因重排的方法，主要步骤：
– 针对某个蛋白质构建数个经过功能改良的突变基因 – 用DNase I将这些DNA随机切断，获得长度在20~50bp
蛋白质改造技术
• 定点突变法：针对编码某个蛋白质的基因，在特定 位点引入突变的方法。操作过程如下：
1. 人工合成带有需引入的突变序列的寡核苷酸（突变引 物，如：Val→Arg）
2. 制备目标基因的单链DNA模板
3. 使突变引物与DNA模板退火
4. 使用DNA聚合酶、连接酶一起合成全长基因，引入 突变
• 另一种策略是将目的蛋白与其它已知蛋白（如GST， 谷胱甘肽硫转移酶）通过基因融合的方法进行融合 表达，也能适度避免目的蛋白质的降解。
融合蛋白表达
• 蛋白质的在结构与功能上 都具有模块化的特点，其 结构域往往在结构和功能 上都有相当的独立性。
基因A
ORF
ORF
• 这就使通过DNA重组技术 产生融合蛋白质成为可能。
蛋白质改造技术
• 将上述氨酰tRNA与目标基因的mRNA分子共同添加 到无细胞翻译体系中，就可以获得想要的蛋白质。
• 使用多种四联体密码子，可将2种以上的非天然氨 基酸分别导入蛋白质分子中特定的位点。
• 这种技术存在的问题主要有：
– 因为使用无细胞翻译系统，所以蛋白产量低 – 氨酰基tRNA的制备过程复杂 – 导入非天然氨基酸后的蛋白质发生变性、失活等
ADH1，TDH3
GAL1，PHO5
毕赤酵母P. pastoris
GAP
AOX
诱导性表达
• 强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随着 mRNA和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细 胞的生长，或激活宿主的蛋白质降解系统。
• 这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对 宿主细胞有毒性的话就更是如此。
• 这种技术在实验室中也常 被用于目的蛋白的亲和层 析纯化（例如：与GST、 His标签、GFP等蛋白融 合）。
mRNA 融合蛋白
基因B
ORF
基因融合
ORF
有价值的新组合 – 通过合适的表型筛选系统进行选择
• 这种方法甚至能够改变酶分子的底物特异性，还可 以实现酶的稳定性及催化活性的改良。
DNA shuffling
Reshuffle
一组相关的基因
DNase I 随机切割
N MLLQAFLLAGFAAKISA S
• 信号肽的重要性就在于它是蛋白质向细胞外分泌的 充分必要条件，因此研究人员开发了一系列利用信 号肽进行蛋白分泌表达的载体。
• 细菌中B. subtilis 是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵 母S. cerevisiae、P. pastoris和曲霉属的霉菌则是比较
• 这种能够改变蛋白质的功能，或者设计和创造具有 某种功能的新蛋白的技术被称为‘蛋白质工程’。
• 蛋白质工程的终极目标：
① 根据氨基酸序列正确预测蛋白质的结构与功能; ② 使用天然或非天然氨基酸甚至化学合成的分子自由地
创造具有期望结构和功能蛋白质。
蛋白质工程
• 从实际应用来看，酶、抗体、受体、运输蛋白、信 号转导蛋白、转录因子等均可以成为蛋白质工程的 改造对象。
• 先将该序列导入目标基因中想要导入该氨基酸的位 置，同时用‘化学酰胺化’的方法得到该氨基酸的 氨酰tRNA，使携带识别CGGG的反密码子的tRNA 与非天然氨基酸结合。
Ser
tRNA UCG
AGC ·AGC ·ACC
mRNA
硝基苯丙氨酸 (化学酰胺化法）
GCCC AGC ·CGGG ·ACC
在体外无细胞翻译体 mRNA 系中进行蛋白质合成
洗涤剂用酶
• 洗涤剂用酶是洗涤剂中不可或缺 的成分，常添加的酶包括蛋白酶、 淀粉酶、脂肪酶等。其市场需求 量在不断增加。
• 在各种酶制剂联合使用以提高洗 涤效果的同时，科研人员也致力 于通过蛋白质工程手段改善每种 酶的功能。
• 蛋白酶：蛋白酶是洗涤剂中最重 要、使用量最大的酶制剂。
洗涤剂用酶
• 在长期保存的过程中，洗涤剂中的漂白成分会引起 酶的失活，可能是由于位于活性中心附近的Met被 氧化所引起。
• 因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时 才进行强力表达的诱导性启动子。
• E. coli的诱导表达系统几乎全部是利用E. coli 来源 的各种操纵子中的启动子，如lac启动子。
E. coli 的乳糖操纵子lac operon
P lac I
调节基因
启动子
Plac O
操纵 基因
lac Z
lac Y
适合作分泌蛋白生产的真核生物宿主。
宿主的蛋白降解系统
• 影响蛋白质表达量的一个重要的宿主因素是宿主本 身的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋 白酶缺陷的突变株。
• 如E. coli BL21（DE3）是基因表达实验中最常与
pET系列质粒配合使用的宿主菌，B株系天然缺失 lon蛋白酶（K12有）。研究人员又向其引入了蛋白 酶OmpT的缺失突变，有利于提高蛋白产量。
UAS TATA
启动子
• 根据表达的方式可以把启动子分为两类：
– 构成性表达启动子：持续表达 – 诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。
宿主
大肠杆菌E. coli
枯草芽孢杆菌
酿酒酵母S. cerevisiae
启动子
构成性表达
诱导表达
lac, tac, ara pBAD, λPL, T7
蛋白酶、淀粉酶基因 的启动子
savinase的基因进行定点板，进行低温条件下的 酶促反应。获得的突变型酶在15℃时的洗涤效果有 显著提高（Kannase®，Novozymes，1997）。
• 淀粉酶：大量用于餐具的自动化清洗。来源于B. licheniformis 的α-淀粉酶性能优良，但是不抗氧化剂。
• 以融合蛋白形式进行表达的
额外的好处是可以对目标蛋
ampr
表达载体
白进行亲和层析纯化，能大 大简化蛋白的纯化过程。
ori
融合蛋白的亲和层析法纯化
GST
树脂颗粒
GST
结合
谷胱甘肽硫转移酶 谷胱甘肽，GSH 目标蛋白
GST
GST
洗脱
GST
GST
蛋白酶
蛋白质工程
• 随着科学家对蛋白质的结构与功能之间关系的认识 更加深刻，到1980年前后科学家们已经可以根据不 同的目的来设计和创造突变蛋白质分子。
• 原核基因的启动子主要包括-35和-
10区，真核基因启动子则主要是
TATA盒与一些上游转录活化序列 UAS。这些序列被称作顺式作用
真核基因启动子
元件（cis序列）。
RNA聚合酶
• 一般认为启动子的强度与cis序列 的最佳配置相关，在人工构建强 启动子时主要是尝试把不同基因 的启动子的cis序列进行重组。
• 如果把该Met替换为其他氨基酸，可以提高酶分子 的抗氧化性能。
• 例如：来源于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶，将其 Met222替换为Ala后，经100mM H2O2处理15min后残 余活力由野生型的30%提高到70%。（诺维信 Novozymes的产品Esperase®。）
洗涤剂用酶
• 低温蛋白酶的开发：对B. clausii 来源的蛋白酶
启动子 SD
目的基因
终止子
• 当对特定基因进行强力表达时，转录可能会波及该 基因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会 使质粒的稳定性下降。
• 因此为了提高生产性能，往往会在目的基因下游添 加终止子序列。如E. coli中的rRNA基因rrnB的终止 子、T7噬菌体的终止子等。
密码子使用频率
• 不同物种对各种密码子的使用频 率不同，原因之一是细胞中各种 tRNA分子所占的比例不同。
ampr
lacZ’
• 在以E. coli为宿主的生产中，常使 用可以根据培养温度调整拷贝数的 runaway质粒（如pCP3），42 ℃时 拷贝数最高可达几千个。
复制起点ori
启动子的强度
• 启动子的强度是指一个启动子能 够多大程度地结合RNA聚合酶并 引发转录过程。
原核基因启动子
RNA 聚合酶
-35 -10
• 在目前，从头设计具有全新的结构和生物功能的蛋 白质分子相当困难，更多的工作是对现有蛋白质的 改造。蛋白质改造的技术主要有：
① 随机突变法 ② 定点突变法 ③ DNA shuffling ④ 非天然氨基酸导入 ⑤ 基因融合
蛋白质改造技术
• 随机突变法是创造在基因水平上的多样性的重要技 术，包括：
混合这些片段，热变性， 退火（shuffle）
表型筛选
DNA聚合酶，连接酶嵌合体蛋白质改造技术• 非天然氨基酸导入：将20种氨基酸之外的氨基酸 （如硝基苯丙氨酸）导入蛋白质分子中，可以赋予 蛋白质全新的功能。
• 首先必须使一些遗传密码子对应于非天然氨基酸， 通常需要对常规的三联体密码子进行扩展，产生 ‘四联体密码子’，如CGGG。
• 外源蛋白质在宿主菌中表达 时可能会遇到细胞毒性问题， 另一些蛋白则可能因过剩表 达而形成不溶性的包涵体。
• 采用细胞外分泌的方法生产 是避免上述情况发生的有效 手段。
• 分泌至细胞外的目的蛋白不 乳酸克鲁维酵母 仅可以正确折叠，而且表达 量较高，并有利于分离与精 制。
信号肽
• 信号肽位于分泌蛋白质的N-末端，由15~30aa组成， 末端还存在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵 母蔗糖酶信号肽：
PCR进一步扩增 连接到克隆载体中，转化E. coli，挑选克隆，提取质粒，测序
蛋白质改造技术
• DNA shuffling：由Stemmer等人所建立，作为一种 基因重排的方法，主要步骤：
– 针对某个蛋白质构建数个经过功能改良的突变基因 – 用DNase I将这些DNA随机切断，获得长度在20~50bp
蛋白质改造技术
• 定点突变法：针对编码某个蛋白质的基因，在特定 位点引入突变的方法。操作过程如下：
1. 人工合成带有需引入的突变序列的寡核苷酸（突变引 物，如：Val→Arg）
2. 制备目标基因的单链DNA模板
3. 使突变引物与DNA模板退火
4. 使用DNA聚合酶、连接酶一起合成全长基因，引入 突变
• 另一种策略是将目的蛋白与其它已知蛋白（如GST， 谷胱甘肽硫转移酶）通过基因融合的方法进行融合 表达，也能适度避免目的蛋白质的降解。
融合蛋白表达
• 蛋白质的在结构与功能上 都具有模块化的特点，其 结构域往往在结构和功能 上都有相当的独立性。
基因A
ORF
ORF
• 这就使通过DNA重组技术 产生融合蛋白质成为可能。
蛋白质改造技术
• 将上述氨酰tRNA与目标基因的mRNA分子共同添加 到无细胞翻译体系中，就可以获得想要的蛋白质。
• 使用多种四联体密码子，可将2种以上的非天然氨 基酸分别导入蛋白质分子中特定的位点。
• 这种技术存在的问题主要有：
– 因为使用无细胞翻译系统，所以蛋白产量低 – 氨酰基tRNA的制备过程复杂 – 导入非天然氨基酸后的蛋白质发生变性、失活等
ADH1，TDH3
GAL1，PHO5
毕赤酵母P. pastoris
GAP
AOX
诱导性表达
• 强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随着 mRNA和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细 胞的生长，或激活宿主的蛋白质降解系统。
• 这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对 宿主细胞有毒性的话就更是如此。
• 这种技术在实验室中也常 被用于目的蛋白的亲和层 析纯化（例如：与GST、 His标签、GFP等蛋白融 合）。
mRNA 融合蛋白
基因B
ORF
基因融合
ORF