柚苷酶活力测定方法的研究

微生物柚苷酶的研究进展
宋金鹏;仲秀芳;胡晓晴;田淑斌;范光森
【期刊名称】《河南工业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2024(45)2
【摘要】柚苷酶是一种具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶两种酶学活性的酶,在柑橘类产品脱苦、鼠李糖和普鲁宁制备及类固醇的生物转化等方面具有广泛的应用前景。

柚苷酶来源广泛,其主要来源为微生物。

不同来源柚苷酶的酶学性质往往会存在差异,从而影响其应用领域。

系统地从柚苷酶来源、微生物产酶、活力测定、分离纯化与性质、克隆表达、结构、固定化及应用等方面对柚苷酶进行了综述,有助于指导其更好地科学研究和工业化应用。

【总页数】12页(P19-30)
【作者】宋金鹏;仲秀芳;胡晓晴;田淑斌;范光森
【作者单位】德州市纤维检验所;北京工商大学食品与健康学院;淄博新糖源营养健康研究院;北京工商大学北京市食品添加剂工程技术研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.2
【相关文献】
1.柚苷酶产生菌的选育及其酶特性研究进展
2.柚(皮)苷酶的研究进展
3.柚苷酶的生产及其在食品工业中的研究进展
4.微生物来源柚苷酶的研究进展及应用
5.产柚苷酶菌株改良、性质及其在柑橘酒中的应用研究进展
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柚苷酶应用下食品工业1。

1Davis紫外分光光度计法如今多采纳改进后的Davis测酶活方法，该种方法也是测定酶活应用最多的一种。

但缺点是后期紫外分光光度计时会受究竟物颜色的限制，柚皮苷为黄色溶液，可能影响柚皮苷含量的测定，进而使测定的酶活不精确，并且仅是对底物柚皮苷的含量测定来获得柚苷酶的酶活力大小，无法知道组成该酶的其他酶α—L—鼠李糖苷酶和β—D—葡萄糖苷酶的酶活力状况。

1。

2高效液相色谱仪测定柚皮苷含量用高效液相色谱来测定柚苷酶水解的底物柚皮苷的含量，不仅可以测定柚苷酶的酶活力，同时还可以测得α—L—鼠李糖苷酶和β—D—葡萄糖苷酶的酶活力大小，使酶活测定精确详细化，检测柚皮苷的精确度高，误差小，提高了结果的精确性，但是操作较前一种Davis法繁琐，时间延长。

对于不同的柚苷酶，高效液相色谱法检测分析的试验条件不同。

陈月龙在其论文中采纳高效液相色谱测定酶活时的流淌相选取的是甲醇、水、乙腈并采纳不同梯度洗脱分别柚苷酶水解后的产物，从其结果中可看出实现了柚皮苷、柚皮素与普鲁宁的完全分别。

邓媛等也采纳高效液相色谱对柚苷酶活力以及普鲁宁酶活力进行测定，同时进行了酶促动力学讨论，得出柚苷酶酶解的最正确条件。

高效液相色谱法测定柚皮苷含量的优点是直接反映酶解作用的各种产物含量，可获得该酶所包含的各种酶的酶活力大小，方法精确直观，直接测得不同酶活力大小，缺点是操作较冗杂。

2微生物来源柚苷酶的制备2。

1柚苷酶产生菌株的筛选有效的微生物筛选方法可以大量节省菌株筛选的时间和本钱，因此在筛选柚苷酶产生微生物的过程中选择合适的筛选方法至关重要。

目前微生物的筛选方法有透亮圈法、高层试管法以及定性滤纸显色法，其中高层试管法和定性滤纸法误差较大，相较而言，透亮圈法操作简洁，观看便利，适用于定性筛选，是目前应用较为广泛的一种筛选微生物方法。

2。

1。

1透亮圈法透亮圈法是指微生物分解平板培育基中溶解性较差的底物，使菌落四周产生透亮圈，圈的大小初步反应当菌株利用底物的力量。

柚苷皮苷含量测定方法的研究进展摘要】目的综述柚苷皮苷含量测定的方法。

方法对近年来的用于柚皮苷提取，分离纯化，含量测定的一些方法进行汇总，并分析。

结果用于柚皮苷提取，分离及纯化，含量测定的方法有多种，各有优缺点。

结论近年来用于柚皮苷提取最常用的为溶剂提取法，分离纯化常用的吸附剂为聚酰胺和硅胶，含量测定常用高效液相色谱法。

【关键词】柚皮苷含量测定研究进展柚是芸香科柑桔属水果，不仅具有较高的营养价值，而且具有极高的药用价值。

柚皮苷全称为柚皮素-7-0-新橙皮糖苷，是一种双氢黄酮类化合物，其结构是在黄酮基本结构的第七位置上以糖苷键的形式接一个葡萄糖和鼠李糖，由一分子的芸香糖与柚皮素(naringenin)成苷，由于A环和B环之间完全没有共轭，所以在282nm有强烈的紫外吸收峰。

纯柚皮苷是一种白色粉末状固体，在水中的溶解度很小，常温下的溶解度约0.1％，溶于丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇、热的醋酸和水，不溶于乙醚、己烷和氯仿等，熔点为83℃。

1 柚皮苷的提取柚皮苷大部分存在于柑橘加工的废弃物中，如果皮、果囊，其中成熟的果皮和组织中柚皮苷的含量最高。

柚皮苷的提取方法根据柚皮苷的结构及性质有：（1）碱提酸沉法：用饱和Ca(OH)2溶液浸提，用HCL溶液沉淀的方法提取柚皮苷。

（2）溶剂提取法:由于柚皮苷溶于甲醇，乙醇，丙酮，正丁醇及水等溶剂中，故可用甲醇、乙醇或者水浸泡一定时间提取柚皮苷。

2 柚皮苷的分离及纯化方法柚皮苷的分离及纯化基本上是将提取液过滤,浓缩或挥干加溶剂适量上柱，进行柱分离，有机溶剂洗脱；洗脱液挥干溶剂，得粗品；再经多次重结晶，得柚皮苷晶体；或直接收集洗脱液进行含量测定。

所使用的分离物质有多种,如大孔树脂,聚酰胺,硅胶等,但因其吸附原理不同,同时相同的吸附剂不同型号及其吸附效能也有所不同,故选择吸附剂时要根据柚皮苷的性质及实验条件选择分离效果最佳的吸附剂。

3 柚皮苷的含量测定柚皮苷的含量测定也有多种方法，包括紫外分光光度法[1]，薄层扫描法，胶束电动毛细管电泳法，流动注射双安培法，反相高效液相色谱法，高效液相色谱法等，其中近年来柚皮苷含量测定中最常用的为高效液相色谱法。

产柚苷酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶特性研究的开题报告一、研究背景与意义柚叶素是一种来自柚子中的苄基化的二苯基丙烷类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、减肥、降血糖等多种药理活性。

其主要形式为柚叶素苷（naringin），是一种黄酮丙糖苷，可在体内通过酯酶水解为柚叶素。

因此，柚叶素苷是柚子中的生物前体，具有重要的发展前景。

目前，柚叶素主要从柚子中提取分离，但其收率较低且分离过程较复杂。

利用微生物发酵生产柚叶素苷是一种新的生产方式，具有生产成本低、规模化生产能力强等优点，因此备受关注。

柚叶素苷在体内通过酯酶水解为柚叶素，因此酶解柚叶素苷的酶——柚苷酶是柚叶素苷生产的关键酶。

因此，如何高效地筛选和鉴定柚苷酶高产菌株，以及对该酶的产酶特性进行研究，对柚叶素苷的生产具有重要的意义。

二、研究目的本研究旨在通过筛选、鉴定和产酶特性研究，寻找高柚苷酶产生的菌株，并对该酶的产酶特性进行探究，为柚叶素苷生产提供基础研究支持。

三、研究内容与方法1. 筛选高产柚苷酶菌株。

从自然界和土壤样品中，通过培养基筛选出菌株，利用酶促法快速鉴定柚苷酶高产菌株。

2. 鉴定柚苷酶高产菌株。

对筛选出的柚苷酶高产菌株进行16S rDNA序列分析，确定其属于的种或亚种。

3. 产酶特性研究。

利用该菌株发酵生产柚苷酶，并对该酶的反应条件、酶促性质、稳定性等多个产酶特性进行研究。

四、研究预期成果本研究预期可筛选出柚苷酶高产菌株，并对该菌株的产酶特性进行研究，从而为柚叶素苷的生产提供基础研究支持。

五、研究进度安排序号 | 内容 | 时间安排1 | 背景及意义分析、目的确定 | 前期阶段2 | 菌株筛选及鉴定 | 第1-3个月3 | 柚苷酶产酶特性研究 | 第4-10个月4 | 结果分析、论文撰写 | 第11-12个月六、研究经费预算分配经费来源 | 经费预算通用经费 | 10万元设备费 | 5万元材料费 | 5万元人员费 | 20万元合计 | 40万元。

黑曲霉液态发酵产柚苷酶的分离纯化及其性质研究王维娜1，李佥1，田晶1，费旭2，徐龙权2，廉萌1(1.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034)(2.大连工业大学现代教育技术部，辽宁大连 116034)摘要：本文针对黑曲霉液态发酵所产柚苷酶的分离纯化工艺及其酶学性质进行研究。

将黑曲霉液态发酵所产酶液，依次通过30%~70%硫酸铵盐析、膜透析和DEAE-Sepharose FF 阴离子交换层析后得到高纯度柚苷酶。

经SDS-PAGE 凝胶电泳仅得到一条清晰条带，分子量约为65.10 ku 。

纯化获得的柚苷酶比酶活可达6932.54 U/mg ，纯化倍数和酶活回收率分别为13.82倍和13.30%，并且能有效水解柚皮苷。

进一步研究发现，该酶的最适反应pH 为4.5，最适作用温度为50 ℃，在20 ~50 ℃℃及pH 3.0~6.0范围内有良好的稳定性。

在一定浓度范围内，K +、Ca 2+和Na +对柚苷酶活性有促进作用，而Fe 3+、SDS 和EDTA-Na 2对其活性有明显的抑制作用。

本研究为深入理解柚苷酶分离纯化过程，明确其酶学性质，进一步探索柚苷酶应用于天然活性产物生物转化过程的相关机制提供了基础数据，具有非常重要的科学意义和潜在的应用价值。

关键词：黑曲霉；液态发酵；柚苷酶；纯化；酶学性质文章篇号：1673-9078(2016)07-72-78 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.7.012Isolation, Purification, and Properties of Naringinase Produced fromAspergillus niger FFCC 848 by Liquid FermentationW ANG Wei-na 1, LI Qian 1, TIAN Jing 1, FEI Xu 2, XU Long-quan 2, LIAN Meng 1(1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China) (2.Modern Education Technical Department, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)Abstract: The isolation, purification, and enzymatic properties of naringinase produced by liquid fermentation with Aspergillus niger FFCC 848 were investigated. The fermentation broth produced from liquid fermentation by A. niger FFCC 848 was purified by ammonium sulfate fractional precipitation, dialysis, and DEAE-Sepharose FF anion exchange chromatography to yield highly purified naringinase. Only one clear band was observed upon sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, with a molecular weight of 65.10 ku. The final, purified naringinase showed 13.82-fold purification, with an enzyme activity recovery of 13.30% and specific activity of 6932.54 U/mg, and the enzyme could effectively hydrolyze naringin. Furthermore, the activity of naringinase was stable at 20–50°C and pH 3.0–6.0; optimum activity was observed at 50°C and pH 4.5. In a specific concentration range, the enzyme activity was enhanced by K +, Ca 2+, and Na +, but was strongly inhibited by Fe 3+, SDS, and EDTA-Na 2. This study provides a basis for understanding the purification of naringinase and for further studies of the related mechanism underlying the bioconversion of bioactive natural products with naringinase.Key words: Aspergillus niger ; liquid fermentation; naringinase; purification; enzymatic properties柚苷酶（EC 3.2.1.40）是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成，同时具有α-L-鼠李糖酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性。

柚苷酶菌种选育方案一第一阶段：菌种的培养与选育一、培养产柚苷酶菌种培养基配方：低糖柚苷培养基（500ml)MgSO4 0.5%, ——2.5gK2HPO4 0.1% ——0.5g, KCL0.5%, ——2.5g蔗糖1%，——5.0gNaNO30.3%, ——1.5g柚苷0.5%，——2.5g琼脂1.5%。

——7.5gPH自然（来自西南农业大学柚苷酶生产菌的选育）。

实验仪器：烧杯(200ml 一个)，三角瓶（1000ml 一支），量筒（100ml），玻棒，容量瓶（500ml 一支）天平(0.1 和0.0001) ，药匙，高压蒸汽灭菌锅，磁力搅拌器,精密PH计，棉花，纱布，牛皮纸，标签纸，麻绳，皮筋。

配制培养基：1、按上述配方称量药品，置于烧杯中加少许水搅拌至全溶；2、将混合液倒入500ml的容量瓶中定容；3、将定容混合液倒入1000ml烧杯中，加入1.5% 琼脂(先溶），用磁力搅拌器加热搅拌融化;4、将融液分装到1000ml的三角瓶中，加塞，用牛皮纸包扎，灭菌锅灭菌（0.1MPa，121度，灭菌30min）；5、贴上标签，灭菌完后，冷却放入培养箱保存（待用）。

2，接种仪器及药品：柚苷酶，蒸馏水，无菌水，新制低糖柚苷培养基涂布器，培养皿(20个) ，称量纸，移液枪，移液枪盒，0.1和1.0的移液枪头， 1.5ml 离心管（10个），离心管盒，培养箱，超净台，电子天平（0.0001），高压灭菌锅，橡皮筋，旧报纸，。

菌种选育：1、用酒精擦拭天平外表面，之后放置在超净台过夜灭菌；2、将移液枪枪头放入移液枪枪盒，离心管放入离心管盒(离心管单独灭菌，称量纸，牛皮纸），并分别用旧报纸包好，同时也将培养皿，涂布器，烧杯，手套用旧报纸包装好，将50ml二次蒸馏水加入三角瓶中加塞包扎，分次用高压灭菌锅灭菌（0.1MPa，121度，灭菌30min），之后放入超净台灭菌半小时；3、取出柚苷酶在超净台中戴手套打开包装，用灭菌后的称量纸称量50mg酶粉末；4、取六只灭菌好的1.5ml离心管，编号（1——7），分别用移液枪加入0.9ml无菌水，（3、4步双人同时操作）；5、将粉末倒入1号离心管中，震荡充分溶解，用移液枪取出0.1ml溶液加入2号离心管中，震荡混匀，在3——7号进行同样操作，依次配备出10-1（2号管），10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。

微生物来源柚苷酶的研究进展及应用张林河;方柏山【期刊名称】《化工进展》【年(卷),期】2013(32)5【摘要】柚皮苷是影响柚子汁品味的最主要因素，柚苷酶具有将柚皮苷分解为普鲁宁、鼠李糖、葡萄糖和柚皮素等物质的功能，并且这些物质已广泛用于制药和饮料行业。

本文介绍了近年来国内外微生物来源的柚苷酶的研究、酶学特性、酶活测定、结构与功能等，表明细菌来源的柚苷酶最适温度为37～70℃，最始pH值为4.5～8.0；真菌来源的柚苷酶最适温度为30～75℃，最始pH值为4.0～11.0。

介绍了柚苷酶及其相关产物在食品、饮料和制药工业中的应用进展，发现柚苷酶不仅具有脱苦的作用，还对人类的身体健康具有重要作用。

展望了今后的研究方向，应该从柚苷酶高产菌株的选育、发酵产酶的工艺优化和酶的应用等方面开展工作，大幅度提高柚苷酶的产酶水平。

%Naringin is the principal factor which bitters the taste of grapefruit juice. Naringin could be hydrolyzed by naringinase into prunin,rhamnose,glucose,and naringenin,which have wide applications in the pharmaceutical and beverage industry. This paper provides an overview of the studies on microbial originnaringinase,purification,characterization and determination of enzyme activity as well as protein structure and function. The optimum temperature of naring inase from bacteria is from 37 ℃ to 70 ℃ while the optimal pH is in the range of 4.5 to 8.0;the optimum temperature of naringinase from fungal is from 30℃to 75 ℃ while the optimal pH is in therange of 4.0 to 11.0. The applications of naringinase and its various products in food,beverage,and pharmaceutical are also presented,showing that naringinase could not only debitter the fruit juice but also play an important role in human health. In addition,the development trends and potential applications of naringinase are also prospected. The research emphasis should be placed on screening ideal microbe strains and fermentation process optimization to enhance naringinase.【总页数】8页(P1108-1115)【作者】张林河;方柏山【作者单位】华侨大学化工学院，福建厦门 361021;华侨大学化工学院，福建厦门 361021; 厦门大学化学化工学院，福建厦门 361005【正文语种】中文【中图分类】TS201.1【相关文献】1.微生物来源蔗糖异构酶的研究进展及应用 [J], 李莎;徐虹2.微生物硫酸酯酶研究进展：来源、催化机制及应用 [J], 张丹平;何玉财3.微生物来源的L-阿拉伯糖异构酶的研究进展及应用前景 [J], 程丽芳;沐万孟;张涛;江波4.微生物来源的尿酸氧化酶的研究进展及应用前景 [J], 陈志禹;何秀萍;张博润5.海洋微生物来源木聚糖酶研究进展 [J], 田艳杰;徐佳;贾腾飞;马苗苗;张慧姗;王燕;周晨妍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

DOI ：10.3969/j.issn.1672-9463.2018.03.034柚皮苷的生物活性研究进展金元宝　刘萍　刘小根　金刚▲基金项目：江西省教育厅科学技术研究项目（编号：GJJ151495）作者单位：343000　江西吉安，吉安职业技术学院现代农林工程学院（金元宝）；上海市东方医院吉安医院中医科（刘萍）；江西省国鼎检测技术有限公司（刘小根）；深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院（金刚）通讯作者：金刚我国是世界柑橘的主要起源中心，也是世界柑橘的生产大国。

柑橘类水果及其果汁对心血管病及癌症等预防和治疗的作用已被广泛研究，其主要活性成分是黄酮类化合物，如柚皮苷、橙皮苷、圣草酚、异野樱素及它们各自的糖苷类物质。

其中最具有代表性的是柚皮苷。

柚皮苷是存在于柑橘属果实、果皮和果肉中的一种二氢黄酮糖苷（图1），又称柚苷、柑桔苷、异橙皮苷，也是骨碎补、枳实、枳壳、化橘红等中药的主要有效成分之一。

柚皮苷含量随品种、产地的不同而存在较大差异，通常未成熟的果实内含量较高。

图1　柚皮苷分子结构式柚皮苷具有多种生物学活性，包括抗过敏反应[1]，抗氧化，降血脂，对杂环胺类物质等致突变性的抑制作用，抗癌，对胃溃疡的防治，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、埃氏大肠杆菌及某些真菌的抑制作用，抗炎，对某些毒物的拮抗作用，降血脂，降血胆固醇，解痉，镇痛，改善微循环和软骨组织细胞功能作用，降低毛细血管通透性和骨关节病变率作用，促进一些药物在人体内的吸收和代谢[2]，促进成骨细胞增殖和分化、抑癌等多种药理活性[3]。

本研究主要综述柚皮苷在骨质疏松症、动脉粥样硬化症、癌症、糖尿病、砷中毒等方面的作用。

1　抗骨质疏松症骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织微细结构破坏、骨骼的强度减低和骨折危险性增加为特征的一种全身代谢性疾病，常见于绝经后妇女和老年人。

随着我国老年人口的增加，骨质疏松症发病率呈上升趋势。

柚皮苷能增加成骨细胞标志蛋白[如骨钙蛋白、骨桥蛋白、护骨素及骨形成蛋白-2（BMP-2）]的表达，同时还能抑制RANKL[The receptor activator of nuclear factor-kappa B （NF-κB） ligand （RANKL）]诱导的NF-κB 和ERK 信号传递活性和破骨细胞基因的蛋白表达，从而导致破骨细胞不能正常形成，因此，起到延缓骨质疏松的作用，促进成骨细胞的增殖与分化[4，5]。