BD分析TH17细胞
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体外检测人Th17细胞频率的方法页数:3
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Th17细胞及其分泌的IL-17在自身免疫性疾病中的作用
Th17细胞及其分泌的IL-17在自身免疫性疾病中的作用种靖慧;解金辉【摘要】辅助性T细胞17(Th17)是一种新型T细胞亚群,能够分泌产生重要效应因子IL-17,IL-17作为炎症介质结合细胞上的IL-17受体引发包括NF-κB、MAPK 等途径在内的一系列信号传递而发挥其生物学功能,介导炎症、感染等的发生和发展.自身免疫性疾病是由于机体免疫功能紊乱,对自身抗原发生免疫反应,进而导致自身机体损伤的一种疾病,如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性溶血性贫血等均属于常见的自身免疫性疾病.Thl7细胞及IL-17的异常表达和信号传递机制与各种自身免疫性疾病的致病机理研究成为一个热点,这为自身免疫病的防治对策提供新的认识和方案,Th17细胞及IL-17成为自身免疫性疾病一个新的治疗靶标.【期刊名称】《继续医学教育》【年(卷),期】2018(032)007【总页数】3页(P129-131)【关键词】辅助性T细胞;Th17;IL-17;自身免疫性疾病【作者】种靖慧;解金辉【作者单位】天津市血液中心免疫血液学研究室,天津 300110;天津市血液中心免疫血液学研究室,天津 300110【正文语种】中文【中图分类】R392自身免疫性疾病是机体的免疫平衡状态被打破，进而引起对自身机体的损伤的一种疾病，亦是对于外界入侵甚或自体产生的抗原发生的反应。
在参与机体免疫应答的各种免疫细胞中，CD4+T细胞作为效应T细胞发挥关键作用，Thl7细胞是一种新型的CD4+T细胞，其分泌的IL-17因子，能够作为介质调控机体的免疫调节，与其受体结合活化信号传递发挥生物学功能，调节炎症、感染等病理过程，是自身免疫病中重要的调控机制。
Th17及其分泌的IL-17表达和功能的异常与自身免疫性疾病的发生发展密切相关[1]，在炎症性自身免疫病患者和动物模型中均发现IL-17的异常高表达及异常的信号传递，这与其炎症性病理机制密切相关。
现将相关研究综述如下。
560484人TH1TH2TH17细胞因子CBA分析试剂盒原理及方法
3
FITC 阳性质控（E2）：FITC 标记抗体质控品，流式细胞仪调整仪器补偿 时使用。4C 保存，勿冷冻。 Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品（C）：为人类细胞因子重组蛋白 冻干品。一瓶用 0.2mL 分析稀释液稀释，成为 10标准品（人 IL-2、IL-4、 IL-5 (Kit I)或 IL-6 (Kit II)、IL-10、TNF-、IFN-和 IL-17A 蛋白各含 50ng/mL）。4C 保存。 Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品可以存放至有效期。复溶后的 10标 准品在 2-8C 保存，可存放 12 个小时。
156 156 156 156 156 156 156 156
80 80 80 80 80 80 80 80
40 40 40 40 40 40 40 40
20 20 20 20 20 20 20 20
2. Human TH1/TH2/TH17 细胞因子捕获微球混悬液的制备 捕获微球分为（A1）-（A7）七瓶，制备捕获微球混悬液之后应立即进行下 一步操作，加入 PE 信号抗体、标准品和待测样本。 1) 计算分析实验管数（包括标准品和质控品），例如分析 8 个待测样本，加 9 个标准管和 1 个阴性质控管，共计 18 管； 2) 充分摇匀各捕获微球试剂瓶（A1）-（A7）； 3) 每个测试需加入（A1）-（A7）捕获微球各 10L，制成捕获微球混悬液， 例如 18 管实验需要（A1）-（A7）捕获微球各 180L； 4) 如果是血清或血浆，先 300g 离心混匀的捕获微球，轻轻吸出上清，加入等 量的 H 富集血清，室温避光 30 分钟。
2
为了满足不同用户的实际需要，BD 公司 2005 年初推出了可以自由组合的 CBA Flex set。它改变了 CBA KIT 的固定形式，成为自由组合、灵活搭配的自助餐。 CBA Flex set 的原理与 KIT 相似，捕获微球用来定性目的蛋白，检测抗体的荧光强 度来定量目的蛋白。与 KIT 不同的是，Flex set 微球是带有两种荧光，分别在流式 细胞仪的 FL3 和 FL4 通道检测，通过这两个二维矩阵来对捕获微球定性。PE 检测 抗体在 FL2 通道来对目的蛋白定量。(如下图)
Th17研究方法和产品应用
七、产品信息
研究意义
• Th17细胞与自身免疫病有着非常密切的关系. 包括 类风湿性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮 (SLE)、以及哮喘等患者的血清及组织中检测到了 IL-17的高表达。 • IL-17在哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和 肿瘤等也 有密切的关系。
报告内容 一、Th17的发现 二、Th17细胞分化 三、Th17细胞的功能 四、研究方法
Th17细胞发育与Th1和Th2细胞一样，受各种因 素的协调控制。
Th17发现
Th17细胞发现于对实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) ， 以及对胶原诱导的关节炎(CIA)的研究。 传统观点认为，上述疾病由 Th1 细胞介导，然而中和 Th1细胞因子IFN-γ和（或）IL-12的功能，并不能减轻 疾病进程. 而中和IL-23则延缓了疾病的进程。 证实IL-23的缺失可以降低体内IL-17+T 细胞的比例， 而不影响IFN-γ+ T 细胞的含量。
报告内容 一、Th17的发现 二、Th17细胞分化 三、Th17细胞功能 四、研究方法
五、Th细胞亚群比较 六、研究方法
七、产品信息
生物学功能 Th17 细胞能够分泌产生 IL-17A 、 IL-17F 、 IL-6 、 IL-22 以 及 TNF-α 等 , 其功能主要就体现在它分泌的这些细胞因子 集体动员、募集及活化中性粒细胞的能力上。 Th17 细胞产生的最重要的效应因子是IL-17, 其受体在体 内广泛表达， IL-17 细胞因子家族包括 IL-17A 、 IL-17B 、 IL-17C 、 IL-17D 、 IL-17E(IL-25 ) 和 IL-17F 。通常， IL-17 是指 IL-17A 。 IL-17 具有促炎症作用，诱导促炎细胞因子 (如IL-6、TNF) 、 趋化因子(如MCP1和MIP2)和基质金属蛋 白酶的表达，引起组织细胞浸润和组织破坏。 IL-17 也参与中性粒细胞的增殖、 成熟和趋化，对 T 细胞 的活化起协同刺激作用，并能促进树突状细胞的成熟
研究意义
• Th17细胞与自身免疫病有着非常密切的关系. 包括 类风湿性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮 (SLE)、以及哮喘等患者的血清及组织中检测到了 IL-17的高表达。 • IL-17在哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和 肿瘤等也 有密切的关系。
报告内容 一、Th17的发现 二、Th17细胞分化 三、Th17细胞的功能 四、研究方法
Th17细胞发育与Th1和Th2细胞一样，受各种因 素的协调控制。
Th17发现
Th17细胞发现于对实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) ， 以及对胶原诱导的关节炎(CIA)的研究。 传统观点认为，上述疾病由 Th1 细胞介导，然而中和 Th1细胞因子IFN-γ和（或）IL-12的功能，并不能减轻 疾病进程. 而中和IL-23则延缓了疾病的进程。 证实IL-23的缺失可以降低体内IL-17+T 细胞的比例， 而不影响IFN-γ+ T 细胞的含量。
报告内容 一、Th17的发现 二、Th17细胞分化 三、Th17细胞功能 四、研究方法
五、Th细胞亚群比较 六、研究方法
七、产品信息
生物学功能 Th17 细胞能够分泌产生 IL-17A 、 IL-17F 、 IL-6 、 IL-22 以 及 TNF-α 等 , 其功能主要就体现在它分泌的这些细胞因子 集体动员、募集及活化中性粒细胞的能力上。 Th17 细胞产生的最重要的效应因子是IL-17, 其受体在体 内广泛表达， IL-17 细胞因子家族包括 IL-17A 、 IL-17B 、 IL-17C 、 IL-17D 、 IL-17E(IL-25 ) 和 IL-17F 。通常， IL-17 是指 IL-17A 。 IL-17 具有促炎症作用，诱导促炎细胞因子 (如IL-6、TNF) 、 趋化因子(如MCP1和MIP2)和基质金属蛋 白酶的表达，引起组织细胞浸润和组织破坏。 IL-17 也参与中性粒细胞的增殖、 成熟和趋化，对 T 细胞 的活化起协同刺激作用，并能促进树突状细胞的成熟
Th17细胞的研究进展
有研究发现 ： [11] 孤独受体 (Orphan nuclear recep tor, RORγt) 是控制 Th17 细胞分化的 转 录 因 子。 当 小 鼠 缺 乏 RORγt 后，Th17 细胞数量也相应减少。
除 此 之 外， 研 究 者 还 发 现， 在 原 代 培 养 中 加 入 IFN-γ 或 者 IL-4 可 以 明 显 抑 制 Th17 发育分化（图 1）[12]。另外，在培 养体系中加入外源性 IFN-γ 或 IL-4，也可 以阻断 IFN-γ 缺陷的 CD4+T 细胞分泌 IL17[13]。这表明，Th1 和 Th2 细胞可有效抑 制 Th17 细胞发育。这也提示，Th-17 细胞
【关键词】Th17 细胞；IL-17；CD4+T 细胞；免疫调节
1 Th17 细胞与 IL-17 的生物学特性
Th17 细 胞 作 为 一 种 效 应 性 CD4+T 细 胞， 其 最 主 要 的 特 征 就 是 分 泌 IL-17。 IL-17 与受体结合后 , 通过活化 MAP 激酶 和 NF-κB[2] 发挥其生物学活性。IL-17 的主 要生物学功能是促进炎性反应 , 与类风湿 性关节炎、哮喘、多发性硬化症、银屑病 和移植排斥反应密切相关。IL-17 还可以刺 激上皮细胞、内皮细胞或成纤维细胞产生 IL-6、急性反应蛋白、粒 - 巨细胞刺激因子 (G-CSF) 和前列腺素 E2 等表达。因此，适 应免疫系统可以通过 IL-17 和固有免疫系 统相联系并促进炎症反应过程。但同大多 数炎症因子相似，在体内不同疾病环境中， IL-17 也可能发挥不同的免疫调节效应 [3]。
小鼠缺乏 IL-23 几乎没有 Th17 细胞 [5] 的扩 生 IFN-γ 和 IL-2[8] 却 明 显 增 加 IL-17 的 产
辅助性T细胞17(Th17)与调节性T细胞(Treg)的平衡关系在全身炎症反应综合征(SIRS)中的作用及机制研究 (1)
transcription
子
Th9
Helper T lymphocytes9
辅助性 T 淋巴细胞 9
IFN-γ Interferon γ
γ 干扰素
TGF-β transforming growthfactorβ
β 转化生长因子
Socs3 suppressor of cytokine signaling 3 细 胞 因 子 信 号 传 送
激酶途径和核转录
因子 kB
CNS2 conserved noncoding sequence 保守非编码序列 2
CXCL8 Neutrophils and induction of 中 性 粒 细 胞 和 诱 导
chemokine
趋化因子
APC
Antigen presenting cells
抗原提呈细胞
Granulocyte-macrophage
阻抑蛋白 3
GM-CSF colonystimulating factor
粒细胞-巨噬细胞刺
激因子
-2-
第四军医大学硕士学位论文
CAM-1 cellular adhesion molecule 1
细胞黏附分子 1
NFkB nuclearfactor kB
中国人民解放军第四军医大学 二 O 一二年四月
第四军医大学硕士学位论文
目录
缩略语表 ................................................................................................................ 1 中文摘要 ................................................................................................................ 4 ABSTRACT .......................................................................................................... 7 前 言 .............................................................................................................. 11 文献回顾 .............................................................................................................. 13 正 文 .............................................................................................................. 27
th17细胞
TH17细胞TH17细胞是一类重要的淋巴细胞亚群，起源于T辅助细胞，其在免疫系统中扮演着重要的角色。
这种细胞被广泛认为与炎症和自身免疫性疾病的发展密切相关。
TH17细胞主要通过分泌IL-17A、IL-17F、IL-21等细胞因子来发挥作用。
TH17细胞的发现TH17细胞最早于2005年由美国科学家发现并鉴定，该发现被认为是免疫学上的一次重大突破。
TH17细胞的发现使得人们对于自身免疫性疾病的机制有了更深入的了解。
TH17细胞的功能TH17细胞在免疫应答中扮演着重要的角色，主要参与体液免疫和细胞免疫的调节。
TH17细胞除了可以诱导炎症反应外，还能促进新生血管生成和组织修复。
然而，过度活化的TH17细胞也与多种自身免疫性疾病的发生有关。
TH17细胞的调控TH17细胞的发育和功能受到多种细胞因子、细胞途径和信号分子的调控。
IL-6、IL-23、TGF-β等因子在TH17细胞的分化和活化过程中发挥关键作用。
通过调节这些信号分子的表达和活性，可以有效干预TH17细胞相关疾病的发展。
TH17细胞与疾病除了在自身免疫性疾病中的作用外，TH17细胞还与多种炎症性和感染性疾病的发展密切相关。
研究人员对于TH17细胞在疾病发生和发展中的具体作用进行了深入研究，希望通过调控TH17细胞的活性来治疗相关疾病。
总结TH17细胞作为一类免疫细胞亚群，在免疫系统中发挥着重要作用。
它的发现为免疫学领域带来了新的认识，而对于TH17细胞的功能、调控以及与疾病的关系的研究也在持续深入。
随着对TH17细胞的进一步了解，相信将有助于未来更好地治疗相关疾病和疾病的预防。
Th17细胞及相关细胞因子在类风湿关节炎中的检测及临床意义
Th17细胞及相关细胞因子在类风湿关节炎中的检测及临床意义目的探讨IL-6、IL-17在类风湿关节炎（RA）患者外周血及关节液中的表达及临床意义。
方法RA患者51例为RA外周血组，其中15例为RA关节液组，30例健康者作为对照组，IL-6及IL-17采用ELISA方法检测。
结果RA外周血组及关节液组具有较高的IL-6、IL-17检测值（P 0.05），具有可比性。
1.2 研究方法本实验中的血液及关节液均采用干净的试管进行收集，在室温条件下凝固0.5 h，离心（1 000 r/min）15 min，弃沉淀后收集分离中的上清液。
将上清液进行分装后冷冻于-80°C条件下保存备测。
ESR的检测采用Alifax公司的Microtest1全自动快速血沉仪进行，而CRP及RF的检测采用免疫比浊法进行，采用ELISA 法检测血液及关节液中的IL-6、IL-17，检测中使用上海森雄科技实业有限公司的试剂盒。
1.3 统计学方法数据的统计学分析均采用SPSS17.0统计分析软件进行处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析与t检验及直线相关分析，对RA相关的指标与IL-6、IL-17水平的相关性进行分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果2.1三组IL-6及IL-17水平的比较由表1可以看出，与对照组比较，RA外周血组及RA关节液组均具有明显较高的IL-6、IL-17检测值，差异具有显著性（P < 0.05）；与RA外周血组患者比较，RA关节液组具有明显较高的IL-6、IL-17检测值，差异具有显著性（P < 0.05）。
2.2 ESR、RF、CRP与IL-6、IL-17水平的相关性分析由表2数据可以得出，ESR、RF、CRP与RA外周血患者及关节液患者中IL-6水平呈显著的正相关（P < 0.05）。
进一步将RA外周血中的IL-17及关节液中的IL-17与RA的各观察指标进行相关性分析发现，RA外周血中的IL-17与RA各观察指标不具有相关性，而RA关节液中的IL-17则显著正相关于CRP（r = 0.78，P < 0.05）。
Th17淋巴细胞研究进展
㈣ Th17细胞与其它疾病
此外，Th17细胞与肿瘤的发生存在联系。目前已在不同肿瘤患者的器官样本中发现了IL-23P19的过度表达，包括结肠癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、头颈部肿瘤及黑色素瘤等。研究发现，IL-17可进血管内皮细胞迁移，显着上调成纤维细胞或肿瘤细胞中前血管生成因子的表达，具有促进肿瘤血管生成的作用。体内实验也发现转染IL-17的肿瘤较对照组血管密度明显增加。IL-17抗体可明显抑制CD4+T细胞的血管生成活性，即IL-17对肿瘤的发生有抑制作用。研究表明，Th17细胞也可能在2型糖尿病的发生、发展中起重要作用。国内研究发现，2型糖尿病患者外周血中Th17细胞比例显着高于对照组，且在糖尿病生病组高于正常清蛋白尿组，提示Th17细胞与2型糖尿病的发生、发展密切相关，进一步丰富了2型糖尿病发病的免疫学机制，补充了Th1/Th2平衡失调理论的不足。Th17细胞通过分泌细胞因子集体动员、募集及活化中性粒细胞，诱导炎症。多项研究发现Th17细胞与炎性肠病有一定的关系，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，其患者结肠莫局部及血清中Th17/IL-17水平明显高于健康者。
⒉SLE
在狼疮小鼠模型中，血清的IL-17水平和脾脏Th17细胞数目均异常增加，分离的初始CD4+T细胞在体外培养中更易于分化成为Th17细胞。实验发现，SLE患者体内IL-17蛋白的基因表达水平存在的明显差异并且两者存在正相关关系。
⒊银屑病
是一种常见的自身免疫病炎性皮肤病。研究显示，银屑病患者外周血Th17细胞/CD4+T细胞比例和相关细胞因子IL-17/IL-23表达高于正常人群。患者外周血IL-23高表达，促进了CD4+T细胞向Th17细胞分化，使其分泌IL-17异常增加，可能是银屑病发病机制重要环节。目前，生物学数据显示，IL-23/IL-23R通路可能是银屑病的重要干预治疗靶向。
Th17细胞在自身免疫性疾病和感染性疾病中的作用
Th17细胞在自身免疫性疾病和感染性疾病中的作用白婕综述天津市海河医院普外科，天津，300350摘要：在免疫反应过程中，CD4+T细胞起了重要的作用。
Th17细胞是一种新发现的CD4+T 细胞，它不同于Th1，Th2等CD4+T细胞，可分泌IL-17A，IL-17F，IL-21和IL-22等不同的细胞因子，通过这些细胞因子在免疫应答中起着重要的作用。
Th17细胞在自身免疫性疾病中的作用已有报告并有一些明确的证据支持，并且在不同的疾病研究中表现出相似的作用，本文分别阐述Th17细胞在桥本甲状腺炎、多发性硬化症、1型糖尿病、类风湿性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、牛皮癣、炎症性肠病、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染和乙型肝炎病毒（HBV）感染等不同的自身免疫性疾病、炎性疾病和感染性疾病中的作用。
尽管有证据表明Th17细胞可以在这些疾病的控制中发挥重要作用，但其具体的作用机制仍不完全清楚，还需要研究者进一步的探索。
关键词：Th17 自身免疫性疾病感染性疾病在免疫反应过程中，CD4+T细胞对于免疫应答的启动起着重要的作用，其可为其它细胞提供帮助并承担着多种效应因子的功能。
经抗原刺激，原始的CD4+T细胞活化、扩展并分化成不同亚型，称为辅助T细胞—Th（Th1，Th 2，Th 9，Th17，和Th22）—其特征在于生成不同的细胞因子和效应因子[1]。
Th17细胞已被确定是许多自身免疫疾病的主要致病Th细胞群，并且IL-23可以增强和稳定其功能[2]。
免疫系统的主要功能是识别并消除外来抗原，以诱导免疫记忆，并培养对自身抗原的耐受。
有效的免疫稳态依赖于若干因素的平衡，包括调节性T细胞对Th细胞的激活和抑制。
当动态平衡被破坏，并且免疫系统处于活化状态时，宿主容易产生自身免疫[3]。
Th17细胞在诱导炎症的过程中起着重要作用[3]，但免疫应答需要一定程度的控制以避免慢性炎症的免疫应答介导的损伤。
CD4+T细胞是免疫防御的第一线，主要是通过分泌细胞因子在免疫反应的诱导和调控中扮演重要角色。
冠心病患者中Th17细胞水平的变化及其意义探讨
冠心病患者中Th17细胞水平的变化及其意义探讨摘要：目的探讨不同类型冠状动脉粥样硬化性心脏病患者外周血辅助性T细胞17（T help cell 17，Th17细胞）的变化及其临床意义。
方法选取急性心肌梗死（AMI）患者20例、不稳定性心绞痛（UA）患者25例、稳定性心绞痛（SA）患者19例及健康体检者22例。
采用流式细胞仪检测各组患者外周血Th17细胞占CD4+T细胞比例，采用实时定量PCR方法检测IL-17mRNA的表达，采用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测各组患者外周血白细胞介素（IL）-17的表达。
结果AMI 组和UA组患者外周血Th17细胞/CD4+T细胞、IL-17mRNA、IL-17表达明显高于SA组和健康对照组（P0.05）。
结论AMI患者和UA患者外周血中Th17细胞比例增加，IL-17mRNA及IL-17水平升高，Th17 细胞可能参与动脉粥样斑块不稳定和冠心病的发病。
关键词：冠状动脉粥样硬化性心脏病；辅助性T细胞17；IL-17；IL-17mRNA冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，基本病因是冠状动脉粥样硬化。
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是动脉血管壁的慢性炎症反应，其中CD4+T淋巴细胞发挥着重要的作用[1]。
近年来发现一种新的CD4+T淋巴细胞即Th17细胞，能分泌白介素（Interleukin）-17等多种细胞因子参与炎症过程[2]。
许多研究表明Th17细胞及其分泌的细胞因子参与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等多种疾病发病及进展[3-4]。
而目前动物实验表明，在动脉粥样斑块的发生发展中，IL-17参与巨噬细胞的活化并通过相关机制释放蛋白水解因子，IL-17和TNF-α水平的增加能够发挥协同作用创造促炎微环境，从而促进动脉粥样硬化性疾病的发生发展。
由此我们推测Th17细胞可能通过IL-17的促炎效应，参与并促进粥样斑块不稳定和急性冠状动脉综合征（ACS）的发生发展。
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流式细胞术分析TH17细胞
1.肝素钠真空抗凝采血管取人外周血全血1-2ml，血液室温放置，8小时内进行检测，否则需弃用。
2.取5个流式管，分别标记空白管、CD4抗体单染管、IL-17A抗体单染管、IL-17A同型对照抗体管、待测管，每个流式管分别加入100µl全血，用RPMI1640(不含FBS)1:1等体积稀释。
3.刺激细胞活化：向稀释后的全血样本管加入2µl BD Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug，货号550583(刺激剂和蛋白转运抑制剂)，混匀。
37o C，5%CO2培养箱或37o C水浴孵育4-6小时(不超过6个小时)。
4.细胞表面标记染色：向CD4抗体单染管、IL-17A同型对照抗体管、待测管这三管分别加入1Test体积的CD4抗体，室温避光孵育15-30分钟。
5.制备红细胞裂解液：制备1X.红细胞裂解液(BD Lysing Buffer10X，货号555899)，取10X红细胞裂解液，按照体积.1(10X红细胞裂解液)：9(dH2O)，稀释。
6.每100µl全血加入2ml1X红细胞裂解液，室温裂解15-30min，至细胞悬液呈澄清透明状。
7.裂红后，500g，离心5分钟，洗涤细胞，离心后弃上清。
8.加入1ml FBS（货号554656），500g，离心5分钟，洗涤细胞，离心后弃上清。
9.破膜固定液制备(货号554714)，554714包括Fixation/Permeabilization solution和BD Perm/Wash™Buffer(10X)。
Perm/Wash™Buffer(10X)需要稀释：1体积BD Perm/Wash™Buffer(10X)，9体积distilled H20，1：9混合，配制成1XPerm/Wash™Buffer
10.细胞固定：涡旋细胞3秒钟，每管加入250µL Fixation/Permeabilization solution，涡旋混匀，4°C孵育20分钟。
11.破膜：每管直接加入1ml1X Perm/Wash Working Solution到固定的细胞中，4°C，500g离心10分钟，弃上清。
12.每管加入1ml1X Perm/Wash Working Solution，4°C500g离心10分钟，弃上清。
13.胞内染色：每管加入50ul1X Perm/Wash Working Solution，同时IL-17A抗体单染管、待测管加入1Test体积的IL-17A抗体，IL-17A同型对照抗体管加入1Test体积的IL-17A同型对照抗体，涡旋混匀，4°C避光孵育40-50分钟。
14.涡旋细胞，每管加入1ml1X Perm/Wash Working Solution，4°C500g离心10分钟，弃上清。
15.重复第14步骤一次，每管加入350ul FBS（货号554656）洗液，上机检测即可。