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亚硫酸盐测序
氨基有机硫酸盐氧化物（Thiophenols）是环境、污染领域重要的精细指标，在大气
颗粒物、饮用水、地下水、水环境、工业排放气体及油土中等领域，都有广泛的应用。
由
硫酸异氰酸酯（ISCOM）组装的氨基有机硫除去剂，是目前应用最为普遍、成功率最高的
方法。
氨基有机硫酸盐是指含具有硫杂环、氨基和硫酸基等特征的有机物，如硝酸溴苯酚（BP）、硫磷（TP）、硫代苯磺酸（TSA）等。
氨基有机硫酸盐可以通过气相色谱/质谱（GC/MS）、气相色谱-质谱联用（GC/MS/MS）来进行测试及检测。
气相色谱/质谱仪将氨基有机硫酸盐样品的分子团解，从而进行分析，有助于准确测定氨基有机硫酸盐含量。
在这一测试中，首先需要对样本进行液相色谱分离，然后将样品注入气相色谱柱，进行挥发性多环芳烃（BTEX）检测，从而消除室溫效应等干
扰因素，确保试验测试的准确性。
之后进行质谱分析，来定性、定量分析氨基有机硫酸盐
的种类、含量。
总之，氨基有机硫酸盐测序通过气相色谱/质谱（GC/MS）、气相色谱-质谱联用
（GC/MS/MS）、液相色谱联用质谱联用仪（LC/MS/MS）来完成，是当前硫分析领域应用最
为普遍、检测精度高的方法，给监测氨基有机硫酸盐的应用提供了更加可靠的依据。
全基因组测序实验流程英文回答：Genome sequencing is a powerful technique used to determine the complete DNA sequence of an organism's genome. It provides valuable information about the genetic makeupof an individual or a species, allowing researchers tostudy the structure and function of genes, identifydisease-causing mutations, and understand evolutionary relationships.The process of whole-genome sequencing involves several steps. First, DNA samples are obtained from the organism of interest. These samples can be collected from blood, saliva, or tissue samples. Next, the DNA is extracted and purifiedto remove any contaminants. This ensures that the sequenced DNA is of high quality and free from interference.Once the DNA is purified, it is fragmented into smaller pieces. This can be done using physical methods, such assonication, or enzymatic methods, such as restriction digestion. The resulting DNA fragments are then ligatedwith adapters, which allow for the attachment of sequencing primers.The prepared DNA fragments are then amplified using a process called polymerase chain reaction (PCR), which produces multiple copies of the DNA fragments. This step is necessary to ensure that there is enough DNA for sequencing.The next step is sequencing the DNA fragments. Thereare several sequencing technologies available, including Sanger sequencing and next-generation sequencing (NGS). Sanger sequencing, also known as capillary electrophoresis sequencing, was the first method developed for DNA sequencing. It involves the use of fluorescently labeled nucleotides to determine the sequence of the DNA fragments.NGS technologies, such as Illumina sequencing andPacific Biosciences sequencing, have revolutionized thefield of genomics. These methods allow for the simultaneous sequencing of millions of DNA fragments, resulting in amuch faster and more cost-effective process.After sequencing, the raw data is generated in the form of short DNA sequences called reads. These reads are then aligned to a reference genome or assembled de novo to reconstruct the complete genome sequence. This step requires advanced bioinformatics tools and algorithms to accurately assemble the reads.Finally, the assembled genome sequence is analyzed to identify genes, regulatory elements, and other functional elements. This can involve comparing the genome sequence to known databases, predicting gene coding regions, and studying the genetic variation within the genome.中文回答：全基因组测序是一种强大的技术，用于确定生物体基因组的完整DNA序列。
基因组重测序流程Genome resequencing is a crucial process in modern biological research. 基因组重测序是现代生物研究中至关重要的过程。
It involves the mapping and sequencing of an individual’s genetic material to identify variations and mutations that may be associated with specific traits or diseases. 它涉及对个体遗传物质的映射和测序，以确定可能与特定特征或疾病相关的变异和突变。
This process has revolutionized our understanding of genetics and has had a profound impact on fields such as personalized medicine, agriculture, and evolutionary biology. 这一过程彻底改变了我们对遗传学的理解，对个性化医学、农业和进化生物学等领域产生了深远影响。
One of the key reasons for conducting genome resequencing is to identify the genetic basis of certain traits or diseases. 进行基因组重测序的一个关键原因是确定某些特征或疾病的遗传基础。
By comparing the genetic sequences of different individuals, researchers can pinpoint specific genetic variations that may contribute to the development of certain traits or diseases. 通过比较不同个体的基因序列，研究人员可以找出可能有助于某些特征或疾病发展的特定遗传变异。
#流程大放送#WGBS和RRBS测序分析流程介绍WGBS全称Whole Genome Bisulfite Seuqneicng，即全基因组重亚硫酸盐测序。
该方法通过Bisulfite处理，将原基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U的同时，保留所有甲基化C 的碱基不发生转变，从而帮助科研人员识别发生甲基化的CpG位点。
该种测序技术适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
RRBS全称Reduced Representation Bisulfite Sequencing，即简化代表性重亚硫酸盐测序。
该方法在Bisulfite处理前，使用MspI（该酶的酶切位点为CCGG）酶切对样本进行处理，去除低CG含量DNA片段，从而使用较小的数据量富集到尽可能多的包含CpG位点的DNA片段。
相比于WGBS技术，RRBS是一种准确、高效且经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切，并进行Bisulfite测序，该方法在保证DNA甲基化状态检测的高分辨率的同时提升测序数据的高利用率。
该项技术可用于以下研究1、处于特定时期或特定处理条件下的样本中，研究样本中染色体高精度DNA甲基化模式；2、比较不同细胞、组织、样本间的高精度DNA甲基化修饰模式的差异；3、疾病样本中，与疾病发生发展相关的高精度DNA甲基化表观遗传机理研究和相关高精度DNA甲基化位点分子标志的探索性研究。
数据处理和分析流程图分析结果示例图片展示示例图1 样本中各区域DNA甲基化水平信息统计和样本间差异DNA甲基化分析结果展示[1]示例图2 差异DNA甲基化区域内转录因子基序识别[1]示例图3 DNA甲基化水平变化与基因表达水平变化的关联性分析[1]示例图来源文献[1]. Ng, C.W., et al., Extensive changes in DNA methylation are associated with expression of mutant huntingtin. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(6): p. 2354-9.。
DNA甲基化检测实验一、重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）（Bisulfite Genomic Sequence）原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。
重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。
PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。
PCR产物克隆后进行测序。
通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA 分子中的甲基化状态。
该方法特点是：•特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；•灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。
用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。
重亚硫酸盐测序法技术实验流程A．DNA制备用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B．重亚硫酸盐处理C．DNA纯化用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D．PCR扩增E．PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化F．PCR产物连接到pMD19-T (Takara) 载体中克隆及测序。
G．用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析二、甲基化特异性的PCR实验流程（methylation-specific PCR, MSP）原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。
重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。
随后进行引物特异性的PCR。
该方法引物设计是关键。
MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非甲基化DNA链（引物对U）。
检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化（图3）。
重亚硫酸盐测序操作方案一、样品收集1、配制2%低熔点琼脂糖称取0.02 g低熔点琼脂糖，倒入1.5 mL离心管中，随后加入1 mL mPBS溶液，置于100℃金属浴中反复加热并颠倒混匀至完全溶解，取出4℃保存待用。
2、收集细胞样品80℃以上热水浴使低熔点琼脂糖溶化。
向1.5 mL离心管底部加入8 μL低熔点琼脂糖，避免产生气泡。
迅速吸取细胞样品吹入琼脂糖中，冷却后加入500 μL矿物质油覆盖。
最后将离心管在热水浴中短暂浸泡使琼脂糖小球成型，取出-20℃保存待用。
二、亚硫酸氢盐修饰3、配制DNA细胞裂解液：向20 mL TE缓冲液中加入100 μL 的20 mg/ml蛋白酶K。
4、向含样品的离心管内加入500 μL DNA细胞裂解液，50℃金属浴8 h以上，以消化样品。
6、消化完成后，将离心管取出，换液清洗使小球变性：0.3M NaOH，500 μL，15 min，2次；0.1M NaOH，1 mL，5 min，1次。
7、换液加入500 μL转化液，50℃金属浴8 h以上，以转化样品，注意避光。
8、用TE缓冲液中止转化，1 mL ，15 min，6次。
9、用0.2M NaOH脱磺化，500 μL，15 min，2次。
10、用TE缓冲液中止脱磺化，1 mL，15 min，3次。
11、用双蒸水清洗，1 mL，10 min，2次。
12、清洗完成，用枪头吸取琼脂糖小球转移至200 μL离心管中，-20℃保存待用。
三、甲基化基因的PCR第一轮反应体系25 μL，转化后琼脂糖小球计为2 μL DNA。
第二轮反应体系扩大为50 μL。
快速精确切取，将胶块放入1.5 mL离心管内。
四、胶回收15、对胶块称重，向离心管内加入3倍胶体积（0.1 g=100 μL）QG Buffer，50℃金属浴至胶融化，同批样品可统一为450 μL，以便于离心。
16、加入1倍胶体积（150 μL）异丙醇，颠倒混匀后将液体移入离心柱离心，13000 g，1 min。
重亚硫酸盐测序pcr实验流程英文回答：The process of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for sequencing of bisulfite-treated DNA involves several steps. First, the genomic DNA is treated with sodium bisulfite to convert unmethylated cytosines to uracils, while methylated cytosines remain unchanged. This treatment allows for the differentiation of methylated and unmethylated cytosines during sequencing. After bisulfite treatment, the DNA is purified to remove any contaminants.Next, reverse transcription is performed to convert the bisulfite-treated DNA into cDNA. This step is carried out using a reverse transcriptase enzyme and specific primers that target the region of interest. The reverse transcriptase enzyme synthesizes complementary DNA strands based on the template DNA. The resulting cDNA is then amplified using PCR.PCR amplification is carried out using specific primers that flank the region of interest. These primers are designed based on the converted DNA sequence afterbisulfite treatment. The PCR reaction mix contains DNA polymerase, dNTPs, and buffer. The reaction goes through cycles of denaturation, annealing, and extension to amplify the target DNA region. The number of cycles depends on the starting DNA concentration and the desired level of amplification.After PCR amplification, the DNA product is purified to remove any residual contaminants. This purified DNA is then subjected to sequencing analysis. The sequencing can be done using Sanger sequencing or next-generation sequencing technologies. The sequencing results provide information on the methylation status of individual cytosines within the target region.Overall, the RT-PCR process for bisulfite sequencing involves bisulfite treatment of DNA, reverse transcription to convert bisulfite-treated DNA into cDNA, PCR amplification of the target region, purification of the DNAproduct, and sequencing analysis.中文回答：重亚硫酸盐测序PCR实验流程包括以下几个步骤。
全基因组甲基化测序（WGBS）
技术简介：
全基因组重亚硫酸盐测序（whole genome bisulfite Sequencing）是基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法，首先通过重亚硫酸盐对样本DNA进行处理，将未甲基化的C碱基转化为U碱基，而甲基化的C碱基则不会改变，进行PCR扩增后U碱基会变成T，与原本甲基化的C碱基区分开，再结合高通量测序技术，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
应用领域：
•基因表达调控
•发育表观组学
•细胞分化、组织发育
技术优势：
•可精确分析每一个C碱基的甲基化状态
•可在全基因组水平上最大限度的获取完整的甲基化信息，精确绘制全基因组甲基化图谱
•适用于所有具有参考基因组的物种
•性价比高，相对于传统BSP或MSP方法，费用少
实验流程
A.建库测序流程
B.数据分析流程
如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！。
全基因组重亚硫酸盐测序表观遗传学研究已经证实了特定基因区域的DNA甲基化修饰对于染色体构象、基因表达调控机制有着重要影响，而全基因组DNA甲基化研究将是表观基因组学最为关注的内容之一。
Bisulfite处理能够将基因组中未发生甲基化的C 碱基转换成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来，再结合高通量测序技术，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
特定物种的高精确度甲基化修饰模式的分析，必将在表观基因组学研究中具有里程碑式的意义，并且为细胞分化、组织发育等基础机制研究，以及动植物育种、人类健康与疾病研究奠定基础。
技术优势:■单碱基精确度:精确分析每一个C碱基的甲基化状态。
■里程碑式的研究:特定物种的表观基因组学研究的重要内容，适用于所有具有精确基因组图谱的物种。
实验流程:● 基因组DNAA超声打断至100-500bp的片段● DNA片段末端修复、3’端加A碱基，连接测序接头。
● 采用EZ DNA Methylattion-Gold kit 进行Bisulfite 处理● 脱盐处理，PCR扩增后进行文库片段大小选择。
● 合格的文库用于上机测序。
信息分析流程图:生物信息分析:1. Data Clean测序结果进行去污染，去接头处理。
根据测序产生的序列文件*.fq 统计read长度，read 数量，数据产量。
2. 标准信息分析2.1 Bisulfite-seeq 序列与参考序列的比对在信息分析过程中，首先将每一对reads中正链reads上的C碱基转换为T碱基，而反链reads中的G碱基转换为A 碱基。
在此基础上使用SOAP软件，将reads与参考基因组序列进行比对，唯一比对reads将用于甲基化信息的分析。
数据比对统计结果如下:2.2 C碱基测序深度的累积分布甲基化C碱基在基因组上的分布包含三种形式(CG, CHG和CHH，其中H代表A 或T 或C碱基)。
下述图表中反映了三种不同分布类型的C碱基的测序深度累积分布。
重亚硫酸盐测序pcr实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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dna甲基化测序的金标准DNA甲基化测序的金标准是全基因组重亚硫酸盐甲基化（whole-genome bisulfite sequencing，简称WGBS）测序分析。
这种方法可以在全基因组范围内精确地检测所有单个胞嘧啶碱基（c碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。
WGBS测序方法首先对基因组DNA进行亚硫酸盐处理，使未甲基化的胞嘧啶碱基（C）变成尿嘧啶碱基（U），而甲基化的胞嘧啶碱基（C）保持不变。
然后，对处理后的DNA进行测序，通过生物信息分析，可以得到全基因组范围内每个碱基的甲基化状态。
这种方法被认为是DNA甲基化测序的金标准，因为它可以提供高分辨率的甲基化数据，适用于各种研究应用，如肿瘤发生发展、基因表达调控、个体发育等。
#流程大放送#WGBS和RRBS测序分析流程
介绍
WGBS全称Whole Genome Bisulfite Seuqneicng，即全基因组重亚硫酸盐测序。
该方法通过Bisulfite处理，将原基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U的同时，保留所有甲基化C 的碱基不发生转变，从而帮助科研人员识别发生甲基化的CpG位点。
该种测序技术适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
RRBS全称Reduced Representation Bisulfite Sequencing，即简化代表性重亚硫酸盐测序。
该方法在Bisulfite处理前，使用MspI（该酶的酶切位点为CCGG）酶切对样本进行处理，去除低CG含量DNA片段，从而使用较小的数据量富集到尽可能多的包含CpG位点的DNA片段。
相比于WGBS技术，RRBS是一种准确、高效且经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切，并进行Bisulfite测序，该方法在保证DNA甲基化状态检测的高分辨率的同时提升测序数据的高利用率。
该项技术可用于以下研究
1、处于特定时期或特定处理条件下的样本中，研究样本中染色体高精度DNA甲基化模式；
2、比较不同细胞、组织、样本间的高精度DNA甲基化修饰模式的差异；
3、疾病样本中，与疾病发生发展相关的高精度DNA甲基化表观遗传机理研究和相关高精度DNA甲基化位点分子标志的探索性研究。
数据处理和分析流程图
分析结果示例图片展示
示例图1 样本中各区域DNA甲基化水平信息统计和样本间差异DNA甲基化分析结果展示[1]
示例图2 差异DNA甲基化区域内转录因子基序识别[1]
示例图3 DNA甲基化水平变化与基因表达水平变化的关联性分析[1]
示例图来源文献
[1]. Ng, C.W., et al., Extensive changes in DNA methylation are associated with expression of mutant huntingtin. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(6): p. 2354-9.。
