凋落物PLFA取样和处理方法

凋落物和土壤前处理取样：每个次小区分别取1袋米老排凋落物和1袋杉木凋落物，每个网袋单独装入一个塑料袋；同时用土钻取网袋下面0-10cm土壤装入自封袋。

共36个网袋+36个土样。

网袋和土壤放在装有冰块的冰盒带回实验室。

凋落物前处理：1，混合：凋落物带回实验室后，用剪刀剪碎混合，分成三份，一份-20℃冷藏做PLFA，一份4℃保鲜做凋落物酶，另一份烘干称重计算分解速率。

2，脱水：把-20℃冷藏的凋落物放入冷冻干燥机脱水（-80℃），24小时左右3，粉碎：脱水之后的凋落物用球磨机粉碎，装入自封袋，封好袋口，-20℃冷冻。

4，运输：把凋落物和土壤样品装入放有冰块的大冰盒带到广州。

5，实验时每个样品用量为0.1g（华南植物园），其他程序与土壤PLFA一样。

土壤前处理：带回实验室的土壤人工挑拣出石子，细根等，然后混合放在-20℃冷冻带到广州。

具体实验步骤：1、凋落物样品用球磨机粉碎（<10 μm）2、称取冷冻干燥后的凋落物样品（250±1 mg）于玻璃离心管中（25 ml），用磷酸钾溶液（50 mmol l-1, pH 7.4）1.6 ml 、甲醇4 ml、氯仿 2 ml；3、涡旋30s，超声2 min，在37℃下温育30min，然后离心（800×g），将上层清液倒入50 ml分液漏斗中。

然后再重复浸提一次，合并两次上层清液。

4、向分液漏斗中再加入4 ml氯仿，4 ml水，然后轻轻的摇匀，放置整晚。

第二天5、收集分液漏斗中的下层清液（氯仿相），在氮气下吹干。

6、通过色谱硅胶小柱进行脂质分离：用氯仿（3×2 ml）洗脱中性脂质，用丙酮（3×2 ml）洗脱糖脂，这些全部丢弃。

最后用甲醇（3×2 ml）洗脱极性脂类，收集到玻璃试管中。

在氮气下吹干。

7、在剩余残留物中，加入2ml氢氧化钾（KOH），1 ml甲苯：甲醇（1：1，v/v），然后在37℃下温育30 min。

长期稻-稻-油菜轮作对土壤理化性质及微生物群落结构的影响杨敬林;李琳;胡德勇【摘要】为探究南方丘陵地区稻-稻-油菜轮作对土壤理化性质和微生物群落结构的影响,采用常规土壤农化分析和磷脂脂肪酸(PLFA)分析方法,以安仁县长期稻-稻-油菜轮作(DDY)和稻-稻连作(DD)土壤为研究对象,比较长期(30 a)DDY和DD处理后3个时期(早稻成熟期、晚稻成熟期、油菜成熟期)土壤理化性质和微生物群落结构的差异.结果表明,DDY处理土壤全氮、全磷含量及pH值均低于DD处理,其中,全氮含量在3个时期均差异显著,全钾含量增加但与DD处理差异不显著,有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量呈动态变化.轮作对土壤全氮含量影响较大,3个时期DDY处理全氮含量分别较DD处理降低50.76％、46.67％、49.62％.土壤微生物PLFA分析结果表明,与DD处理相比,DDY处理土壤微生物PLFA总量显著提高,3个时期分别提高19.69％、20.20％、49.12％,其中,DDY处理土壤细菌PLFA量显著增加,真菌PLFA量显著降低,真菌与细菌PLFA量比值显著降低.对土壤微生物PLFA进行主成分分析表明,轮作对微生物群落结构产生明显影响,2种种植方式主要影响土壤中细菌和真菌的数量.总之,长期稻-稻-油菜轮作促进了土壤全氮和全磷的分解,显著提高微生物生物量,尤其是细菌生物量,显著降低真菌生物量,提高两者的比值.%To explore the effect of rice-rice-rape rotation on soil physicochemical properties and microbial community structure in hilly area of southern China,the soil microbial biomass and composition of two kinds of different tillage systems[long rice-rice-rape rotation(DDY) and rice-rice continuous cropping(DD)] after 30 years of rotation were analyzed by PLFA marker spectrum analysis method,and the soil physicochemical properties during three periods(including the mature stages of early rice,late rice and oilseedrape) were studied.The results showed that compared with DD treatment,the contents of total N and total P and pH value of DDY treatment decreased,there was a significant defference for total N content,the total N content of DDY treatment significantly decreased by 50.76%,46.67%,49.62%;the total K content of DDY treatment increased,but the difference was not significant;the contents of organic matter,alkali-hydrolyzable N,available P,available K showed dynamic changes.Soil microbial PLFA marker test showed that compared with DD treatment,soil microbial PLFA amount of DDY treatment increased by 19.69%,20.20% and 49.12% at three different determination stages,respectively;the bacterial PLFA amount of DDY treatment increased,the fungi PLFA amount of DDY treatment decreased,and the ratio of fungi PLFA amount to bacteria PLFA amount of DDY treatment decreased.The principal component analysis of microbial PLFA showed that rotation obviously influenced the microbial community structure,the amount of bacteria and fungi were mainly affected by two tillage methods.Overall,the long term rice-rice-rape rotation promoted the decomposition of total N and P,significantly improved the microbial biomass,especialy bacteria,significantly decreased the fungal biomass,significantly increased the ratio of bacteria to fungi.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2017(046)009【总页数】6页(P45-49,61)【关键词】稻-稻连作;稻-稻-油菜轮作;土壤;微生物群落结构【作者】杨敬林;李琳;胡德勇【作者单位】湖南农业大学工学院,湖南长沙 410128;湖南师范大学数学与计算机科学学院,湖南长沙 410081;湖南农业大学工学院,湖南长沙 410128【正文语种】中文【中图分类】S154.3轮作是指同一块土地上有计划地按顺序轮种不同类型作物的复种形式，该栽培措施对改善土壤质地、促进作物生长和产量提高具有显著效应[1-3]。

PLFA 方法分为三个步骤，分别是提取、分离和甲酯化（1）提取：称2 g 干土加入4 mL 柠檬酸缓冲液（0.15 mol/L 二水柠檬酸三钠，0.15 mol/L 柠檬酸），5 mL 氯仿，10 mL 甲醇（柠檬酸缓冲液∶氯仿∶甲醇=0.8∶1∶2），轻微涡旋震荡30 s，超声处理2 min，25 ℃避光震荡2 h，4000 r/min离心10 min，将上清液转移到一个新的离心管中，重复操作取上清液（重复取的上清液放置于一个新的40 mL 的离心管中）。

每个离心管中各加入5 mL 柠檬酸缓冲液和5 mL 氯仿（柠檬酸缓冲液∶氯仿∶甲醇=0.9:1:1），震荡过夜，2500 rpm 离心20 min。

经过夜分离后，吸走上层（大约2/3）保留底层氯仿相，过处理定量滤纸（氯仿和甲醇混合液（2:1，V/V）浸泡处理），二者合并，在氮气流下吹干氯仿或者旋转蒸发（温度低于35 ℃）。

（2）分离：用0.5 mL 氯仿溶解，将氯仿加到硅胶柱顶部，过填充有活化硅胶（使用丙酮索氏提取硅胶6-8 h，120 ℃活化2 h）的玻璃管柱（高100 mm，直径6 mm），然后依次分别加入4×2.5 mL 氯仿、4×2.5 mL 丙酮、4×2.5 mL 甲醇（每次溶剂加入后自然洗脱至无液滴自然流下时真空抽干），收集甲醇相在氮气流下吹干。

（3）甲脂化：向吹干样品中加入1 mL 甲醇∶甲苯（1:1）和1 mL 0.2mol/LKOH 甲醇溶液（新鲜配制，甲醇不含水），手动摇晃 1 min，放入水浴35~36℃温浴15 min，后冷却到室温，依次加入2 mL 去离子水，0.3 mL 1 mol/LHAc，2 mL 正己烷，漩涡混合30 s，然后3000 r/min 离心10 min，重复提取（仅添加正己烷）一次，合并两次提取的正己烷相，加入甲脂化的C19:0 为内标，氮气流下吹干或者旋转蒸发，-20 ℃冷冻保存，在上机测定前用100 μL 正己烷（色谱纯）定容待测。

PLFA试剂及配制：3.1氯仿3.2甲醇3.3正己烷3.40.2 mol/L KOH 甲醇溶液：0.34g KOH溶于30ml甲醇；3.51M 冰醋酸：1.74ml冰醋酸溶于30 ml去离子水(现用现配)；3.61：1 = 甲醇：甲苯(现用现配)(30ml)；3.70.15M pH=4.0 柠檬酸缓冲液：准确称取20.66g柠檬酸，柠檬酸钠15.23g，加去离子水定容至1000ml。

3.8提取液-柠檬酸缓冲液:氯仿:甲醇=0.8:1:2(v/v/v)(约850ml)。

3.9硅胶柱(0.8克，100-200 目)：于120℃烘干2小时进行活化,并于干燥器中保存；3.10 Nonadecanoic acid methyl ester (19:0, Sigma)：190ug/ml;Supelcoe 37 Component FAME Mix：1000μg/ml;Supelcoe BAME (Bacterial Acid Methyl Esters) mix:1000μg/ml。

上GC前：取30μl 19:0脂肪酸甲酯+ 150μl 37Componet FAME s]定量标准。

仪器: 气相色谱一台；高纯N2；N2吹扫系统；真空干燥器；5ml衍生瓶；气谱上样瓶；150ul内插衬管；90ml带盖玻璃离心管；玻璃吸管；测定步骤：步骤1.所用有的器皿：去离子水和正己烷洗，玻璃管用锡箔纸包好，并编号；土壤样品冻干后，于干燥器中保存。

步骤2 从全土样品中提取脂肪酸第一天(6个样品+1个控制样+1个空白；每个样品三次重复)1.准确称取冻干土样5克，倒入50ml玻璃三角瓶●土壤样品重量应该准确记录●不同样品或处理编号应该一一对应，且应防止字迹被有机溶剂溶去。

2.用防毒面具：于每个样品管中加浸提液20ml;3.避光振荡2小时：小心放置以期达到最佳振荡效果。

4.25℃，2500 rmp离心10分钟。

5.尽可能于避光!：上清加入50ml具盖离心管中，于离心管外壁与盖上清楚地标记编号；6.并于土壤沉淀中再次加入浸提液12ml，充分振荡1小时；7.提取液再次离心，将上清合并；8.于合并的上清液中加入8.6ml柠檬酸缓冲液，10.6ml 氯仿；9.振荡离心管1分钟(盖子盖紧)，定时放气(vent periodically)；10.于黑暗(外加铝箔)中静置过夜，使两相分离；远离热源。

摘要：为探索马尾松（pinus massonana）凋落物在不同密度林分中微量元素的释放规律，以12 a生马尾松人工林为研究对象，采用网袋分解法，分析3种密度下马尾松凋落物分解过程中干质量损失率、4种微量元素含量和养分残留率变化。

结果表明，马尾松人工林凋落物残留率在不同密度间的变化趋势均相近，密度对残留率无显著影响。

不同月份残留率不同，11月至翌年1月迅速降低，然后减缓，春季和夏季加快降低，秋季又开始减缓。

凋落物中4种微量元素释放模式主要为“淋溶一富集一释放”（zn除外）。

经过1 a分解，各密度林分凋落物的干质量均损失过半；平均养分残留率从大到小为cu（84.9%）、fe（66.3%）、mn（55.9%）、zn（52.6%）；凋落物中zn残留率随密度增大而减小，其他养分变化不明显。

关键词：马尾松；人工林；凋落物分解；养分释放森林凋落物是森林生态系统的重要组成部分，是森林生态系统物质循环的重要环节之一，作为连接植物与土壤的“纽带”，它不仅维持土壤肥力，保持植物再生长的养分可利用性，而且在促进森林生态系统正常的物质生物循环和养分平衡方面具有十分重要的作用。

凋落物分解是其养分释放的主要方式，其分解速度决定着生态系统中养分循环的快慢，在一定程度上决定着土壤养分有效性的高低。

因此，有关凋落物分解的研究相当活跃。

马尾松具有耐干旱、瘠薄、适应性强、速生、丰产、优质、综合利用程度高等特点，因此成为中国南方地区荒山绿化和用材造林的重要树种之一。

林分的凋落物分解状况将直接影响马尾松生长和林分质量，为此，研究凋落物中微量元素的变化规律对管理马尾松林地养分平衡和长期可持续发展有重要作用。

目前对马尾松凋落物分解规律的研究见诸报道，但未见有对其分解过程中微量元素释放规律的研究。

鉴于此，选取贵州省龙里林场12 a生马尾松人工林为研究对象，采用网袋分解法，研究马尾松凋落物在不同密度林分中的分解动态及fe、mn、zn、cu 4种微量元素的释放规律，对服务林业生产和生态恢复具有重要的指导意义。

我的PLFA提取方法试剂：（每1土壤样品所需用量）1. 0.15 mol/L柠檬酸缓冲液：31.52g柠檬酸溶解于1L去离子水中，用NaOH调pH到4.0（保存时间为1周）；2. Bligh-Dyer土壤提取液：氯仿：甲醇：柠檬酸缓冲液=1：2：0.8 (体积比) （保存时间为1周）；3. 丙酮；4. 内标：19：0脂肪酸甲酯；5 60ug/mL的内标样十九烷酸nonadecanoic acid (C19:0,溶于甲醇)6试剂1 （NaOH:甲醇:蒸馏水=45g:150ml:150ml）（1×1ml）7 试剂2 （6N HCl:甲醇=325ml:275ml）（1×2ml）8 试剂3（正己烷:甲基叔丁醚=200ml:200ml）（1×9ml）9 试剂4 1.2% (w/v) NaOH （1×3ml）（所有玻璃仪器用前都要用正己烷清洗一遍并吹干。

）一、提取脂（extraction of soil lipids）称取2克土样，置于50mL三角烧瓶中，加入15mLBligh-dyer提取液，在摇床(约180左右)上摇2个小时。

然后3800rpm离心10min。

将上清液移入一干净的50mL 试管中。

再向三角瓶中加入7mL Bligh-dyer提取液，混匀，倒入离心管，置于涡旋混合仪上涡旋数秒，以超声波震荡提取（1-2min），如上离心10min，倒出上清液，即将两次上清液合并。

再向上清液中加入3.6mL柠檬酸缓冲液和4mL氯仿，剧烈涡旋振荡10秒左右，以锡箔纸封口，暗处静置过夜（时间不可过长）。

液体分为两相，膜脂分布于氯仿层（下层）中。

用长滴管吸出下层液体至10mL螺口管中，用氮气吹干，加1mL氯仿，-20℃保存。

二、过柱纯化（silicic acid chromatography）1、将硅胶柱固定于萃取架或者圆盘上，硅胶柱下面放好接废液的试管。

2、每个小柱用2.5mL 丙酮润洗2次（共5 mL），再用2.5mL氯仿润洗2次（共5 mL）。