免疫印迹法原理

免疫印迹法免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western-blot。

免疫印迹法分三个阶段进行。

第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。

此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。

第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。

此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。

第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。

常用的HRP底物为3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。

阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。

本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。

在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。

抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒，可方便地在实验室中供检测用。

根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。

一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）基本原理是聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acr聚合成长链并通过双功能化合物甲叉双丙烯酰胺Bis交联而成的三维网状结构凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度取决于凝胶的总浓度，总浓度越大，平均孔径越小，机械强度越强。

活性蛋白整体方案免疫印迹(Western Blot)的基本原理、实验步骤Western Blot原理Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。

固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

转移后的NC膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA 或脱脂奶粉溶液）处理，封闭NC膜上的疏水结合位点。

用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。

用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。

处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

实验操作(一)配胶1.将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡），加入10%AP及TEMED即可。

3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。

封胶后静置至胶凝固。

待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O活性蛋白整体方案冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。

4.灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使梳孔变形。

拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。

蛋白免疫印迹的原理
蛋白免疫印迹（western blotting）是一种常用的生物化学实验
技术，用于检测和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达水平和特异性。

其原理基于蛋白质的电泳分离、膜转移和特异性抗体结合。

首先，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将待测蛋白样
品按照分子量大小进行分离。

然后，将分离出的蛋白质在电泳胶上通过膜转移（blotting）的方式转移到固相材料（通常是
聚乙烯二醇涂层的聚丙烯酰胺膜或硝酸纤维素膜）上。

转移完成后，膜上的蛋白质被非特异性蛋白质结合，为了防止进一步非特异性结合，可以使用一种无效蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或非脂母细胞肿瘤中抗原（NFSA）来封闭非特
异结合位点。

紧接着，膜上的蛋白质与针对特定蛋白的抗体发生特异性结合。

这些抗体可以是直接标记的（如荧光染料或酶联物质），或者是需要进一步与辅助抗体结合才能被检测到。

特异性抗体与膜上蛋白质结合后，通过洗涤步骤去除非特异性抗体。

最后，通过添加染色剂（如酶底物）或者使用荧光扫描仪，可以可视化结合在膜上的抗体。

蛋白免疫印迹的结果可以用于定量分析蛋白质的表达水平、鉴定特定蛋白的存在以及研究蛋白质的功能和相互作用。

免疫印迹实验原理
嘿，朋友们！今天咱来唠唠免疫印迹实验原理。

你说这免疫印迹实验啊，就像是一场奇妙的侦探之旅！咱要找的就是那些隐藏在蛋白质世界里的“小秘密”。

想象一下啊，细胞就好比一个大仓库，里面装满了各种各样的蛋白质。

而我们呢，就是要从这个大仓库里把我们感兴趣的特定蛋白质给揪出来。

这可不容易哦，就像在一堆沙子里找一粒特别的小石子儿。

首先呢，我们得把细胞里的蛋白质都给弄出来，这就像是把仓库里的东西都倒出来摊开。

然后呢，我们利用电泳这个神奇的手段，根据蛋白质的大小啊、电荷啊等等特性，让它们排好队，各就各位。

这一步可太关键啦，就像把混乱的人群按照高矮胖瘦排好一样。

接下来，这些排好队的蛋白质就会被转移到一张膜上，就好像是把它们从一个地方搬到另一个地方。

这张膜就成了它们的新家啦。

然后呢，我们就派出我们的“秘密武器”——抗体！这抗体就像是一个个小侦探，专门去寻找我们指定的那个蛋白质。

抗体一旦找到了目标，就会紧紧地抱住它，绝不撒手。

最后，我们通过一些特殊的方法，让这个结合的地方显现出来，哇，这不就找到了我们想要的那个蛋白质嘛！是不是很神奇呀！
你说这免疫印迹实验像不像一场刺激的游戏？我们就是游戏的玩家，要运用各种策略和技巧来找到最终的答案。

而且这个实验的用处可大啦！可以帮助我们检测疾病啊、研究蛋白质的功能啊等等。

所以啊，大家可别小瞧了这免疫印迹实验，它可是我们探索蛋白质世界的一把金钥匙呢！它能让我们解开很多生命的奥秘，让我们对这个世界有更深刻的认识。

怎么样，是不是对免疫印迹实验原理有了更清楚的了解啦？是不是也觉得它超级有趣呢？快去试试吧！。

蛋白质免疫印迹的原理蛋白质免疫印迹是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白质在混合物中的存在并确定其分子量。

该技术基于蛋白质与特异性抗体之间的特异性结合原理，通过将抗体与蛋白质结合，然后使用特定的检测方法来观察和分析蛋白质的存在与性质。

蛋白质免疫印迹技术需要获取感兴趣的蛋白质样本。

这些样本可以来自细胞、组织、血清等。

通常，需要先对样本进行蛋白质提取和纯化，以获得高质量的蛋白质样本。

接下来，将蛋白质样本进行电泳分离。

常用的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳法（2-DE）。

通过电泳分离，可以将蛋白质样本按照其分子量和电荷大小进行分离。

分离完成后，将电泳胶中的蛋白质转移到固定膜上。

这通常通过半湿式或干式转移的方法实现。

在半湿式转移中，将电泳胶和膜以间隔层叠放置，通过电流将蛋白质从胶体转移到膜上。

在干式转移中，将电泳胶和膜分开，使用特定的设备将蛋白质转移到膜上。

转移完成后，膜上的蛋白质被固定在膜上，形成蛋白质膜。

为了防止非特异性结合，膜上的蛋白质被处理成一定的条件，如用乙酸酐等进行酰化处理。

这样可以增加膜上蛋白质与抗体之间的特异性结合。

接下来，将蛋白质膜进行免疫染色。

首先，在蛋白质膜上加入特异性抗体。

这些抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。

然后，用荧光标记的或酶标记的二抗与抗原-抗体复合物结合。

这些二抗可以识别并结合一定类型的抗体，从而实现对蛋白质的检测和定量。

使用相应的检测方法观察和分析蛋白质的存在与性质。

常用的检测方法包括荧光成像、放射免疫测定和酶联免疫测定。

这些方法可以通过测量光信号、放射性信号或酶反应产物的生成来确定目标蛋白质的存在与性质。

总结起来，蛋白质免疫印迹技术是一种基于蛋白质与特异性抗体之间的特异性结合原理的实验技术。

通过将抗体与蛋白质结合，然后使用特定的检测方法来观察和分析蛋白质的存在与性质。

这项技术在生物医学研究和临床诊断中被广泛应用，对于研究蛋白质功能和疾病机制具有重要意义。

蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。

对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。

经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。

以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。

该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。

实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。

5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。

免疫印迹法检测原理嘿，朋友们！今天咱来聊聊免疫印迹法检测原理，这可真是个神奇又有趣的玩意儿呢！你可以把免疫印迹法想象成一场盛大的“蛋白质派对”。

细胞就像是一个装满各种“蛋白质客人”的大房子。

我们要做的呢，就是把这些“客人”一个一个地请出来，然后认清它们。

首先，得把细胞给弄破，这就像是打开房子的大门，让“客人”们都跑出来。

然后呢，通过电泳这个神奇的魔法，根据“客人”们的个头大小，把它们整整齐齐地排好队。

这时候，这些蛋白质就会在凝胶上形成一条漂亮的“蛋白质跑道”。

接下来，就是把它们转移到一张特殊的“纸”上，就好像把“客人”们从跑道上请下来，安排到一个新的地方。

这张“纸”可厉害啦，它能牢牢地抓住这些蛋白质。

然后呢，就该抗体登场啦！抗体就像是一个个聪明的小侦探，它们专门去寻找特定的“蛋白质嫌疑人”。

这些小侦探会紧紧地抱住它们要找的“嫌疑人”，绝不撒手。

为了能让我们看到这些小侦探和“嫌疑人”抱在一起的样子，我们还得给它们加点颜色。

这就像是给它们打上聚光灯，让它们在舞台上闪闪发光。

一旦染上颜色，那些我们关心的特定蛋白质就无处可逃啦，我们就能清楚地看到它们啦！你说这是不是很神奇呢？就像在一个神秘的实验室里进行着一场精彩的探秘之旅。

免疫印迹法的用处可大了去了！它能帮助我们检测各种蛋白质的存在与否，就像是给我们一个了解细胞内部秘密的超级钥匙。

医生们可以用它来诊断疾病，科学家们可以用它来研究各种生物学问题。

比如说，在研究癌症的时候，我们可以通过免疫印迹法看看那些和癌症相关的蛋白质是不是变得不正常啦。

这就像是在黑暗中找到了一盏明灯，指引着我们找到解决问题的方向。

它还能帮我们了解药物是怎么起作用的呢！是不是很厉害？想想看，我们能通过这么一个小小的实验，了解到这么多重要的信息，这简直太酷了吧！总之呢，免疫印迹法检测原理就像是一把神奇的钥匙，能打开细胞这个神秘宝盒的大门，让我们看到里面的精彩世界。

它是我们探索生命奥秘的有力工具，让我们能更好地了解自己的身体，了解这个奇妙的世界。

Western免疫印迹（Western Blot）一.原理：Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

也应用于检测蛋白水平的表达。

二.试剂1.裂解液：碧云天RIPA裂解液（强）主要成分为：50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1%TritonX-100，1% sodiumdeoxycholate，0.1% SDS，以及2mM sodium pyrophosphate，25mM β-glycerophosphate，1mM EDTA，1mM Na3VO4，0.5 ug/ml leupeptin等多种抑制剂。

2.PSMF：中文-苯甲基磺酰氟，有剧毒；在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中；100mmol/L PMSF溶液配制方法：溶解174mg的PMSF于足量的异丙醇中，定容到10ml，分装成小份贮存于-20℃，使用时终浓度一般为1mmol/L。

3.裂解液（含PMSF）的配制：1ml裂解液加100 mM 的PMSF 10 μl（只是比例关系，根据样品量计算出裂解液的实际体积再配制相应的裂解液）。

PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合4.丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N,N’-亚甲双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

)储于棕色瓶，4℃避光保存。