实验1特殊显微镜的使用共26页

4、有不同程度的衰减
5、 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、 荧光效率
荧光的产生
➢ 一次荧光：又叫自发荧光或固有荧光，经过紫外光照射直接 发出荧光。
➢ 二次荧光：又叫继发荧光，被观察物体经过荧光染料处理之后，经 过紫外光照射才能发出荧光。
➢ 荧光染料种类很多：
荧光显微镜原理
➢ 荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源，经过滤 色系统发出一定波长的光(如波长短的紫外光 365nm或紫蓝光420nm)作为激发光、激发标本内 的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过 物镜和目镜的放大进行观察。
➢ 暗视场显微镜就是利用此原理设计的。
丁达尔现象
➢ 暗视场显微镜是在普通光学显微镜中去除明视场聚光器，换上 一个暗视场聚光器而成。
➢ 它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视场聚光器，常用的 是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡,不能由下而上地通 过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的 标本上。
➢ 特殊显微镜是与明视场普通显微镜相对而 言，在成像原理、结构和用途上存在差异 的显微镜。
➢ 这里介绍： 1、暗视场显微镜 2、相差显微镜 3、荧光显微镜
一、 暗视场显微镜
应用：微小粒子、细菌形 态、细菌记数，透明标 本观察等。
(一) 原理和结构特点
➢ 在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不 易被看见的，但在暗的房间中若有一束光 线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了， 这是光学上的丁达尔现象。
要求与注意事项
➢ (1)制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁干净，必须使用薄玻片(载玻片厚度约 1.O～1.1mm，盖玻片厚度约0.1mm)，否则会影响暗视野集光器斜射光焦点的调节， 如载玻片太厚，焦点只能落在载玻片内，就不能看到物像。标本也不能过厚。

目镜、调换物镜或移动装片来观察污物是否移动，从而判定 污物所在的位置。具体方法：玻片移，污点移，则污点在玻 片上；物镜换，污点移，则污点在物镜上；目镜移，污点移， 则污点在目镜上。
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(2)显微镜放大倍数的计算
如图甲为目镜，无螺纹，图乙为物镜，有螺纹。显微镜的放大 倍数等于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。若物镜为 10×，目镜为10×，其放大倍数就为10×10＝100倍。
(3)区分细胞和气泡的方法：气泡一般边缘较黑、较宽，形态呈 圆形或椭圆形，中心往往是一片空白，用镊子轻轻压一下盖 玻片它会变形或移动，而细胞不易变形，且有一定的形态结 构。
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(4)气泡处理方法：盖盖玻片时，
应用镊子夹起盖玻片，让其一侧接触
液滴，然后慢慢放平，如图所示，这样
可以避免产生气泡，有利于观察。若不慎产生气泡，可在盖玻 片的一侧滴加一滴清水，在另一侧用吸水纸引流，这样气泡 就会从盖玻片与载玻片之间随水流出，或用橡皮胶头挤压， 将里面的气体挤出。
2．(2020·贵州铜仁)当我们用显微镜观察植物细胞时，下列哪
种目镜和物镜的组合，在视野中能看到的细胞数目是最B少的 ()
A．目镜5×、物镜10× B．目镜12.5×、物镜40×
C．目镜5×、物镜40× D．目镜10×、物镜10×
3．(2018·黑龙江绥化)如果显微镜视野中出现了一个污点，转
动目镜，污点没有动，移动玻片标本，污点依然没有动，由
编号 第1组 第2组 第3组
目镜放大倍数 5× 5× 10×
物镜放大倍数 10× 40× 40×
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(1)在使用显微镜时，要想视野内出现的细胞数目最多，则选择 目镜、物镜的组第合1是组________。
(2)若在视野内看到了“N”，则玻片标本上的原图是N ____。 (3“)当凹光面线镜较”暗)来时对，光用。反光镜的___凹__面__镜__(选填“平面镜”或 (4)在显微镜下观察人血永久涂片时，想让观察到的血细胞体积

3-2
微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察
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3．革兰氏染色法：
革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞 壁结构和组成不一样而决定。用结晶紫初染后，全部细菌都 染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘 复合物，增强了染料与菌体结协力。用乙醇脱色处理时，两 类细菌脱色效果是不一样。G＋细菌细胞壁主要由肽聚糖形 成网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细 胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫— 碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染依然 保持初染剂蓝紫色。G-细菌则不一样，因为其细胞壁肽聚糖 层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解， 细胞壁通透性增大，使结晶紫—碘复合物比较轻易被洗脱出 来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂颜色。
总菌数 A 16104 B 32000A B（个 / ml） 5
4-3
微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察
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2. 区分酵母菌死活细胞基础原理 美蓝是一个无毒性染料，它氧化型呈蓝色，
还原型是无色。用美蓝对酵母菌活细胞进行染 色时，因为细胞新陈代谢作用，细胞内含有较 强还原能力，能使美蓝由蓝色氧化型变成无色 还原型。所以，含有还原能力酵母活细胞是无 色或淡蓝色，而死细胞或代谢作用衰老细胞则 呈蓝色，借此即可对酵母菌死细胞和活细胞进 行判别。
微生物实验显微镜的使用及微生物形态观察
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四. 试验内容
1. 酵母菌形态观察及死活细胞判别 (1) 在载玻片上加半滴美蓝染液，在染液上 滴一滴菌液。取一块盖玻片，先将一边与菌液 接触，然后慢慢将盖玻片放下盖在菌液上。
(2) 将标本片放3分钟后，先用低倍镜然后用 高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并依据颜

电压的符号） ， 另一只没有固定的 MF就会作微小移动． 再把这只MF固定而放松前两只MF ， 同时去掉加 在压电陶瓷上的电压 ， 使其长度复 原． 这一循环的结果是“ 虱子 ”爬 行了一步以适当的顺序控制加在压 电陶瓷上和MF
秒可爬行
之间 每
用这
μm
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步
30
10
1
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- scoPe ， 简称STM
科学界公认为
年代世界十
尔（H
世纪
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80
20
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m更小的物体或物质的结构细节 ， 光学 显微镜使人类的视觉得以延伸 ， 人们可 以观察到像细菌 、细胞那样小的物体 ， 但由于光波的衍射效应 ， 使得光学显微 镜的分辨率只能达到
. 人的眼睛不能直接观察到比
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IBM公司的科学家展示了一项令世 人瞠目结舌的成果 ， 他们在金属镍表面用35 个惰性气体氙原子组成“ IBM ”三个英文字
V
0
时 ， 它不可能越过此势垒 ， 即透射系数等于零， 粒子将完全被弹回 。而按照量子力学的计 算 ， 在一般情况下 ， 其透射系数不等于零， 也就是说 ， 粒子可以穿过比它能量更高的 势垒(如图
z方向的运动 由处在“十 ”字型中心的一个压电陶瓷管完成，
-y上 。这种结构的
y扫描电压以大小相同 、符号相反的方式分别加在一对
x-y扫描单元是一种互补结构 ， 可以在一定程度上补偿热漂移的影响。
x和
x和
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x
y
、
、
-
■ Binnis和Roh rer等人早期在IBM苏黎世实验 室设计的STM中 ， 采用一个叫作“ 虱子 ”（L ） 的粗调驱动器（见下图）

相差显微镜：把透过标本不同部 分的可见光（通过环形光阑形成 的环状入射光）的光程差转变成 振幅差（光强度），从而提高各 种结构间的对比度，使各种结构 变得清晰可见。 用途：主要用于观察活细胞或不 染色的组织切片，有时也可用于 观察缺少反差的染色样品。
相差显微镜光路图
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荧光显微镜：利用一个高发 光效率的点光源，经过滤色 系统发出一定波长的光(如紫 外光365nm或紫蓝光420nm) 作为激发光，激发标本内的 荧光物质发射出各种不同颜 色的荧光后，再通过物镜和 目镜的放大进行观察。这样 在强烈的对衬背景下，即使 荧光很微弱也易辨认，敏感 性高。 用途：主要用于细胞结构和 功能以及化学成分等的研究。
倒 置 相 差 显 微 镜
7
1m=103mm=106μm=109nm
0.1nm
OM
1nm 10nm 100nm 1μm 10μm 100μm
光学显微镜
电子显微镜
扫描隧道显微镜
SEM
1mm
1cm
肉眼分辨0.2mm
分辨极限0.2 μm 放大倍数10×40倍 分辨极限0.2 nm 放大倍数 数万倍
TEM
8
扫描隧道显微镜
用STM拍下的DNA
用STM拍下的血细胞
9
实验内容：
一、暗视野显微镜的使用 二、荧光相差显微镜的使用
实验目的： 了解暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显
微镜的工作原理和使用方法。
10
1 暗视野显微镜
+ 根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背 景条件下观察被检物体的显微镜
+ 观察到明场看不到的极其微小的物体 + 最高分辨率可达0.004微米
人血细胞（40 × ）
人血细胞（40 × ）

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3.使用显微镜注意事项
（3）正确使用高倍物镜办法 由于高倍物镜工作距离小, 镜头易损坏, ,并
且把光圈开大。 （4）注重准焦螺旋使用
在使用高倍物镜时, 不要调整粗准焦螺旋, 避免物镜损坏、装片压烂。 （5）不是倍数越大, 越清楚
假如目镜倍数过大, 得到放大虚像则很不清 楚。在低倍镜下能看清楚物像, 不必用高倍镜 观测。
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视野中物像与标本移动关系: 如视野中某观测对象位于左下方如 何移到中央，应将装片或切片向左 下方移动（同向移动）。原因是视 野中物像移动方向或切片移动方向 相反
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污点判断: 玻片移，污点移，则污点在玻片上； 物镜换，污点移，则污点在物镜上； 目镜转，污点移，则污点在目镜上
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练习:
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洋葱鳞叶表皮细胞(10×40)
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洋葱鳞叶表皮细胞(10×40)
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洋葱鳞叶表皮细胞装片（10 × 40）
细胞壁
细胞核 细胞质(液泡)
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3.使用显微镜注意事项
（1）显微镜安放位置, 显微镜应安放在离桌边沿5 cm、镜筒向前,
并讲清显微镜位置稍靠左侧道理（两眼同时 睁开观测, 眼不易疲劳, 便于绘图。）
（2） 对光依据光线强弱来选择平面镜或凹面 镜；用低倍镜进行对光, 把低倍镜位置放低； 在转动转换器时, 物镜到位, 光圈调整好, 视野 光线均匀、明亮.
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（一）显微镜结构 普通光学显微镜结构包括两大部分, 即确保成象光学系统和用以装置光 学系统机械部分。
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粗准焦螺旋 细准焦螺旋 镜臂
倾斜关节
目镜
镜筒 转换器 物镜 载物台 集光器 通光孔 压片夹 反光镜 底座

实验内容
1、特殊显微镜及其使用
2、线粒体和叶绿体的分离
3、巨噬细胞的吞噬实验 4、ACP、过氧化物酶等的显示 5、小鼠骨髓细胞染色体标本的制备 6、动物细胞染色体分带技术
实验要求
➢ 永久制片
—实验开始前细查张数及有无破损
节 约
➢ 清点器械
规
➢ 实验报告
范
➢ 实验室卫生
实验一 特殊显微镜及流式细胞仪的使 用
• 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。
• 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透射 微分干涉差法相结合。
• 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。
4、使用方法（反射荧光显微镜）
1）打开灯源开关（汞灯及普通灯光源），超高压汞灯要预热几分钟才 能达到最亮点。
2）反射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／ 双色束分离器／阻断滤片的插块。
3）放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末装滤光片不 要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；
4）高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则 会不稳定，影响汞灯寿命。
5）先在普通光源下（数字调为1）用10倍物镜调整好玻片的焦距， 后转至40倍物镜。材料目标与焦距调好后，关闭普通光源的电源 （或用载物台下面的挡板将来自下面的普通光源挡住），数字调
拍照时，将右边的拉杆拉出。双击电脑上的软件图标，选择 Preview按钮，选择set 可以拍照，选择Auto set按钮可以电脑自 动调整照片亮度。然后点击保存图标，保存在电脑上。
4 用途：
用于观察组织培养中活细胞形态结构或未染色标本。
5、标本
活细胞
三、荧光显微镜
1、原理
荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统 发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发 光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的可见荧光， 再通过物镜和目镜的成像、放大，以供检视和拍摄。

四、扫描隧道显微镜（STM）单原子操纵的应用
• 原子尺度器件应用的可能性：
• 早在1959年，著名物理学家Feynman曾对未来的物理学作 了一个精彩的预言：当人类能在原子的尺寸上进行操纵时， 我们将得到具有大量独特性质的物质，能够做许多与现在 不同的事情……，如果能够在原子和分子水平上制造材料 和器件，就会有许多令人激动的崭新发现。
• 第二种可能性是用放置到表面上的单个原子作为一个比特 来存储信息。那么上述单原子操纵中向表面放置单个原子 的结果则可以用来写入信息；而施加原子后再移走的结果 则既可以用来删除被写入的信息又可以用来清除沉积在表 面吸附原子上面的原子所形成的信息噪音。
• 单原子提取有各种可能的机理： 在强电场的作用下，键断裂，自由原子通过表面扩散
到达一新的位置( 见图( a) ) ；
自由原子与STM 针尖原子碰撞，而被散射到一新的位 置( 见图( b) ) ；
自由原子先吸附在针尖上，然后在某种条件下，离开 针尖，重新回到样品表面( 见图( c) ) 。
• 纵向操作单原子的放置有以下三种方式：
• 2、利用原子间力 • 探针尖端和试样原子间力主要是范德华力、静电力和浮悬
力。当探针接近试样时，由于原子间力的作用探针可能吸 附或释放试样原子，当然此种吸附为物理吸附。
• 1993年， Eigler等进一步将吸附在Cu表面上48个Fe原子 逐个移动并排列成一圆形量子栅栏，如图所示。这个圆形
量子栅栏的直径只有14.26nm，而且，由于金属表面的白
• 单原子存储器：
• 单原子操纵的实验结果能够满足存储器的这些最基本的功 能。这里有两种可能性：第一种可能性是用表面上单原子 的空穴作为一个比特来存储信息。那么上述单原子操纵中 从表面上移走单个原子而在表面上加工出单原子空穴的结 果则可以用来写入信息；而用单原子修补表面缺陷则既可 以用来删除已写入的信息又可以用来清除表面上原有的原 子缺陷空穴所形成的信息噪音。

④打开视场光阑，使其边缘与目镜中的视场同样大小。
• 7.如果换用高倍相差物镜观察，需要移入相应的高倍相差
物镜的聚光器环状光阑进行观察。
(A) bright-field microscopy.(B) phase-contrast microscopy (C) differential-interference-contrast microscopy. (D) dark-field microscopy.
特殊显微镜的使用
实验一 特殊显微镜的原理及其使用
I 暗视野显微镜
一、实验目的
• 了解暗视野显微镜观察活细胞的基本原理； • 了解暗视野显微镜的特殊组件和位置； • 掌握调节暗视野显微镜的基本步骤。
2.结构特点
• 相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用 环状光阑代替可变光阑，用带相位板的物镜(通 常标有PH的标记)代替普通物镜，并带有一个合 轴调节用的望远镜。
ห้องสมุดไป่ตู้谢观看
相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。 观察物镜后焦面，调节仪器使聚光器中环状光阑的像和相差物镜中相板的圆环互相吻合，这一步是调好相差最重要的步骤。
相板上有两个节区域聚，直光射光器通过上的部的分叫调“共中轭面螺”，旋衍射使光通之过的吻部分合叫“。补偿调面”节。 吻合后，取出聚焦
如果换用高倍相差物镜观察，需要移入相应的高倍相差物镜的聚光器环状光阑进行观察。 实验一 特殊显微镜的原理及其使用
缘清楚；③调节聚光器的调中螺旋，使视场光阑 相位板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。
相位板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。 相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。