免疫组化双重染色技术

在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。

(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。

直接法简便可靠，但灵敏度较低。

(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。

使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。

条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。

6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。

-1032-临床与实验病理学杂志J Cliv Exp Patinl2020Dec；36(8)网络出版时间：2020-8-258：46网络出版地址：https://kus.c/di.ue/kcms/2e4il/34.1073.R.62221025.1457.025.htul免疫组化双重染色技术在胸腺肿瘤PD-P1检测中的应用邢杰，赵继开，丁闻洁，韩昱晨关键词:胸腺瘤;PDW/PD-L-;免疫组化双重染色中图分类号:R734.5文献标志码：B文章编号：008-7366（2222）10-1435-03doi:44.13315/j.c/di.cjcep.7020.10.226PDW/LD-CI通路已经在多种肿瘤中进行了广泛深入的研究，如黑色素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌等，并且PDN/PD-L8表达可能与恶性肿瘤的临床病理特征或不良预后相关J T。

近年来国内外关于胸腺瘤PDN/PD-C-的研究较少，但均表明PD-CI表达与胸腺肿瘤（包括胸腺瘤和胸腺癌）的组织学类型、MasaWs分期以及疗效相关，并且能够提示肿瘤的恶性程度及预后J「5。

常规PD-C8检测方法为免疫组化，但PD-C8在正常的胸腺上皮细胞及淋巴细胞中也有表达J-6,可能使得免疫组化染色结果判读困难，为解决这 一问题，作者尝试采用P/3+PDW-免疫组化双重染色法对胸腺肿瘤进行染色，由于p/3广泛表达于上皮源性肿瘤细胞胞核,p63+PD-C I免疫组化双重染色法能够更加清楚的判断胸腺源性上皮细胞的PD-C8阳性率。

1材料与方法14材料收集上海市胸科医院病理科存档的胸腺肿瘤手 术切除样本64例，其中B1、B2及B3型胸腺瘤各I5例，胸腺癌-5例，每例胸腺肿瘤连续切片3张，分别用于HE染色、PD-C8免疫组化染色、p63+PD-C I免疫组化双重染色。

14染色方法标本均经I0%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，免疫组化染色采用Mulbmer法，染色平台为Dabu Link48全自动免疫组化染色平台,一抗PD-CI（22C3,5 :50,Dako公司）、p63（-:300,上海长岛生物公司、，其他试剂均为Dako AuWstainr Link48全自动免疫组化染色平台专用试剂,购自安捷伦科技（上海）公司。

免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。

冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。

将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。

（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。

去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

一种简便、可靠的免疫组化双重标记新方法崔白苹;高璀乡;熊存全;孙安阳【摘要】Aim To establish a convenient, reliable and high- n<br> contrast method of immunohistochemical double labeling, n<br> which can be observed with ordinary optical microscopy, and the staining results can be preserved permanently. Method This double labeling method employedthe single detection system, HRP conjugated second antibodies, and used the substrates of 3,3′-diaminobenzidine ( DAB) and Nickel-enhanced DABre-spectively. When the first labeling was completed, HRP was to-tally inactivated by boiling for 4~5 min to prevent the cross-re-action in the second labeling. Results ( 1 ) Boiling for 5 min could completely inactivate HRP activity, whereas 5% H2 O2 treatment only reduced HRP activity, and residual enzyme activ-ity generated the cross-reaction between two labeling. Boiling for a few minutes did not damage positive DAB staining in the first labeling or tissue integrity. (2) There was a sharp contrast be- n<br> tween DAB in brown and Nickel enhanced DAB in purple-blue, which also gives clean backgrounds;reversely applying the sub-strates will ruin the quality of double labeling. In addition, the above method allowed conventional mounting protocol using xy-lene and Permount, instead of a water-based mounting medium, thus the staining results could be permanently preserved. Con-clusion As the same HRP detection system is employed, this novel double labeling method is simple, convenient and reliable. The method would bear broad applications in basic and clinicalresearch.%目的：探索一种简便可靠、清晰的免疫组化双重标记方法,可用普通光学显微镜观察,并能长期保存染色结果。

应用双重免疫组化染色法研究Ｐ５３与细胞角蛋白在鼻咽癌中的表达[摘要] 目的应用双重免疫组化染色法，研究P53与细胞角蛋白在鼻咽癌中的表达。

方法50例鼻咽部低分化鳞癌组织，P53单克隆抗体，CK多克隆抗体，双重免疫组化染色。

结果50例鼻咽部低分化鳞癌组织标本均有不同数量的双标记阳性细胞，即P53与CK同时表达。

结论双重免疫组化染色法，可用于研究P53与细胞角蛋白在鼻咽癌中的表达。

[关键词]双重免疫组化染色法；鼻咽癌；P53；细胞角蛋白[文献标识码]A[文章编号] 1673-755512007]02-5-02双重染色法是在一张切片上做两种不同染色的方法，如免疫组化和免疫组化、免疫组化和原位杂交、免疫组化和特殊染色等。

其中双重免疫组化染色是在同一张切片上显示两种不同抗原的免疫组化染色方法，这种方法可以了解不同细胞、组织之间的相互关系，甚至可以了解同一种细胞内抗原之间的相互关系。

本实验运用双重免疫组化染色法，在一张切片上同时显示鼻咽部低分化鳞癌组织P53与细胞角蛋白(cytokeratin，CK)，用以观察CK阳性的癌细胞是否同时表达P53。

1材料和方法1．1材料50例鼻咽部低分化鳞癌组织，选自郑州大学三附院病理科2004年1月～2006年1月标本。

1．2方法1．2．1 P53单克隆抗体，CK多克隆抗体，双重免疫组化染色试剂盒，均为美国Maxim公司产品。

预实验中将同一组织连续切片4张，分别先后进行P53、CK染色，其中每种染色都分别使用不同的显色方法，如链霉菌抗生物素—碱性磷酸酶，用5—溴-4-氯—3吲哚磷酸盐／氯化硝基四氮唑蓝(BCIP／NBT)显色，呈紫黑色；而链霉菌抗生物素—过氧化物酶，则用3—氨基-9-乙基卡唑(AEC)显色，呈橙红色；最后根据着色情况，将着色深的P53(BCIP／NBT显色)定为首先显色的一抗。

1．2．2双重染色过程(1)石蜡切片脱蜡水化；(2)过氧化酶阻断溶液10min，PBS洗；(3)非免疫性动物血清10min，PBS洗；(4)一抗PCNA 60min，PBS洗；(5)生物素标记的二抗10min，PBS洗；(6)链霉菌抗生物素—碱性磷酸酶溶液10min，PBS洗；(7)BCIP／NBT，显微镜下观察10～30min，阳性显色为紫黑色,PBS洗；(8)双染增强液10min，PBS洗；(9)重复(3)；(10)一抗GFAP 60min，PBS洗；(11)重复(5)；(12)链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液10min，PBS洗；(13)新鲜配制的AEC显微镜下观察5～10min，阳性显色为橙红色；(14)自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，水性封片剂封片，显微镜观察。

免疫荧光双染 Jenny was compiled in January 2021免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。

冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。

将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。

（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。

去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

・技术交流・EMA与p53免疫组化双重染色法王永军,刘世正,王　珩,王小玲,吴国祥　(河北医科大学第四医院病理科,石家庄　050011)[关键词]　E M A;　p53;　免疫组化;　双重染色[中图分类号]　R44618　[文献标识码]　B　[文章编号]1007-8096(2005)03-0232-01 免疫组化双重染色法是在同一切片上显示两种不同抗原成分的免疫组化方法。

为了在同一张切片上显示胃癌中E M A和p53,用以观察它们之间的相互关系,我们经实验成功地在同一张切片上完成了胃癌E M A和p53这两种抗原的双向表达,为研究同一细胞内它们之间的相互关系提供了可靠方法。

1　材料与方法111　材料　胃癌标本56例(包括肿瘤及胃上下两残端)取自河北医科大学第四医院病理科2003年存档蜡块,并抽取HE 切片进行复诊。

试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

112　方法　石蜡切片4～5μm厚,脱蜡至水。

3%H2O2室温孵育10min,消除内源性过氧化物酶,蒸馏水洗、P BS洗3×5 min。

5%～10%正常山羊血清封闭10min,倾去勿洗,滴加一抗E M A(1∶100)孵育1h,P BS洗3×5min;滴加二抗,室温孵育10min,PS B洗3×5min;滴加三抗,室温孵育10min,P BS洗3×5min。

DAB显色,镜下控制阳性细胞呈棕色为止,充分蒸馏水洗,0105%Hcl(pH210)洗脱,室温孵育30min,充分水洗, P BS洗3×5min。

枸橼酸盐缓冲液热修复20min,自然冷却后P BS洗3×5min,进行第二种染色。

再次滴加正常山羊血清封闭10min,倾去勿洗,滴加p53(1∶100)孵育1h,P BS洗3×5min。

重复5至6次,AEC显色,镜下控制阳性细胞呈红色为止,充分水洗;苏木精复染核,滴加甘油明胶封固。

2　结果胃腺癌细胞E M A(+),胞质呈棕褐色颗粒。

免疫组化双重染色方法和步骤：在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。

此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。

目前，最常用的是最后一种方法。

不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。

但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。

在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。

即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。

该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。

试剂配制：1、3％过氧化氢甲醇：30％H2O210ml＋纯甲醇90ml→充分混匀。

2、0.3％过氧化氢甲醇：30％H2O21ml＋纯甲醇99ml→充分混匀。

3、免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：NaCl8.5g＋磷酸氢二钠（无水）2.8g＋磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。

然后测pH值使之在7.2—7.6。

如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。

4、0.3％TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）：TritonX－100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。