hat培养基筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备的杂交瘤技术XXX,YYY,ZZZ(版权所有，仅限个人)一、实验目的：1.掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法。

2.能运用杂交瘤技术来制备自己的单克隆抗体。

二、实验原理：（一）动物免疫动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。

脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。

当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。

动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。

（二）细胞融合B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。

如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。

脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官,取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞,自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。

其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。

（三）杂交瘤细胞的筛选在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。

细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。

内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase,HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断DNA合成的内源性途径。

抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。

抗原抗体间的结合力涉及静电引力、范德华力、氢键和疏水作用力，其中疏水作用力最强，它是在水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。

亲和性（affinity）：是指抗体分子上一个抗原结合点与一个相应抗原表位（AD）之间的结合强度，取决于两者空间结构的互补程度。

亲合力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，它与亲和性、抗体的结合价、抗原的有效AD数目有关。

抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性。

带现象（zone phenomenon）：一种抗原-抗体反应的现象。

在凝集反应或沉淀反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉眼可见的反应现象。

抗体过量称为前带，抗原过量称为后带。

免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。

免疫佐剂（immuno adjustvant）：简称佐剂，是指某些预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。

半抗原（hapten）：又称不完全抗原，是指仅具有与抗体结合的能力(抗原性)，而单独不能诱导抗体产生（无免疫原性）的物质。

当半抗原与蛋白质载体结合后即可成为完全抗原。

载体（carrier）：结合后能给予半抗原以免疫原性的物质。

载体效应：初次免疫与再次免疫时，只有使半抗原结合在同一载体上，才能使机体产生对半抗原的免疫应答，该现象称为~。

单克隆抗体（McAB）：将单个B细胞分离出来，加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生的针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，即~。

多克隆抗体（PcAb）：天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对不同抗原表位的免疫球蛋白，即~基因工程抗体（GEAb）：是利用DNA重组及蛋白工程技术，从基因水平对编码抗体的基因进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。

第2课时动物细胞工程1.将基因型为Aa与基因型为Bb的动物体细胞混合,用灭活的仙台病毒处理后,不可能．．．获得的细胞的基因型是( )。

A.AAaaB.AaBbC.AabbD.BBbb2.与植物原生质体融合相比,动物细胞融合特有的诱导因素是( )。

A.聚乙二醇B.灭活的病毒C.振动D.电激3.下面对动物细胞融合技术及意义叙述不合理．．．的是( )。

A.可以用动物细胞融合技术生产淋巴因子B.动物细胞融合打破了生殖隔离获得了新物种C.动物细胞融合为制备单克隆抗体开辟了新途径D.细胞融合过程与生物膜的流动性直接相关4.关于单克隆抗体的说法,正确的是( )。

①是免疫的淋巴细胞②单克隆抗体制备过程中至少需要两次筛选③由于B淋巴细胞能产生抗体,骨髓瘤细胞不能产生抗体,所以它们融合后产生的抗体叫单克隆抗体,不叫多克隆抗体④是单一的抗原进入动物体内后,从动物体内提取抗体⑤其化学性质单一,特异性强,灵敏度高,可用于诊断、治疗等A.②⑤B.②④C.③⑤D.①③④5.要想获得大量的单克隆抗体就必须用单个的B淋巴细胞进行无性繁殖,形成细胞群。

其原因是( )。

A.在体外培养条件下,B淋巴细胞可以无限增殖B.在动物体内B淋巴细胞可产生多达百万种以上的抗体C.每一个B淋巴细胞都参与特异性免疫反应D.每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体6.某同学在学习“细胞工程”时,列表比较了动植物细胞工程的有关内容,你认为错误．．的是( )。

选项比较内容植物细胞工程动物细胞工程A特殊处理酶解法去除细胞壁用胰蛋白酶处理后制成细胞悬液B融合方法物理方法、化学方法、生物方法物理方法、化学方法C典型应用人工种子、种间杂种植物单克隆抗体的制备D培养基区别蔗糖是离体组织赖以生长的成分动物血清不可缺少7.某实验室做了如图所示的实验研究,下列与实验相关的叙述正确的是( )。

A.过程①诱导基因使成纤维母细胞发生基因突变B.过程②属于动物细胞培养过程中的原代培养C.丙细胞既能持续分裂又能分泌单一的抗体D.过程③④所用的培养基都含有聚乙二醇8.生产单克隆抗体时,要在培养基中加入一定的试剂筛选出杂交瘤细胞,下列可作为这种试剂的是( )。

hat选择培养基筛选杂交瘤细胞的原理下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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一、实验目的本实验旨在通过细胞融合技术，获得具有无限增殖能力和特异性抗体分泌能力的杂交瘤细胞。

通过筛选和克隆化，最终获得纯化的单克隆抗体。

二、实验原理杂交瘤细胞筛选技术是利用细胞融合技术，将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的淋巴细胞融合，形成杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限增殖的特性，同时保留淋巴细胞分泌特异性抗体的能力。

通过筛选和克隆化，获得纯化的单克隆抗体。

三、实验材料1. 试剂：聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、抗原、酶联免疫吸附剂（ELISA）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠lgG抗体、包被液、脱脂奶粉、洗涤液、底物显色液、终止液等。

2. 仪器：倒置显微镜、细胞培养箱、超净工作台、冰箱、酶标仪、微量移液器、恒温箱、96孔板等。

3. 实验动物：小鼠。

四、实验步骤1. 细胞融合：将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞按照一定比例混合，加入PEG诱导细胞融合。

2. 细胞培养：将融合后的细胞接种于含有HAT培养基的培养瓶中，在细胞培养箱中培养。

3. 细胞筛选：经过1-2周的培养，筛选出能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。

4. 特异性抗体筛选：采用ELISA方法，将抗原固相在微孔板上，将杂交瘤细胞培养上清加入微孔板中，检测抗体与抗原的结合情况。

5. 克隆化：将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，确保获得纯化的单克隆抗体。

6. 阳性杂交瘤细胞筛选：利用间接ELISA方法，检测克隆化后的杂交瘤细胞是否产生特异性抗体。

五、实验结果1. 细胞融合：成功将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞融合。

2. 细胞培养：在HAT培养基中，杂交瘤细胞能够存活并无限增殖。

3. 细胞筛选：经过筛选，获得能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。

4. 特异性抗体筛选：ELISA结果显示，部分杂交瘤细胞能够产生特异性抗体。

5. 克隆化：对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得纯化的单克隆抗体。

6. 阳性杂交瘤细胞筛选：间接ELISA结果显示，克隆化后的杂交瘤细胞均能产生特异性抗体。

一、实验目的1. 学习并掌握单克隆抗体制备方法。

2. 掌握单克隆抗体纯化技术。

3. 了解单克隆抗体的应用。

二、实验原理单克隆抗体（Monoclonal Antibody，MAb）是由单一B细胞克隆产生的高度特异性的抗体。

它具有特异性强、亲和力高、纯度高、稳定性好等特点，在医学、生物技术等领域具有广泛的应用。

本实验通过动物免疫、细胞融合、筛选、克隆化等步骤，制备出针对特定抗原的单克隆抗体。

三、实验材料1. 动物：小鼠（Balb/c系）2. 抗原：待检抗原3. 细胞株：小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）4. 培养基：RPMI-1640培养基、完全培养基、半量培养基5. 试剂：FCS、聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、HAT筛选培养基、抗体纯化试剂盒等6. 仪器：离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪等四、实验方法1. 动物免疫：取小鼠，按抗原免疫程序进行免疫，免疫间隔时间为2周，共免疫3次。

2. 细胞融合：将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入聚乙二醇（PEG）进行细胞融合。

3. 细胞筛选：将融合后的细胞进行HAT培养基培养，筛选出杂交瘤细胞。

4. 克隆化：将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养，获得单克隆细胞。

5. 抗体检测：通过ELISA方法检测单克隆细胞的抗体活性，筛选出阳性克隆。

6. 单克隆抗体纯化：采用抗体纯化试剂盒对阳性克隆进行纯化。

五、实验结果1. 免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成功，得到杂交瘤细胞。

2. 在HAT培养基中筛选出杂交瘤细胞，克隆化培养得到单克隆细胞。

3. 通过ELISA方法检测，筛选出针对待检抗原的阳性克隆。

4. 单克隆抗体纯化成功，纯度达到90%以上。

六、实验讨论1. 本实验成功制备了针对待检抗原的单克隆抗体，为后续的抗体应用奠定了基础。

2. 在细胞融合过程中，采用适当比例的脾细胞与骨髓瘤细胞可以提高融合率。

3. 在筛选杂交瘤细胞时，HAT培养基的浓度和培养时间对筛选效果有较大影响。

什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。

它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。

克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。

这一技术的基础是细胞融合技术。

骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。

如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。

杂交瘤技术原理及步骤：杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。

这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。

被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。

在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。

其原理从下列3个主要步骤阐明。

(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。

脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。

融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。

·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。

多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。

使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。

...HAT 培养基筛选杂交瘤细胞的原理HAT 培养基是指含有次黄嘌呤〔hypoxantin〕、氨基蝶呤〔 aminopterin〕和胸腺嘧啶脱氧核苷〔 thymidin 〕三种物质的细胞培养基。

1.细胞内合成 DNA 原料的核苷酸形成的途径〔1〕起始合成途径〔 de novo pathway〕：由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA 分子的合成提供原料。

在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程。

〔2〕中间合成途径〔 salvage pa-thway〕：利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶〔HGPRT〕和胸腺嘧啶核苷激酶〔TK 〕催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸。

2.利用 HAT 培养基筛选杂交瘤细胞〔1〕经融合后细胞将以多种形式出现：融合的脾细胞—瘤细胞、融合的脾细胞—脾细胞、融合的瘤细胞—瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。

正常的脾细胞在培养基中存活仅 5～7 天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。

而未融合的瘤细胞那么需进展特别的筛选去除。

〔2〕融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的中间合成途径缺失株〔例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株〕，即只有起始合成途径。

效应 B 细胞虽不增殖，但有两条 DNA 合成途径。

〔3〕氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻碍起始合成途径。

HAT 培养基中含有氨基蝶呤时，细胞只有中间合成途径，所以必须供应核苷酸。

杂交瘤细胞的起始合成途径被氨基喋呤阻断，但可通过中间合成途径利用以培养基中次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷为原料进展合成。

而缺失中间合成途径的瘤细胞，失去增殖能力。

从而选择出杂交瘤细胞。

...。

单克隆抗体中hat选择原理理论说明1. 引言1.1 概述引言部分旨在介绍本篇长文的主题和研究背景，提供一个整体的概述。

单克隆抗体作为一种重要的生物医学工具，在药物研发、临床诊断和治疗等领域发挥着重要的作用。

本篇长文将重点探讨单克隆抗体中HAT选择原理，即使用辅助因子Hypoxanthine, Aminopterin和Thymidine (HAT)来筛选并培养产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

1.2 文章结构本文内容将按如下结构展开：- 引言：对文章主题进行简述和概括，并介绍各章节的内容安排。

- 单克隆抗体：对单克隆抗体的基本概念进行介绍，包括其定义、制备原理等，并探讨其在各个应用领域中的重要作用。

- HAT选择原理：详细阐述HAT（Hypoxanthine, Aminopterin和Thymidine）选择法的原理和步骤，并探讨其在单克隆抗体制备中的优势与限制。

- 单克隆抗体中HAT选择原理的理论说明：针对HAT选择法在单克隆抗体制备过程中的关键原理进行解释，包括三个方面的原理解释。

- 结论与展望：总结本文的研究内容并给出未来研究方向和存在问题的展望。

1.3 目的本篇长文旨在深入探讨单克隆抗体中HAT选择原理，并通过对其背后的理论进行详细说明，为读者对该方法有一个全面深入的了解。

通过文章内容的介绍和分析，读者将能更好地理解HAT选择原理在单克隆抗体制备中所起到的作用，并具备一定的指导意义。

希望本文能够促进相关领域研究人员对单克隆抗体制备技术的应用和改进。

2. 单克隆抗体:2.1 基本概念:单克隆抗体是指由同一种细胞克隆产生的具有相同特异性和亲和力的抗体分子。

与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的单一特异性、较低的杂交瘤形成率和较高的存储稳定性。

单克隆抗体可以通过混合各种细胞提供优良的质量控制，并被广泛应用于医学诊断、治疗和科学研究领域。

2.2 抗体选择原理:在制备单克隆抗体时，常常需要从多克隆源中筛选出能够特异性结合目标抗原的细胞。

成都石室中学高2025届2024-2025学年度上期十月考试生物试卷试题分第Ⅰ卷（选择题）和第Ⅱ卷（非选择题）两部分，满分100分，考试时间75分钟。

第Ⅰ卷（选择题，共48分）一、选择题（本卷共16题，每题3分，共计48分。

每小题只有一个选项符合题意）1．生物大分子是构成细胞生命大厦的基本框架，研究组成生物体的成分对揭示生命现象具有十分重要的意义。

下列关于生物大分子的叙述，正确的是（）A．多糖结构具有多样性取决于构成多糖的单体种类的多样性B．蛋白质、糖类和脂肪是能源物质，糖类是主要的能源物质C．真核细胞的DNA分布在细胞核内，RNA分布在细胞质内D．在生物体内可以发生水解反应的化合物均属于生物大分子2．研究表明多种核仁蛋白会参与rRNA的编辑、端粒DNA序列的修复、调节细胞周期等生命活动。

核仁蛋白NPM1可在核质之间穿梭，与中心粒结合后可抑制中心粒的复制。

NPM1与抑癌基因P53结合后会增强P53的转录。

下列叙述错误的是（）A．某些核仁蛋白参与核糖体的形成B．NPM1可能通过核孔进出细胞核C．NPM1增多可抑制动物细胞分裂D．NPM1基因突变后可抑制细胞癌变3．牙菌斑是由多种细菌分泌物组成的膜状物，这层膜帮助细菌附着在牙釉质，牙齿被其覆盖后会导致龋齿，其主要成分含有下图箭头所示的化学键。

下列相关叙述正确的是（）A．细菌大小形态各异，但其遗传物质都分布在染色体上B．细菌能发生吸水涨破，因此勤漱口可以有效预防龋齿C．牙菌斑的形成需要核糖体、内质网等细胞器的共同参与D．由于牙菌斑的存在，附着在牙釉质上的细菌难以清除4．线粒体是半自主复制的细胞器，由核基因编码的转运体蛋白AAC位于线粒体膜上，AAC只能等比例转运ADP和A TP，其功能如图所示。

AAC可以交替暴露ADP和A TP的结合位点，该过程借助线粒体内膜的膜电位驱动。

米酵菌酸可与A TP竞争AAC上的A TP结合位点，从而阻止A TP运出线粒体。