肠杆菌科检验(食品微生物学检验)

食品安全国家标准《食品微生物学检验肠杆菌科检验》（征求意见稿）编制说明一、标准起草的基本情况:（一）任务来源受国家卫生与计划生育委员会食品安全标准与监测评估司（原卫生部食品安全综合协调与卫生监督局）委托，根据《食品安全国家标准管理办法》、《食品安全国家标准制（修）订项目管理规定》，按照食品安全国家标准审评委员会的工作安排，对本标准进行制定。

（二）简要起草过程2011年7月，卫生部食品安全综合协调与卫生监督局下达《食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验》标准制定任务，项目编号为spaq-2011-61。

随即成立标准制定专家组，确立标准制定的基本原则，比较与研究我国及国际标准相关内容，并结合方法的研究工作，形成《食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验》标准的征求意见稿。

（三）起草单位、协作单位、主要起草人参与本标准的起草单位有辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、山东出入境检验检疫局、浙江出入境检验检疫局及河南出入境检验检疫局。

（四）主要起草人本标准主要起草人为：刘淑艳、卢行安、蒋丹、赵守成、王刚、姜英辉、程洁、苗丽、吕佳、柳媛、宋慧君、马惠蕊。

起草人员负责标准制定工作的组织、协调，相关资料的查阅、收集，标准文本及编制说明的起草、撰写，通过电子邮件、传真等方式，征集、整理和归纳相关的意见和建议。

二、标准的重要内容及主要修改情况本标准研究对比了国际标准ISO 21528-1：2004 食品和动物饲料微生物学肠杆菌科检测和计数方法第1部分：带前增菌的MPN法和ISO 21528-2：2004食品和动物饲料微生物学肠杆菌科检测和计数方法第2部分：菌落计数法；并依据伯杰细菌鉴定手册第八版，肠杆菌科的分类，选择肠杆菌科12个属及其它对照菌株，共25株进行了本标准方法的检验，确定了肠杆菌科检验的MPN法及菌落计数法。

本标准与ISO 21528：2004相比主要修改如下：——培养温度37℃±1℃修改为36℃±1℃；——增加了革兰氏染色确证试验；——修改了葡萄糖琼脂发酵试验阳性结果描述；——增加了平板计数法的计算公式。

实验三：肠杆菌科的检验一、接种细菌：MAC培养基接种大肠埃希菌和变形杆菌，SS培养基接种福氏志贺菌和乙型副伤寒沙门菌，采用分区划线法，放在35℃温箱中培养18—24h。

二、观察肠道杆菌在MAC和SS平板上的菌落形态。

1、SS平板：1）福氏志贺菌形成无色、半透明、光滑、湿润、突起、直径为1—2mm大小的菌落；2）乙型副伤寒沙门菌为中心带黑褐色，其余部分为半透明、光滑、湿润、突起的小菌落2、MAC平板：1）大肠埃希菌形成红色、圆形、凸起、边缘整齐、多数为光滑型的菌落。

中等大小。

2）变形杆菌为圆形、扁平、无色、半透明的菌落。

三、涂片、革兰染色将玻片分为四个区域，并分别标记，将四种肠道杆菌分别在四个区域内的生理盐水中研磨，待其自然干燥后固定，采用“改良快速法”进行染色，结果如图所示：福氏志贺菌乙型副伤寒沙门菌变形杆菌大肠埃希菌G-杆菌G-直杆菌，较细长G- 杆菌G-直短杆状显微镜检查特征为革兰阴性杆菌，肠杆菌科多数细菌的形态及染色性相似，根据形态及染色性难以相互鉴别。

四、生化试验：1、氧化酶试验（纸片法）：在滤纸条上滴一滴氧化酶试剂，用无菌接种环挑取待测菌落在滤纸条上滴了试剂的部位研磨，；滤纸变为红色则为阳性，不变色为阴性，结果表明，以上四种肠道杆菌的氧化酶试验均为阴性。

2、接种KIA、MIU上。

五、2、微量生化：六、沙门菌、志贺菌的血清学鉴定：1、在洁净载玻片上两端分别滴加一滴志贺菌四种多价血清和福氏四价血清，各取一环志贺菌在两种血清上研磨10S，观察两组结果均出现肉眼可见的凝集物，提示该菌为福氏志贺菌。

2、采用同上方法，在洁净玻片上分别在其两端滴加一滴沙门菌多价O（A—F）和Hd血清，各取一环待测菌与之混合，研磨10S，几分钟后观察两组结果，出现肉眼可见的颗粒状凝聚物表示该菌为乙型副伤寒沙门菌。

七、讨论：1、做生化试验时，有些细菌为致病菌，故实验时要保护好自己，且实验废弃物要妥善处理，以免发生有害菌的感染。

肠杆菌科及检验● 考点概述概念；命名与分类原则；共同特点；自然与人体内的分布；微生物学检查方法；临床意义。

埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属、变形杆菌属、耶尔森菌属及其他肠杆菌科细菌。

生物学性状；微生物学检验；临床意义。

【内容讲解】一、概述（共性）肠杆菌科是由多个菌属组成，G-杆菌，生物学性状相似。

大多数肠道杆菌属于正常菌群。

当机体免疫力降低或侵入肠道外组织时成为条件致病菌而引起疾病。

部分为致病性细菌。

（一）分类肠杆菌科细菌的种类繁多。

主要根据细菌的形态、生化反应、抗原性质以及核酸相关性进行分类。

根据《伯杰系统细菌学手册》（1984年）将肠杆菌科的细菌分为20个属即埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属、爱德华菌属、普罗威登斯菌属、变形杆菌属、摩根菌属、耶尔森菌属等。

（二）生物学特性1.形态与染色G-，杆菌，大小为（1.0～6.0）μm×（0.3～1.0）μm。

多数有周鞭毛（除志贺菌属、克雷伯菌属、鼠疫耶尔森菌和EIEC），无芽胞，少数菌属细菌可形成荚膜。

2.培养需氧或兼性厌氧；营养要求不高；普皿和麦康凯培养基：中等大小、表面光滑的菌落；液体培养基：混浊生长。

3.生化反应发酵葡萄糖产酸、或产酸产气；乳糖发酵试验：非致病菌 +，致病菌 -（除外变形杆菌）。

触酶阳性；氧化酶阴性；硝酸盐还原为亚硝酸盐。

4.抗原构造表面抗原（如Vi抗原、K抗原）：包绕在O抗原外的不耐热的多糖抗原，可阻断O抗原与相应抗体之间的反应，加热处理能破坏其阻断作用。

5.变异菌落S～R变异鞭毛H～O变异耐药性变异生化反应性质的改变6.抵抗力不强。

加热60℃，30分钟即被杀死。

不耐干燥，对一般化学消毒剂敏感。

对低温有耐受力，能耐胆盐。

7.肠杆菌科的初步分类（三）致病性1.致病性肠道杆菌：以肠内感染为主，腹泻为共显症状，引起急慢性肠道感染、食物中毒、旅游者腹泻及肠热症等。

2.条件致病菌：为医院感染主要病原菌，出现移位感染。

一、实验目的1. 掌握肠道条件致病菌与肠道致病菌的菌落特点。

2. 掌握肠道杆菌的主要生化反应。

3. 掌握肠道杆菌的分离鉴定方法。

4. 掌握粪便标本细菌学检测流程。

二、实验原理肠道杆菌科细菌为革兰氏阴性菌，大多数有鞭毛，能运动。

少数无鞭毛不能运动，不产生芽孢，需氧或兼性厌氧，在普通培养基上，一般都生长良好，均能发酵葡萄糖产酸或产气，触酶试验阳性，氧化酶试验阴性，还原硝酸盐。

这类细菌是人类和动物肠道中的细菌，有的引起腹泻、肠炎、肠热症和痢疾等。

有的为条件致病菌，有时也可引起身体各个部位的感染。

三、实验材料与仪器材料：1. 粪便标本2. CB培养基3. SS培养基4. 基础培养基5. 双糖铁发酵培养管6. 鉴别培养基7. 血清学反应试剂8. 药敏试剂仪器：1. 高压灭菌锅2. 试管3. 锥形瓶4. 接种环5. 酒精灯6. 无菌玻片7. 显微镜、载玻片8. 镊子四、实验步骤1. 粪便标本的处理- 将粪便标本用无菌生理盐水进行稀释，制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4四个浓度的悬液。

- 取各浓度悬液适量，分别接种于CB培养基、SS培养基、基础培养基和双糖铁发酵培养管。

2. 培养与观察- 将接种后的培养基放入37℃恒温培养箱中培养24小时。

- 观察并记录各培养基上的菌落特征，包括菌落大小、形状、颜色、边缘、表面等。

3. 生化反应- 取纯培养的菌落，进行糖发酵试验、氧化酶试验、触酶试验、硝酸盐还原试验等。

- 根据试验结果，初步鉴定菌种。

4. 血清学反应- 取纯培养的菌落，进行血清学反应，进一步鉴定菌种。

5. 药敏试验- 取纯培养的菌落，进行药敏试验，了解菌株的耐药性。

五、实验结果与分析1. 菌落特征- 在CB培养基上，观察到典型的肠道杆菌菌落，菌落呈圆形、光滑、湿润、乳白色。

- 在SS培养基上，观察到菌落呈红色，并有金属光泽。

- 在基础培养基上，观察到菌落呈黄色。

- 在双糖铁发酵培养管中，观察到斜面和底层均呈红色，并产生气泡。

肠杆菌实验原理
肠杆菌实验原理是通过检测肠杆菌在样品中的存在和数量来评估食品、饮水和环境的卫生状况。

该实验通常基于培养方法，首先将样品制备成悬浮液或适当稀释后，然后在含有有利于肠杆菌生长的培养基上进行孵育。

经过一段时间后，通过观察培养基上的菌落形态、颜色和数量来判断肠杆菌的存在和增殖情况。

为了进一步确认，可以采用生化试验，并使用特定培养基例如大肠杆菌MacConkey培养基来鉴定革兰阴性菌真正为肠杆菌。

生化试验可以通过检测革兰阴性菌的特定酶活性或代谢产物来确认肠杆菌的存在。

此外，还可以使用分子生物学方法例如PCR来检测肠杆菌的
特定基因或DNA序列，以更高的灵敏度和特异性确定肠杆菌
的存在。

肠杆菌实验的结果可以帮助评估样品的卫生质量，并为采取相应的控制措施提供依据，以保障公共健康和卫生安全。

肠杆菌科其他菌属的微生物学检验肠杆菌科除上述主要对人致病的菌属外，还有克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属等，为条件致病菌，在临床上感染性疾病中较常见。

1 克雷伯菌属克雷伯菌属主要包括肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌等，为条件致病菌，临床上感染性疾病中以肺炎克雷伯菌多见。

肺炎克雷伯菌包括肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种。

1.1微生物学检验：克雷伯菌检验程序可按肠杆菌科细菌进行检验。

据不同疾病采集不同标本，如血液、痰、脓汁、尿液、脑脊液、胸水和腹水等。

取痰、脓汁、尿液、脑脊液、胸水、腹水标本，离心后将沉淀物涂片做革兰染色镜检，可见革兰阴性球杆菌，有明显的荚膜。

血液标本或穿刺液标本接种于肉汤培养基增菌培养，其他标本接种于血平板和MAC平板。

35℃孵育18～24 h，取血平板上灰白色大而黏稠的菌落和 MAC上乳糖不发酵型黏液菌落，作进一步鉴定。

菌落性状、形态染色特性符合克雷伯菌的特点，氧化酶阴性、硝酸盐还原阳性，在KIA试验斜面产酸、底层产酸产气、H2S阴性，MIU试验为－－+／－，V－P试验为阳性，可初步鉴定为克雷伯菌。

然后可进一步进行生化反应鉴定到种和亚种，并结合荚膜肿胀试验进行鉴别。

1.2生物学性状：形态与染色：克雷伯菌为革兰阴性杆菌，卵圆形或球杆状，常成双排列，有菌毛；无芽胞，无鞭毛。

有明显的荚膜，荚膜肿胀试验是本属菌与其他类似菌的主要鉴别方法；培养特性：克雷伯菌兼性厌氧，营养要求不高，在血平板上形成较大凸起、灰白色、不透明、不溶血、黏液型菌落，用接种环挑起时可出现拉丝现象。

在肠道选择培养基上，可发酵乳糖产酸，形成较大的有色黏稠菌落。

在液体培养基中呈混浊型生长，可见菌膜和黏性沉淀物。

生化反应：克雷伯菌IMViC试验结果为－－++，脲酶、ONPG、丙二酸盐、黏质酸盐试验呈阳性。

1.3临床意义克雷伯菌是医院感染中常见的条件致病菌，以肺炎克雷伯菌感染较多见。

肺炎克雷伯菌可引起典型的原发性肺炎，也可引起肺外感染，如肠炎、婴儿脑膜炎、菌血症、泌尿系统感染等。