红曲霉T_DNA插入转化库中桔霉素突变子的筛选

红曲霉桔霉素的检测方法及红曲霉产桔霉素的判别方法许赣荣;李凤琴;陈蕴;李玉伟;虞慧玲【期刊名称】《微生物学通报》【年(卷),期】2004(31)3【摘要】建立了红曲霉真菌毒素桔霉素的HPLC检测方法.用谷氨酸和葡萄糖为唯一氮、碳源的培养基(MSG)液态摇瓶培养及红曲米固态培养,对30多株红曲霉产桔霉素的情况进行了普查,发现大多数红曲霉菌种可产生桔霉素.红曲霉的培养状态及条件对桔霉素的产生有重大影响.红曲霉菌种是否产桔霉素,可根据MSG培养基摇瓶发酵液中是否含有桔霉素来初步定性判断,为准确判断红曲霉菌是否产桔霉素,可采用多种培养法综合判断.【总页数】5页(P16-20)【作者】许赣荣;李凤琴;陈蕴;李玉伟;虞慧玲【作者单位】江南大学教育部工业生物技术重点实验室,无锡,214036;中国疾病预防控制中心食品与营养研究所,北京,100021;江南大学教育部工业生物技术重点实验室,无锡,214036;中国疾病预防控制中心食品与营养研究所,北京,100021;江南大学教育部工业生物技术重点实验室,无锡,214036【正文语种】中文【中图分类】TQ925【相关文献】1.红曲发酵过程中桔霉素和黄曲霉毒素的检测方法及控制对策刍议 [J], 孙强;马祖兵;李小芳;吴纯洁;罗佳2.红曲霉产色素和桔霉素影响因素的研究进展 [J], 黄娟;姚若一;黄邵培;刘思芬;邓颖;王伟平3.不同液态发酵基质对红曲霉产红曲色素及桔霉素的影响 [J], 吴宏;代文婷;连喜军;郭安民;吴洪斌4.红曲霉菌株CS-5筛选及不产桔霉素机理研究 [J], 杨华;刘丹;马博雅;王旭锋;李贞景;陈勉华;王昌禄5.红曲霉发酵液中桔霉素快速检测方法的优化 [J], 班昭;王昌禄;陈勉华;王玉荣;郑传宝;刘春静;杨华;李风娟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

红曲霉桔霉素的检测和控制方法研究进展李培睿，张晓伟，曹依曼（许昌学院食品与药学院，河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室，许昌 461000）摘要：红曲霉（Monascus）在我国已有一千年多的应用历史，其代谢产物红曲色素具有安全性高、着色力强、营养丰富的特点。

但由于同时产生的桔霉素对人体健康所造成危害毒性的问题，使红曲产品的应用得到了限制。

本文就红曲霉次生代谢产物桔霉素的检测和控制方法展开综述，比较了一些国家红曲相关产品中桔霉素的限量标准；介绍了国内外常用的桔霉素的检测方法及其特点；并对控制桔霉素的传统方法和生物方法进行了综述，以期为桔霉素的相关研究提供参考，促进红曲产业的更好发展。

关键词：红曲霉；桔霉素；检测方法；控制方法中图分类号：TS207.7/TS202.1 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2021）03-0100-06 doi：10.19804/j.issn1006-2513.2021.03.017Progress on detection and control of Monascus citrininLI Pei-rui，ZHANG Xiao-wei，CAO Yi-man（Key Laboratory of Biomarker Based Rapid-detection Technology for Food Safety of Henan Province，College of Food and Pharmacy，Xuchang University，Xuchang 461000）Abstract：Monascus has been used for more than a thousand years in China. Its metabolite Monascus pigment is a safe，strong food colorant and also rich in nutrition. However，due to toxicity caused by citrinin，the application of red yeast products has been limited. This article reviewed detection and control methods of citrinin，compared usage limits of citrinin in Monascus products in some countries，and discussed commonly detection methods and characteristics of citrinin at home and abroad. The review provides references for citrinin research and promotes development of red yeast industry.Key words：Monascus；citrinin；detection method；control method桔霉素（Citrinin）是红曲霉发酵产生的一种次级代谢产物，是一种具有潜在危害的真菌毒素［1-2］。

红曲色素和桔霉素代谢调控方法的研究进展黄颖颖;陈慎;杨成龙;陆东和【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2018(043)002【摘要】在食品安全问题日益受到关注的今天,取代人工合成色素的天然色素具有广阔的市场前景.红曲色素是国际范围内生产量及使用量最大的天然食用色素之一,广泛应用于肉制品加工和水产品加工领域的着色.福建红曲以品质优、色价高的特点,在国内外享有极高声誉,但在红曲霉代谢过程中同时会合成真菌毒素桔霉素,使红曲色素在使用中存在安全隐患.我国红曲色素产品中桔霉素含量普遍偏高,制约了我国红曲产品的出口和使用领域的拓展.红曲色素和桔霉素合成呈伴生现象,常出现提高红曲色素产量的同时,桔霉素含量也相应提高的情况,因此调控红曲霉代谢过程中促进红曲色素的产生同时抑制桔霉素的产生成为解决这一矛盾的关键.文章介绍了国内外红曲色素和桔霉素的代谢调控方法的研究概况,主要包括菌种选育、发酵工艺优化及基因工程等来达到调控目的,通过掌握红曲菌代谢调控网络,研究红曲菌产桔霉素的代谢途径及途径中的代谢机制,进而综合分析调控红曲霉合成代谢桔霉素存在的问题并提出应对措施,对推动红曲产品的出口和红曲产业的健康发展具有重要意义.【总页数】7页(P188-194)【作者】黄颖颖;陈慎;杨成龙;陆东和【作者单位】福建省农业科学院农业工程技术研究所,福州350003;福建省农产品发酵加工工程技术研究中心,福州 350003;福建省农业科学院农业工程技术研究所,福州350003;福建省农产品发酵加工工程技术研究中心,福州 350003;福建省农业科学院农业工程技术研究所,福州350003;福建省农产品发酵加工工程技术研究中心,福州 350003;福建省农业科学院农业工程技术研究所,福州350003;福建省农产品发酵加工工程技术研究中心,福州 350003【正文语种】中文【中图分类】TS201.57【相关文献】1.铵盐对紫色红曲霉合成代谢红曲色素及桔霉素的影响 [J], 岳建明;杨强;肖潇;尹胜;张婵;王成涛;胡济美;赵吉兴2.红曲色素发酵生产过程桔霉素控制技术研究进展 [J], 石侃;夏枫耿;吴振强3.高产红曲色素低产桔霉素紫色红曲霉转化子筛选与代谢产物分析 [J], 许楚旋;任浩;章婷;冯青青;吴巧玉;蒋冬花4.氯化铵对紫色红曲霉固态发酵红曲色素和桔霉素合成的双向调控作用 [J], 周文斌;黄梓芮;洪家丽;李路;郭伟灵;蒋雅君;刘斌;倪莉;饶平凡;陈劲星;吕旭聪5.无桔霉素红曲色素突变株FM5183对单谷氨酸钠(MSG)、组氨酸的代谢特性 [J], 吴祖芳;翁佩芳;张礼星;Philippe J BLANC因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

红曲中橘霉素问题的研究进展
盖栋梁;刘爱英;梁宗琦
【期刊名称】《山地农业生物学报》
【年(卷),期】2005(24)6
【摘要】对目前国内外关于红曲Monascus spp.中橘霉素问题的研究进展进行总结,并分别针对橘霉素的理化性质、生物合成途径、定性定量检测方法、橘霉素和红曲的毒性以及降低橘霉素的措施进行了详细论述.
【总页数】6页(P549-554)
【作者】盖栋梁;刘爱英;梁宗琦
【作者单位】贵州大学,真菌资源研究所,贵州,贵阳,550025;贵州大学,真菌资源研究所,贵州,贵阳,550025;贵州大学,真菌资源研究所,贵州,贵阳,550025
【正文语种】中文
【中图分类】TS207.4;TQ925.7
【相关文献】
1.不同红曲菌中红曲色素与橘霉素的比较分析 [J], 刘姣;周有祥;徐琪;李利;杨洁;彭立军
2.橙色红曲菌及其pksCT基因缺失株液态发酵产橘霉素及色素的变化 [J], 张淑云;黄志兵;许杨;李燕萍
3.氨基酸对红曲霉突变菌株合成代谢黄色素和橘霉素的影响 [J], 田园;鲁华敏;周波;钟海雁
4.红曲中桔霉素的检测控制及无桔霉素红曲产业化 [J], 唐僖;宋航
5.液相色谱—串联质谱法(LC-MS/MS)测定固态红曲米(粉)中橘青霉素 [J], 吉小凤;周育;徐俊锋;汪小福;齐沛沛;李锐;陈笑芸
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食品添加剂红曲红中桔霉素检测方法的研究3柴秋儿,田亚琼,钟其顶,李惠宜(中国食品发酵工业研究院,北京,100027)摘　要　食品添加剂红曲红中桔霉素限量问题已成为近年来国内外研究热点。

目前,国内缺乏专门针对红曲红色素中桔霉素检测的标准方法。

文中在综合分析国内外相关桔霉素检测方法技术资料的基础上,通过试验,对粉状样品预处理条件进行了优化,研究了适合我国生产的红曲红色素中桔霉素检测方法。

粉状红曲红样品先用体积分数50%乙醇配制成一定浓度的试样液,试样液在优化的树脂分离条件下进行洗脱,然后采用高效液相色谱法测定洗脱液中的桔霉素含量。

实验结果显示:优化的树脂分离条件能较好地洗脱样品中的桔霉素;配有荧光检测器的高效液相色谱仪能较灵敏地检出桔霉素含量,方法检测限为012μg/L ,基质加标平均回收率为10515%,相对标准偏差(RSD )为212%。

关键词　红曲红色素,桔霉素,预处理,高效液相色谱　第一作者:硕士,工程师(李惠宜高级工程师为通讯作者)。

3国家科技支撑计划课题(2006BA K02A05)　收稿日期:2008-09-10,改回日期:2008-10-13 红曲红是红曲霉在生长代谢过程中产生的红色物质,为酮类衍生物[1]。

我国红曲红常规生产方式有2种,1种是以红曲米为原料,经萃取、浓缩、精制而得到;另1种是以大米、大豆等为主要原料的液体培养基,经红曲霉(M onascus anka N akaz aw a et sato )菌液体发酵培养、提取、浓缩、精制而成[2]。

市售产品以液体深层发酵方法为主。

红曲红作为一种安全性高的天然色素广泛用于各类食品中。

日本是红曲红色素生产和使用较多的国家,在肉制品发达的欧美等国也有使用红曲类产品替代部分其他着色剂的需求。

1995年,法国人Blanc 博士证实红曲霉菌产生真菌毒素———桔霉素(Cit rinin )[3],至此,红曲红的食用安全性受到挑战。

桔霉素是一种真菌毒素,具有肾毒性,毒性比较明显,可引起实验动物的肾脏肿大、尿量增多,肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状[4]。

第31卷第2期2012年 4月华 中 农 业 大 学 学 报J o u r n a l o fH u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y V o l .31 N o .2A pr .2012,133~138收稿日期:2011-03-31基金项目:国家自然科学基金项目(30971551)裴 荣,硕士研究生.研究方向:植物发育生物学.E -m a i l :p e i r o n g@w e b m a i l .h z a u .e d u .c n 通讯作者:姚家玲,博士,教授.研究方向:植物生殖发育生物学.E -m a i l :y a o j l m y@m a i l .h z a u .e d u .c n 批量筛选水稻T -DNA 插入突变体库获得生殖发育相关突变体裴 荣1 陆展华2 姚家玲11.华中农业大学生命科学技术学院,武汉430070;2.华中农业大学园艺林学学院,武汉430070摘要 针对花器官形态和种子发育突变表型对大型水稻T -D N A 插入突变体库进行筛选,获得了大量突变体信息及材料,在9760个突变体家系中筛选得到177个花器官形态和数量异常的突变家系,突变频率为1.81%;对9760个家系中的3432个家系筛选得到179个种子发育缺陷的突变家系,突变频率为5.22%㊂对所获得的270个突变家系进行了T -D N A 插入的阳性检测,阳性率为64.8%㊂利用公共数据库R M D (R i c eM u t a n tD a t a b a s e ,R M D )给定的侧翼序列,鉴定了其中1个结实率较低的突变体家系,表明其突变表型和T -D N A 插入共分离,为深入研究该基因的功能提供了重要的遗传材料㊂关键词 水稻;T -D N A 插入突变;突变表型;生殖发育;共分离中图分类号 S511.502.4;Q78 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2012)02-0133-06水稻(O r yz a s a t i v a )不仅是全世界最重要的粮食作物,而且还具有基因组较小且与其他禾本科植物存在广泛的共线性㊁遗传转化体系完善等优点,因此,它已成为研究单子叶植物遗传发育的模式植物[1]㊂2005年国际水稻基因组计划(I R G S P )完成了水稻全基因组测序,提供了该物种全部的核苷酸序列[2]㊂如何揭示这些基因的生物学功能以及它们有序的时空表达机制,已经成为水稻功能基因组时代的重要课题㊂植物功能基因组研究策略主要有2种:一是正向遗传学(f o r w a r d g e n e t i c s )方法,即从突变表型出发克隆发生突变的基因,再确定该基因功能;二是反向遗传学(r e v e r s e g e n e t i c s )策略,通过对特定基因序列的分析,在突变体库中搜寻其相应的突变体,然后分析突变体表型,进行相关功能研究[3]㊂采用理化诱变和D N A 插入突变(i n s e r t i o n a l m u t a ge n e s i s )等方法,创造大量突变体用于基因的功能分析是通过正反向遗传学策略研究植物功能基因组的重要手段㊂由于农杆菌T -D N A 整合到植物基因组中的位置是随机的[4],并且整合到植物基因组中的T -D N A 能稳定遗传,这样随机插入到植物基因组中的已知T -D N A 序列能为后续的基因功能研究提供一个 标签 ,使得人们可以采用反向P C R [5]㊁T A I L -P C R [6]㊁质粒拯救[7]和接头P C R [8]等方法分离T -D N A 插入位点的侧翼序列,然后利用侧翼序列来检索基因组数据库便可找到相应的突变基因㊂因此,T -D N A 插入突变是目前大规模获得水稻突变体的主要方法,华中农业大学国家植物基因研究中心(武汉)采用该方法成功构建了超过129000株T -D N A 插入的增强子诱捕系,并公布了分离得到的13804条侧翼序列[9]㊂本研究利用该突变体库,以花器官形态变异㊁结实率明显降低这2种生殖发育相关表型为筛选目标,通过T -D N A 插入的P C R 阳性检测,获得T -D N A 插入与突变表型初步共分离的突变体家系,为进一步克隆水稻花器官形态发育及种子发育相关基因奠定基础㊂1 材料与方法1.1 材 料供试材料为华中农业大学国家植物基因研究中心(武汉)构建的水稻T -D N A 插入突变体库,是以粳稻品种中花11(O r y z aS a t i v a L .s s p .j a po n i c a c v .z h o n gh u a 11)为受体,经农杆菌介导T -D N A 插入所产生的转化群体㊂所有材料2009年夏天(长日条件,日照时间为12~14h 左右)种植在华中农业大学试验田,每个突变体家系种植20个单株,分2华中农业大学学报第31卷行栽插㊂本试验所观察的水稻T-D N A插入家系共9760个㊂1.2突变体表型观察与记载突变表型判断标准:对于花器官形态,重点考察护颖㊁颖壳㊁雌雄蕊的数量与野生型花器官的差异;种子发育缺陷表型是在水稻种子发育的蜡熟期考察结实率(以低于50%左右为突变标准)㊂具体观察㊁筛选方法是将插秧时排布的家系号对应的大田编号制成表格,7月至9月在田间对每个家系㊁单株逐个观察,记录各个家系的突变单株㊁突变表型和植株数㊂1.3DNA抽提和PCR检测1)D N A提取㊂D N A样采用C T A B制备法[10]㊂2)T-D N A阳性检测㊂以突变家系有表型的单株总D N A为模板,根据T-D N A序列已知目的基因G A L4/V P16设计P C R阳性检测引物G A L/V P-R 和G A L/V P-F,进行P C R扩增,确定有突变表型的单株是否有T-D N A插入,初步确定突变家系的表型与T-D N A的插入是否共分离㊂3)基因型检测㊂在水稻突变体数据库R M D (R i c eM u t a n tD a t a b a s e,h t t p://r m d.n c p g r.c n/)中查询突变家系的侧翼序列,在候选基因的基因组中跨T-D N A插入位点设计上游引物F和下游引物R,在T-D N A序列中设计边界引物N T L B5,分别以F和R㊁R和N T L B5配对,对突变家系内所有单株进行P C R扩增,确定基因型㊂本实验中所用引物序列见表1㊂表1所用引物序列T a b l e1P r i m e r s u s e d i n t h e e x p e r i m e n t名称N a m e序列S e q u e n c eG A L/V P-R5ᶄ-A G A C C G G C A A C A G G A T T C A A T C-3ᶄG A L/V P-F5ᶄ-T T C G T C C A G G A C A A C G T G A A C A-3ᶄF5ᶄ-C T G A A G A C C G A C G A C C G A T G A-3ᶄR5ᶄ-T C A A G T A A A G A C C A A C G A C G C C-3ᶄN T L B55ᶄ-A A T C C A G A T C C C C C G A A T T A-3ᶄ P C R反应体系:D N A模板1μL;10ˑb u f f e r 2.0μL;d N T P0.4μL;上下游引物各0.4μL;T a q 酶0.2μL;加d d H2O至20μL㊂P C R扩增反应程序为:94ħ3m i n;94ħ45s;58ħ45s;72ħ1.5 m i n;35个循环;72ħ10m i n;12ħ5m i n;4ħ保存㊂扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳(120V㊁45m i n)检测㊂2结果与分析2.1水稻T-DNA插入突变体植株PCR阳性检测在田间观察水稻T-D N A插入突变体库时,发现有突变表型的家系存在2种情况:一种是家系内所有单株全部为同一种突变表型,即表现为标签系内的拟纯合突变,这种情况通常被认为是在组培过程中体细胞变异造成的;另一种则是家系内部分单株表现为突变表型,存在突变植株和正常植株的分离㊂在后续研究中我们主要关注第2种情况㊂因为T-D N A引发的插入突变,在理论上后代会出现表型分离,对于单拷贝T-D N A插入的突变体,在其后代株系中,如果群体足够大,表型正常的植株和具有突变表型的植株数应符合3ʒ1(孟德尔遗传定律)的分离模式㊂根据这一原则,在所观察的9760个家系中筛选到270个具有花器官形态异常㊁种子发育缺陷的突变体家系,随后利用插入片段T-D N A序列设计引物,对这些家系进行T-D N A阳性检测㊂采用构建该突变体库转化载体特有的基因(G A L4/V P16)设计引物G A L/V P-R和G A L/V P-F,特异扩增片段的大小约为467b p(图1)㊂扩增结果显示270个有突变表型的家系中阳性家系为175个,T-D N A插入阳性率为64.8%㊂表明这175个家系的突变表型与T-D N A标签初步共分离,而其他非阳性家系M:2k bD N Al a d d e r;1~23:突变体家系M u t a n t l i n e s;WT:阴性对照N e g a t i v e c o n t r o l.图1突变体家系T-D N A阳性检测F i g.1T h eP C R p o s i t i v ea s s a y o f p l a n t s o fm u t a n t l i n e s431第2期裴荣等:批量筛选水稻T-D N A插入突变体库获得生殖发育相关突变体的突变表型则不是由T-D N A插入造成的㊂2.2花器官形态异常的突变体筛选通过对水稻T-D N A插入的9760个家系进行田间观察,发现有177个家系具有花器官形态和数量变异的表型,并且符合3ʒ1的遗传分离模式,突变比例为1.81%㊂田间拍摄的花器官突变表型如图2,将突变的小花放在体视显微镜下观察和拍摄,更清楚地显示突变体花器官的异常形态(图3):野生型水稻的小花由1对护颖㊁1枚外稃㊁1枚内稃(图3-A)㊁2枚浆片㊁6枚雄蕊(图3-H)和1枚雌蕊(含1个心皮和2个柱头)组成(图3-J)㊂筛选到的花器官异常表型有:多颖壳(图2-A,图3-B㊁C)㊁护颖较长(图2-B,图3-D)㊁内稃退化(图2-C,图3-F)㊁顶端小花退化(图2-D,图3-G)㊁芒较长(图2-E,图3-E)㊁小花颖壳畸形(图2-F)㊁多雄蕊(图3-I)以及多雌蕊(图3-K)等㊂2.3种子发育缺陷突变体筛选水稻种子发育的蜡熟期,在田间以目测结实率低于50%左右为突变标准,对水稻T-D N A插入突变体库9760个家系中的3432个家系进行结实率筛选,结果发现其中179个突变体家系有结实率下降的显著表型,且符合孟德尔遗传分离模式,突变比例为5.22%㊂将结实率降低的突变家系编号与花器官异常突变家系编号对应起来分析,发现其中78个结实率下降的突变家系也有花器官形态异常的表型,表明这些家系结实率降低可能与其花器官形态和发育异常有关㊂2.4种子发育缺陷突变体的鉴定对其中1个结实率降低且初步共分离的家系(命名为r s s1)进行进一步分析㊂2009年夏天该家系的20个单株中,5个单株几乎不结实;2010年夏天种植该突变体48株,发现其结实率低的表型能稳定传递,而且突变体植株和野生型植株在营养生长阶段形态上没有明显差异(图4)㊂通过在R M D中查找,获得了该突变家系T-D N A插入片段的侧翼序列㊂为了检测突变表型与T-D N A插入是否共分离,在T-D N A插入位置设A.多颖壳M u l t i-g l u m e;B.护颖较长L o n g s t e r i l e l e mm a;C.内稃退化B r a c t d e g r a d a t i o n;D.顶端小花退化T o p f l o r a l d e g r a d a t i o n;E.芒较长L o n g a w n;F.小花颖壳畸形F l o r a l g l u m em a l f o r m a t i o n.图2突变体颖花田间表型F i g.2M u t a n t g l u m e p h e n o t y p eo b s e r v e d i n t h e f i e l d531华中农业大学学报第31卷A :野生型小花外形W i l d -t y p e (b a r =2mm );B -G :突变体小花外部形态O u t s i d e p h e n o t y p e o f t h em u t a n t (b a r =2mm );H :野生型小花雄蕊S t a m e no fw i l d -t y p e (b a r =1mm );I :多雄蕊P o l y a n d r y (b a r =1mm );J :野生型小花雌蕊P i s t i l o fw i l d -t y p e (b a r =0.1mm );K :多柱头P o l ya n d r o u s (b a r =0.2mm ).图3 野生型和突变体小花表型F i g .3 F l o r a l p h e n o t y p eo f t h ew i l d -t y pea n d t h em u t a nt 图4 野生型和r s s 1突变表型比较F i g .4 P h e n o t y p ec o m pa r i s o nb e t w e e nW T a n d t h e r s s 1m u t a n t pl a n t s 计引物,引物F ㊁R 是来源于基因组的上下游引物,N T L B 5是来源于T -D N A 标签的边界引物㊂野生型植株(WT )由于没有T -D N A 标签序列的插入,所以引物R 和N T L B 5组合不能扩增出P C R 产物,利用基因组引物F 和R 组合则可以扩增得到预期大小的产物;在杂合子突变体植株(H )中,利用引物F 和R 以及R 和N T L B 5组合都可以得到预期大小的P C R 扩增片段;在纯合突变体植株(M )中,由于T -D N A 标签的插入导致F 与R 配对的扩增产物太大(约大于10k b )而无法得到正常大小的基因组片段,故只有R 和N T L B 5配对可以扩增出目的片段(图5)㊂ F :特异基因组正向引物F o r w a r d g e n e -s p e c i f i c p r i m e r ;R :特异基因组反向引物R e v e r s e g e n e -s p e c i f i c p r i m e r ;N T L B 5:T -D N A 边界引物T -D N Ab o r d e r p r i m e r ;WT :野生型W i l d -t y p e ;H :杂合子H e m i z y g o u s ;M :纯合子H o m o z y g o u sf o rT -D N A i n s e r t i o n ;T -D N A 插入侧翼的引物F 和R 可扩增得到杂合子或野生型的等位基因产物;用R 和N T L B 5扩增到的P C R 阳性植株表明T -D N A 在该位点插入;R 和N T L B 5扩增阳性,而F 和R 扩增为阴性,表示该植株为纯合子插入㊂P r i m e r sFa n dRf l a n k t h eT -D N Ai n s e r t i o na n da m p l i f y a p r o d u c tf r o m h e m i z y g o u so r w i l d -t y p e a l l e l e .P C R -p o s i t i v e p l a n t sw i t hRa n dN T L B 5i n d i c a t e T -D N Ai n s e r t i o ni nt h ee x a m i n e ds i t e .P r e s e n c eo fa p r o d u c t w i t hRa n dN T L B 5a n dn o tw i t hFa n dRi n d i c a t e s a p l a n th o -m o z y go u s f o r t h e i n s e r t i o n .图5 三引物法 检测突变体家系分离后代植株的基因型F i g .5 T h r e e p r i m e r s p r i n c i p l e f o r t e s t i n gt h em u t a t i o n g e n o t y pe 631第2期裴 荣等:批量筛选水稻T -D N A 插入突变体库获得生殖发育相关突变体 通过这种 三引物法 对该突变家系子代的48个单株进行了基因型检测,结果表明:T -D N A 插入的纯合植株有8株(图6),杂合植株38株,野生型植株2株;表型观察结果显示,纯合植株的结实率明显降低,杂合子植株该表型较弱或无此表型,分离出来的野生型(阴性对照)则没有表型㊂因此,该家系结实率显著降低的突变表型与该基因被T -D N A 插入共分离,即突变表型是由T -D N A 插入到该基因所造成的㊂1~20代表突变家系的后代S e g r e g a n t so fm u t a n t l i n e s ;WT :野生型W i l d -t y p e ;H :杂合H e m i z y g o u s ;M :纯合H o m o z y g o u s f o r T -D N Ai n s e r t i o n ;Z 11:对照C o n t r o l .图6 r s s 1突变家系后代共分离检测结果F i g .6 P C R g e n o t y p i n g r s s 1s e g r e ga n t s 3 讨 论T -D N A 插入突变体以及所分离到的侧翼序列已在水稻功能基因组研究中发挥了重要作用㊂许多研究者利用华中农业大学国家植物基因研究中心构建的大型水稻T -D N A 插入突变体库,分离克隆了一些重要基因㊂W u 等[11]研究和鉴定了一个调控水稻开花时间㊁影响其生长周期的重要基因R I D 1;L i 等[12]克隆和分析了增加水稻茎秆机械强度㊁与木质素合成相关的基因F C 1;Y u a n 等[13]分离和鉴定了影响水稻花粉减数分裂的基因P A I R 3;S u n 等[14]从该突变体库中得到了编码组蛋白去甲基化酶的基因J M J 706,以表观修饰的方式调控水稻生殖发育㊂随着该突变体库(R M D )更多表型观察数据提交和侧翼序列的分离,将会提供大量的突变体信息和材料供水稻基因组研究所用㊂本试验通过对水稻T -D N A 插入突变体库9760个家系的批量筛选,获得了水稻花器官形态异常和种子发育缺陷的突变体材料270多份,而且这些有目标性状突变表型的家系的T -D N A 插入阳性率达到64.8%㊂对其中1份种子发育缺陷突变体家系的进一步共分离检测,显示被插入的1个水稻未知基因参与调控种子发育㊂通过这种从突变表型筛选入手的正向遗传学策略,结合侧翼序列分离和进一步共分离检测,有望克隆和鉴定一批控制水稻花器官形态发育和种子形成过程的重要基因,不仅有助于增加人们对水稻生殖发育的认识,也可为水稻的遗传改良提供基因资源㊂虽然T -D N A 插入突变体在对目标基因进行快速定位并确定其功能的研究中具有明显优势[15],但是T -D N A 插入突变体库的利用也有一些局限性㊂农杆菌介导的T -D N A 转化通常需要较长的组织培养过程,易造成体细胞变异而非插入突变[16]㊂此外,T -D N A 插入的多拷贝㊁侧翼序列分离等问题也会影响突变体材料的利用㊂T -D N A 的插入有时还会导致靶位点基因组序列的重排,故在突变体的筛选鉴定过程中必须要进行突变表型和T -D N A 的共分离检测,以确定突变表型是否真正是由于T -D N A的插入所造成的[17]㊂参考文献[1] I Z AWAT ,S H I MAMO T OK.B e c o m i n g am o d e l p l a n t :t h e i m -po r t a n c e o f r i c e t o p l a n t s c i e n c e [J ].T r e n d sP l a n tS c i ,1996,1:95-99.[2] I n t e r n a t i o n a lR i c eG e n o m eS e q u e n c i n g P r o j e c t .T h em a p -b a s e d s e qu e n c e o f t h e r i c e g e n o m e [J ].N a t u r e ,2005,436:793-800.[3] K R Y S A N PJ ,Y O U N GJC ,S U S S MA N M R.T -D N Aa sa ni n s e r t i o n a lm u t a g e ni n A r a b i d 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f i c a t i o n731华中农业大学学报第31卷o fD N As e q u e n c e s f l a n k i n g T-D N A i n s e r t i o n s b y P C R-w a l k i n g [J].P l a n tM o l e c u l a rB i o l o g y R e p o r t e r,2001,19:321-327.[9] Z H A N GJ,G U OD,C H A N GY,e t a l.N o n-r a n d o md i s t r i b u t i o no fT-D N Ai n s e r t i o n s a t v a r i o u s l e v e l s o f t h e g e n o m eh i e r a r c h ya sr e v e a l e db y a n a l y z i n g13804T-D N A f l a n k i n g s e q u e nc e sf r o m a ne n h a n c e r-t r a p m u t a n t l i b r a r y[J].P l a n tJ,2007,49:947-959.[10]S A G H A I-MA R O O F M A,S O L I MA N K M,J O R G E N S E N RA,e t a l.R i b o s o m a lD N As p a c e r-l e n g t h p o l y m o r p h i s m s i nb a r-l e y:m e n d e l i a ni n h e r i t a n c e,c h r o m o s o m a l l o c a t i o n,a n d p o p u l a-t i o nd y n a m i c s[J].P r o c N a t lA c a dS c iU S A,1984,81:8014-8018.[11]WU C,Y O U C,L IC,e t a l.R I D1,e n c o d i n g aC y s2/H i s2-t y p ez i n c f i n g e rt r a n s c r i 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红曲红色素中桔青霉素检测方法的优化研究
彭碧宁;余创波;曾川;冯强;刘勇;潘亮
【期刊名称】《中国食品添加剂》
【年(卷),期】2022(33)8
【摘要】为保障进出口食品添加剂的安全,提升食品添加剂红曲红色素中有害物质桔青霉素的筛查效率,本文通过比较不同前处理方法对红曲红色素中桔青霉素含量测定的影响,对高效液相色谱法检测红曲红色素中桔青霉素的方法进行优化并建立质谱法进行确证。

用80%的甲醇-水溶液作为提取剂,经HLB固相萃取小柱净化,用高效液相色谱仪配荧光检测器测定桔青霉素的含量。

本方法检出限为3μg/kg,在浓度10~500μg/mL范围内标准曲线线性关系良好(r=0.9998);在10~100μg/kg添加水平下,回收率为83.6%~94.7%,相对标准偏差为2.85%~3.42%。

并应用此方法对市面销售红曲红色素样品进行分析,该方法检测时间短、检测成本低、定量准确且可操作性强,适用于红曲红色素及其制品中桔青霉素的定性定量检测。

【总页数】8页(P208-215)
【作者】彭碧宁;余创波;曾川;冯强;刘勇;潘亮
【作者单位】拱北海关技术中心;珠海锦田天然色素有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】TS207.3
【相关文献】
1.红曲中桔霉素的检测控制及无桔霉素红曲产业化
2.培养条件对红曲霉产红曲红色素及桔霉素影响的研究
3.红曲霉桔霉素的检测方法及红曲霉产桔霉素的判别方法
4.以合成桔霉素的关键基因为靶标的PCR检测方法与UPLC法检测红曲中桔霉素含量的一致性分析
5.红曲霉发酵液中桔霉素快速检测方法的优化
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大曲红曲霉的分离鉴定及其产桔霉素能力的初步研究罗惠波;刘宏媛;叶光斌;李光辉【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2012(031)003【摘要】采用传统微生物分离手段从浓香型大曲内分离出一株产橘色色素的红曲霉菌株M.通过18S rDNA的PCR扩增及测序分析,结果表明该菌属于红曲霉属.利用高效液相色谱技术检测该红曲霉在不同培养基、是否添加EDTA等条件下桔霉素产量的变化.结果表明该菌在酵母浸膏蔗糖(YES)培养基中桔霉素的产量远高于谷氨酸葡萄糖(MSG)培养基和麦芽汁培养基,达到81.412mmg/L;不同发酵时间内的桔霉素产量呈现先升高后降低的变化趋势,且添加微量的EDTA (4×10-5g/L)就能显著影响桔霉素的产生.【总页数】4页(P156-159)【作者】罗惠波;刘宏媛;叶光斌;李光辉【作者单位】四川理工学院生物工程学院,四川自贡643000;酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡643000;天津津酒集团有限公司,天津300130;四川理工学院生物工程学院,四川自贡643000;酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡643000;四川理工学院生物工程学院,四川自贡643000【正文语种】中文【中图分类】TQ925.7【相关文献】1.产抗真菌蛋白（AFP）巨大曲霉的分离鉴定及AFP的提纯 [J], 元月;王德良;郭立芸;林智平;江伟2.关于红曲霉产桔霉素规律的初步探讨 [J], 赖卫华;许杨;李燕萍;熊勇华3.浓香型大曲中黑曲霉的分离鉴定及其安全性初步研究 [J], 叶光斌;罗惠波;杨晓东;李丹宇;王毅;王彩虹4.中高温大曲中黄曲霉的分离鉴定及其安全性初步研究 [J], 罗惠波;杨晓东;李丹宇;叶光斌;王毅5.小麦粉污染霉菌的分离鉴定及产黄曲霉毒素能力的研究 [J], 李慧;胡梦龙;蔡军;傅洋;石嵩;刘冬雪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。