分子生物学实验优秀课件

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分子生物学实验技术ppt课件

质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法：基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化（ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的噬菌体展示库。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离蛋白质分析蛋白质相互作用的研究方法：酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物，使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构建

分子生物学导论--分子生物学实验技术 ppt课件

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而 CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
1. 将1 g叶片用液氮速冻后，迅速研磨成白色粉末，置入1.5 ml 离心管中； 2. 加入600 ul 预热的cTAB提取液65℃水浴提取1 hr，其中每10 min颠倒混
匀1次； 3. 取出离心管，冰浴冷却5 min 后，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），轻
1、根据带的深浅（明暗），估计含量
2、根据杂带的多少，判断纯度
3、根据和对比带（marker）比较, 大概知道片段的大小
Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):
has high resolving capability, and can resolve DNA/RNA that differ from each other as little as a single base pair/nucleotide.
4. 因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(OligodT)NA也可用于Northern blot试验。
提取植物RNA时，要注意的问题：
1）一般用机械研磨的方法破碎植物组织细胞；
2）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白与RNA分离并释放出RNA；
2.2 植物总RNA的提取与电泳
由于RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子，如 mRNA,它携带了DNA的全部编码信息。 RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northern验。
Agarose (琼脂糖):
(1) a much less resolving
4 kb 3 kb
power than
2 kb
polyacrylamide,
1 kb
(2) but can separate DNA

医学分子生物学实验课件

理论上 61 gaatctggta gaagtgagtt ttggatagta aaataagttt cgaactctgg cacctttcaa
121 ttttgtcgca ctctccttgtt tttgacaatg caatcatat gcttctgcta tgttaagcgt
目的基因片段长度：330bp 181 attcaacagc gatgattaca gtccagctgt gcaagagaat attcccgctc tccggagaag
分子生物学实验
一、人类基因组DNA提取二、PCR技术三、RFLP技术
1
实验流程图
采集血液样本
提取基因组DNA
基因位点的PCR扩增
琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物
PCR产物酶切
琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物
DNA凝胶成像系统判读基因型
统计分析各等位基因频率
2
一、人类基因组DNA提取材料：生物组织、培养细胞、血液样品常规提取基因组DNA主要步骤： 1.破碎细胞：（1）物理方法：超声波、匀浆、液氮研磨法等（易导至DNA链的断裂）（2）化学等温和方法（获得大分子量DNA）
10
引物：能与模板DNA两条链上的各一段序列互补的寡核苷酸（15～20bp）
SRY基因引物：
上游引物：5′GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG3′ 下游引物：5′CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTC 3' 扩增DNA片段长度：330bp
11
SRY基因部分序列
1 gttgaggggg tgttgagggc ggagaaatgc aagtttcatt acaaaagtta acgtaacaaa
1OD260单链DNA或RNA≈40μg/ml 样品纯度判定：OD260/ OD280 ≈ 1.8～2.0 DNA或RNA较纯

分子生物学实验 ppt课件

分子生物学实验下
ppt课件
1
实验流程一
ppt课件
2
实验安排
准备材料：重组工程菌目标蛋白的表达第1次菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装离子交换柱第2次测酶活、定蛋白、离子交换层析第3次亲和柱层析，并对收集样品进行测活、定蛋白等第4次对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析第5次 Western blotting，绘出分离纯化表 ppt 绘制包涵体复性曲线课件
ppt课件 23
B瓶 1N NaCl 100ml
A瓶 0N NaCl 100ml
ppt课件
24
操作要点
1)在梯度洗脱仪中的洗脱瓶A（混合器）和洗脱瓶B（贮存器）
内各装入100毫升缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ（注意加溶液的方法），
注意液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内的气泡 2) 开动梯度洗脱仪中的电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜 3) 将洗脱瓶A、洗脱瓶B与层析柱上端连接管道打开，同时将
O
对硝基苯酚磷酸酯 p-NPP
O O
-
-
Na+ Na+
碱性磷酸酶
O
- P
OH 对硝基苯酚
p-NP
NO2
NO2
以对硝基酚磷酸二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对硝基酚量测定酶活力。在37℃、pH10.0条件下，每分钟转化产生1μ mol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位
ppt课件 6
每10秒记一个数（0、10、20、……120）将时间及其对应的A405导入EXCEL文档中，做时间t—A405曲线，得到斜率，
ppt课件 20
层析操作一般过程
装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、合并样品上样前后样品活性测定---当天测定上样前后蛋白浓度测定---最后一天测定

分子生物学PPT课件

RNA、微小RNA、时序RNA）翻译的自我调节翻译后水平的调控
谢谢大家！
高级结构的形成（折叠、亚基缔合、辅基连接）
靶向输送（翻译－运转同步机制，Cotranslation ；翻译后转运，Post-translation ）
原
核
生
物概述基
因表
原核基因调节特点
达
调
控
基因表达（Gene expression）基因表达调控的基本原理基因表达的调控方式
其与DNA的结合
转座引起插入突变造成插入位点靶DNA的少量碱基
对重复插入位点出现新基因引起染色体畸变转座引起的生物进化切除效应外显子改组
转座机制与细菌的转座子类似（玉米的Ac-Ds元件、果蝇的P元件）
转作机制类似逆转录病毒（果蝇的Copia元件）
RNA
RNA合成的特点
核mRNA的拼接体的拼接
类型ⅰ 自我拼接
类型ⅱ自我拼接
剪接、3’末端CCA结构、碱基修饰内含子切除（核酸酶的作用，不是
转酯反应）连接外显子
蛋白参与蛋白质生物合成的物质质的蛋白质生物合成过程生物蛋白质合成的干扰与抑制合成蛋白质的降解
mRNA tRNA 核蛋白体酶供能物质、无机离子
遗传密码密码子密码子的特点 ORF
通用性；连续性；方向性；简并性；摆动性；专一性。
二级结构
三级结构种类
起始tRNA 延长tRNA
识别位点
同工tRNA
◆ 氨基校酸正接tR受N位A点
◆ 氨酰—tRNA合成酶识别位点 ◆ 核糖体识别位点 ◆ 反密码子
功能类型
对氨基酸有极高的专一性对tRNA具有极高专一性校对作用（水解位点）

常见分子生物学实验方法 ppt课件

反转录合成cDNA
在冰上加入：
组成
体积
溶液A（随机引物RP）
1ul
溶液B（dNTPs)
1ul
溶液D(5*RT buffer)
4ul
溶液E（含逆转录酶、RNA酶抑制剂）1ul
1-5ug Total RNA
6ul
溶液G
7ul
1、混匀，42℃，60min;
2、95 ℃，5min，终止反应。
PCR扩增
取1支0.2ml的PCR管，在冰上加入：
如 EcoRI 识别序列:
5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’
限制性内切酶的特点 1. 高度特异性 2. 商业化生产 3. 反应需要Mg2+ 4. 不同的内切酶可能产生相同的末端
影响核酸限制性内切酶活性的因素
❖（1）DNA 纯度 ❖ （2）DNA甲基化的程度 ❖ （3）酶切消化反应温度 ❖ （4）DNA的分子结构 ❖ （5）限制性内切酶的缓冲液
影响连接效率的因素
A ATP 浓度 B 连接酶浓度 C 反应时间 D insert和vector的比值（载体DNA和外源DNA的分子数比（浓度比）为1：3～1：10） E 连接温度其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。
重组载体的转化
感受态细胞 (Competent cells): 经过 CaCl溶液处理的E. coli
❖ 选择载体 ❖ 获得目的基因 ❖ 目的基因与载体的重组 ❖ 重组载体的转化 ❖ 重组子的筛选与鉴定
重组质粒构建的简单流程
基因组DNA,PCR产物, cDNA (插入子)
质粒DNA (载体)
限制性酶切 (修饰 DNA 末端)
连接载体与插入片段
转化 (将重组质粒导入宿主细胞)

分子生物学实验课PPT曾令江XXX1116

分子生物学实验课PPT曾令江 XXX1116
五、分子生物学实验课—课程准备
1、清洗培养皿、三角瓶等，包装灭菌。清洗研钵并烘干备用。（5班）
2、分装10ul（白色）、200ul（黄色）、1000ul（蓝色）枪头并高压灭菌（ 2班）
3、分装200ul、10mlEP管并高压灭菌。（2班）
4、配置100mlCTAB抽提液：配方见黑板。（5班）
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四、分子生物学实验课—课程考核
1、本课程为考查科目。总成绩为100分，由考勤、实验过程表现（个人）、小组平时成绩（各实验环节结果）、实验报告四部分组成，分别占总成绩的20﹪、 20﹪、 20﹪、 40﹪。
2、实验报告的写作按照毕业论文的格式，包括：标题、中文摘要、英文摘要、文献综述、材料与方法、结果与分析、实验总结（体会）等，每个实验小组提交一份实验报告。
分子生物学实验课PPT-曾令江-XXXX1116
2020/11/10
分子生物学实验课PPT曾令江 XXX1116
内容提要
1
分子生物学实验----课程介绍
2
分子生物学实验----课程内容
3
分子生物学实验----课程要求
4
分子生物学实验----课程考核
5
分子生物学实验----课程准备
分子生物学实验课PPT曾令江 XXX1116
分子生物学实验课PPT曾令江 XXX1116
二、分子生物学实验—课程内容
实验一、DNA的提取及检测实验二、PCR扩增目的基因及检测实验三、目的基因片段的回收、连接实验四、大肠杆菌DH5感受态细胞的制备实验五、连接产物的转化、筛选及PCR检测实验六、质粒DNA的抽提、酶切（生工专业选作）实验七、RNA的抽提与检测（生科专业选作）

《分子生物学全套》ppt课件

分子生物学定义
分子生物学是一门从子水平研究生物大分子的结构和功能的科学，主要关注DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的复制、转录、翻译和调控等过程。
分子生物学特点
以分子为研究对象，阐明生命现象的本质；与多学科交叉融合，推动生命科学的发展；实验技术手段不断更新，提高研究效率和准确性。
分子生物学发展历程
分子生物学研究内容及方法
研究内容
包括基因和基因组的结构与功能、DNA损伤与修复、基因表达的调控、蛋白质组学的研究以及疾病产生的分子基础等。
研究方法
包括基因克隆与表达、蛋白质分离与纯化、PCR技术、基因敲除与敲入、高通量测序技术、生物信息学分析等。这些方法的应用使得分子生物学研究更加深入和广泛。
阔前景。
下一代测序技术在分子生物学中应用
下一代测序技术原理
基于大规模并行测序的原理，一次可对数百万至数十亿个DNA分子进行测序。
测序数据分析
包括序列比对、变异检测、基因表达量分析等，以揭示基因组的结构和功能。
下一代测序技术的应用
在疾病诊断、个性化医疗、物种鉴定和进化生物学等领域发挥重要作用。
非编码RNA与疾病关系
非编码RNA异常表达与多种疾病相关，如肿瘤、心血管疾病等，可作为疾病诊断和治疗的新靶点。
非编码RNA研究前景
随着高通量测序技术和生物信息学发展，非编码RNA研究将更加深入，为疾病防治提供新思路和新方法。
合成生物学在分子生物学中应用前景
合成生物学概念及研究范畴
合成生物学是一门新兴交叉学科，旨在通过设计和构造新的生物部件、系统和机器来理解和操控自然生物系统。
RNA产物。
影响因素
包括DNA模板的序列和结构、RNA聚合酶的活性和选择性、转录因子

分子生物学全套课件(2024)

2024/1/26
17
蛋白质在细胞中的作用
蛋白质可以作为酶催化生物体内的化学反应，维持生命活动的正常进行。
蛋白质可以作为载体运输物质，如血红蛋白运输氧气和二氧化碳。
蛋白质可以作为抗体参与免疫反应，保护机体免受病原体的侵害。
蛋白质是细胞结构和功能的基础，参与细胞的各种生命活动，如催化、运输、免疫、调节等。
2024/1/26
21
基因表达调控的分子机制
DNA结合蛋白的作用
识别并结合特定DNA序列，影响基因转录。
染色质结构与基因表达
染色质结构的变化可影响基因的可及性和转录活性。
2024/1/26
信号转导与基因表达调控
细胞外信号通过信号转导途径影响基因表达。
转录后调控机制
包括mRNA剪接、转运、定位和降解等过程对基因表达的调控。
比较基因组学分析
通过比较不同物种或不同个体之间的基因组差异，揭示物种进化、基因功能等生物学问题。
生物信息学在基因组学中的应用
利用生物信息学方法对基因组数据进行挖掘和分析，发现新的基因、突变位点以及与疾病相关的遗传变异等。
27
THANK YOU
感谢观看
2024/1/26
28
2024/1/26
8
DNA的复制与修复
01
02
03
DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶段，涉及多种蛋白质和酶的参与。
2024/1/26
DNA复制的特点
半保留复制、半不连续复制等。
DNA修复的机制
直接修复、切除修复、重组修复和SOS修复等，用于纠正复制过程中产生的错误。
9
DNA的转录与表达

分子生物学课件(共51张PPT)(2024)

四级结构
由两条或两条以上的多肽链组成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
21
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等。酶：催化生物体内的化学反应。
抗体：参与免疫应答。
2024/1/29
功能蛋白
激素：调节生物体的生理活动。
蛋白质的分类还可以根据其溶解度、形状等进行划分。例如，根据溶解度可分为清蛋白、球蛋白等；根据形状可分为纤维状蛋白和球状蛋白等。
RNA的基本组成单位是核糖核苷酸，由磷酸、核糖和碱基组成。
磷酸二酯键
核糖核苷酸之间通过磷酸二酯键连接形成RNA链。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）。
2024/1/29
12
RNA的种类与结构
mRNA
信使RNA，负责携带遗传信息并指导蛋白质合
成。
翻译水平调控
通过控制翻译的起始、延伸和终止来调控基因表达。
蛋白质水平调控
通过控制蛋白质的活性、稳定性和相互作用来调控基因表达
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
2024/1/29
18
05
蛋白质的结构与功能
2024/1/29
19
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
2024/1/29
tRNA
转运RNA，负责携带氨基酸并识别mRNA上的
遗传密码。
rRNA
其他RNA
核糖体RNA，是核糖体的组成部分，参与蛋白
质合成。
13
如miRNA、snRNA等，在基因表达调控等方面

分子生物学实验课件

• 与诱导前对照比较，可知诱导效率较好，蛋白表达量较多，成功率高。
参考文献
1.马金石. 绿色荧光蛋白[ J] . 化学通报, 2009, 72( 3) : 243 250.
2. 季爱加, 宁喜斌原核表达载体 pET28a EGFP 的构建与表达微生物学杂志 2011 年7 月第31 卷第4 期
• 继续培养，分别在1、2、3h和过夜培养后各取1mL样品，作为诱导后的样品。
• 每次取1mL样品置于Eppendorf管中，冰浴待用。诱导完后，将样品 5000r/min离心5min，回收上清液进行下一步实验或者保存在-20℃冰箱中。
检测：SDS-PAGE原理
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
制备感受态细胞
制备E.coli BL21(DE3)的感受态细胞——CaCl2法
（一）受体菌培养 1.从LB平板上挑取新活化的E.coli菌落，接种于5 ml LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜。 2.以2%接种量将过夜菌培养的E.coli接种于5 ml LB培养基中，37 ℃振荡培养2-3 h，至菌浓度OD600=0.3-0.5 （二）感受态制备 1.将培养液冰浴20 min，取1.5ml菌液于无菌EP管中，4℃离心6000 rpm ，5 min. 2.重复上述操作，收集4.5ml菌液的菌体. 3.以预冷的800μLCaCl2轻悬菌体，冰上放置10min，4℃离心6000rpm，5 min.4.弃上清，加入100μL预冷CaCl2轻轻悬浮细胞，冰上放置数分钟后即为感受态细胞悬液。
• 分别取过夜培养物100μL接种于10mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃恒温培养1~2h。
• 当细菌浓度A600达到0.4~0.6时，分别取出样品1mL作为IPTG诱导前的样品，其余样品中添加100mmol/L的IPTG至终浓度为2mmol/L，其中一瓶实验组不加IPTG的对照。

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CLEC 是C type lectin（C型凝集素）家族基因
CLEC4M基因是19号染色体上C型凝集素家族中的一员，它被证明是多种传染性疾病病毒的受体，如HIV-1, SARS-Cov, HCV等。该基因的第4外显子的VNTR (Variable Number of Tandem Repeats，VNTR )在全球人类群体中存
2×PCR mix ddH2O 引物1，引物2
2×PCR mix 引物1，引物2 DNA样品 ddH2O
10μl 各0.4μl
3μl
在PCR管盖上标记号码，便于辨认
放入PCR仪，并设置程序
变性 30循环
延伸
95℃ 5min 95℃ 20s 59℃ 30s 72℃ 45s 72℃ 5min
CLEC 4M基因序列
实验原理
• 原理：用裂解液和蛋白酶K裂解口腔黏膜细胞，释放DNA，用浓盐法沉淀蛋白质，离心去除蛋白质，再用异丙醇沉淀 DNA。
• 裂解液配方： • 10mM Tris-HCl，10mM KCl, 10mM MgCl2, 2mM EDTA,
0.4M NaCl, 1%SDS.
分子生物学实验优秀课件
基因多态性
多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型(genotype) 或等位基因(allele)，亦称遗传多态性(genetic polymorphism)或基因多态性。
DNA片段长度多态性基因多态性 DNA重复序列多态性
单核苷酸多态性
CLEC4M 与SARS
体内存在一种SARS冠状病毒的受体L-SIGN，由CLEC4M基因所编码。该基因第4外显子存在3-9个69bp的重复片段，人群中超过50%的人以7个重复为主，常见的基因型为7/7，5/5，7/5 等不同的纯合或杂合状态，这个重复区编码位于胞外受体的颈部。研究表明，纯合型如7/7或 5/5的个体较杂合型7/5的个体较少感染SARS病毒。
PCR过程大概100分钟
PCR仪器界面和参数
紫外透射分析
点样
将PCR扩增产物加入琼脂糖凝胶孔内，点样量10μl
DNA片段长度多态性(FLP)：
即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化，又称限制性片段长度多态性。
DNA重复序列的多态性(RSP) ：
主要表现于重复序列拷贝数的变异，如小卫星DNA 和微卫星DNA。
单核苷酸多态性(SNP) ：
即散在的单个碱基的不同，基因组中单核苷酸的缺失,插入与重复序列不属於SNP，但更多的是单个碱基的置换。