转录组测序技术在绵山羊育种中的应用研究进展路婉茹;徐红伟;臧荣鑫;陈兴丽【摘要】转录组测序技术已广泛应用于生命科学的各个领域.羊作为被最早驯化的家养动物之一,在人类日常生活中有着不可取代的作用.文章主要从绵山羊肉品质、毛绒生长、泌乳等方面应用转录组测序进行了阐述,为今后绵山羊的分子育种工作提供参考.【期刊名称】《西北民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(038)003【总页数】5页(P48-52)【关键词】绵山羊;转录组测序;差异表达基因【作者】路婉茹;徐红伟;臧荣鑫;陈兴丽【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;西北民族大学实验中心,甘肃兰州 730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030【正文语种】中文【中图分类】S826我国地域广阔，地势复杂，气候多样，因此造就了许多极具地方特色、形态多样、产品丰富的绵、山羊品种和类群[1]．根据《中国畜禽遗传资源志——羊志》记载，我国绵、山羊遗传资源品种共140个，其中绵羊地方品种42个、培育品种21个、引入品种8个；山羊地方品种58个、培育品种8个，引入品种3个．在我国，绵山羊养殖在畜牧产业中具有很高的地位．羊肉的营养价值较高，具有低脂肪、低胆固醇、高蛋白等特点，而且羊肉还具有一定的药用价值[2]．除了可供人们食用之外，绒毛用羊在羊产业中占一大部分比例，其羊绒、羊毛是毛纺织加工业不可或缺的原料来源[3]．此外，羊奶的成分比例更接近母乳而更易被人吸收，是人类获取优质蛋白的天然饮品之一．转录组是特定组织或细胞在特定发育阶段或状态下转录出来的所有RNA的总和，广义上包括了mRNA、ncRNA(非编码RNA,如rRNA、tRNA、microRNA等)等，而狭义上通常指所有mRNA的总和．转录组测序的原理是先将总RNA提取出来，根据所测RNA种类进行分离纯化，经反转录成双链cDNA，然后将其随机剪切成小片段(或先将RNA片段化再反转录)，加接头后进行高通量测序分析．转录组测序技术主要应用于：转录本的研究，如检测未知转录本、稀有转录本及转录本结构变异研究等；基因转录水平研究,包括基因差异表达、不同样本间基因差异表达等；非编码区域功能研究，如microRNA等．目前，转录组测序主要依托以Roche Applied Science公司的454技术、ABI公司的SOLiD技术和Illumina公司的Illumina技术等下一代测序技术．新一代DNA测序技术的出现再次推动了生命科学的发展．相比于传统的DNA测序技术，高通量转录组测序技术为研究转录组带来新的变革．随着后基因组时代的到来，人类对生命科学的研究重心从结构基因组学便移至对功能基因组学的研究．与蛋白质组学和基因组学相比，转录组学是最早发展起来并且得到广泛应用的技术[4]．近年来，转录组测序技术已经在畜禽研究中被普遍运用[5]，尤其是大量用于对绵山羊各种性状的研究当中．与肉质品质相关的性状主要有肉色、嫩度、大理石花纹、眼肌面积以及背膘厚和肌内脂肪含量等指标[6]．早期对羊肉品质的评价主要是从理化性质方面进行研究．随着分子生物学的飞速发展，越来越多的科研工作者采用分子生物学手段以解决生命科学领域的各种问题．继Sanger测序后，新一代测序技术的出现，为现代生命科学研究带来了新的机遇．羊的年龄、性别及品种等的不同都会对羊肉品质产生影响．羊肉品质主要由遗传因素所决定．影响羊肉质的候选基因很多，主要包括影响脂肪代谢的基因过氧化物酶体激活增殖受体基因 (peroxidase proliferatorac-tivated receptors，PPARs)、脂蛋白脂酶基因(lipoprotein lipase, LPL)，影响肌内脂肪沉积的基因脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding proteins，FABPs)、肌肉生长抑制素基因(myostain，MSTN)，以及影响背膘厚的激素敏感脂肪酶基因(hormone-sensitive lipasegene，HSL)等[7-8]．通过对绒山羊背最长肌的转录组进行RNA-Seq技术测序分析，孟宪然[9]等希望找出与羊肉品质相关的候选基因．经过比对分析，共得到影响绒山羊肉品质的候选基因有263个，其中包括高表达有利基因123个，高表达有害基因140个．最后分析认为影响羊肉质的候选基因主要有ADIPOQ(脂联素)、PDK(丙酮酸脱氢酶激酶)、和CD36(脂肪酸转位酶)等基因．肌内脂肪含量是衡量肉品质的一个重要指标．增加肌内脂肪含量可使肉质嫩度增加，口感更好．影响肌内脂肪含量的因素较多，不同品种、年龄、日粮因素或同一品种的不同部位之间都存在较大差异.从分子层面分析，影响肌内脂肪含量的基因主要包括PPARγ、LPL、HSL、H-FABP等候选基因[10-12]．其中，PPARγ基因在肌内脂肪沉积过程中发挥着巨大的作用，在脂肪的分化与发育之中处于核心地位．湖羊肌肉组织中肌内脂肪含量与PPARγ基因的表达量在一定程度上呈负相关，并且出现组织差异性[13]．杜琛[14]通过RNA-Seq技术对绒山羊的肌肉组织进行转录组分析，并对脂肪细胞进行PPARγ基因沉默，发现沉默PPARγ基因的脂肪细胞内脂肪分化程度明显降低，而其他与脂肪分化相关的基因也随之出现不同程度的降低．对绒山羊的四种脂肪细胞进行比较转录组分析，两两比对分别得到差异表达基因为150、450、456、412、39和445个．通过GO分析和KEGG通路富集，发现与脂肪细胞分化有关的最为显著的信号通路是PPARγ等信号通路．其中富集到PPARγ信号通路的基因有LPL、FABP、FATP(脂肪酸转运蛋白)、AP2、RXRG 和CD36．这六个基因可作为肌内脂肪沉积的候选基因．GO即基因本体论，由基因本体联合会所建，主要从基因参与的生物学过程、细胞组成及分子功能三个方面进行分析．除了通过GO基因注释外，还可通过COG等其他数据库对基因进行分析[15]．肌肉的嫩度与动物的品种及其年龄密切相关，肌肉中肌纤维的种类以及比例都会影响到肌肉的品质．肌纤维的生长和类型与肌球蛋白轻链的比例有着密切的关系[16]．除了遗传因素的影响，环境因素对肉品质产生的影响也是不可小觑的．蒙古羊以肉品质优良而闻名遐迩，这与所处的自然环境是分不开的．蒙古羊抗寒能力较强，为此，侯成林[17]对处于寒冷条件下的蒙古羊以及杜泊羊进行转录组测序分析．结果显示，与同在寒冷条件下的杜泊羊相比，蒙古羊脂肪贮存较多，脂肪组织中蛋白质合成旺盛，而且脂肪代谢速率更快．这进一步说明，蒙古羊具有较强的抗寒能力．断尾对某些脂尾型绵羊特别是长脂尾型绵羊的脂肪沉积会产生影响.通过断尾，使原本沉积在尾部的脂肪部分转移沉积在皮下等其他脂肪组织中[18]．兰州大尾羊属长脂尾型绵羊，通过RNA-Seq技术对断尾与未断尾兰州大尾羊肝脏组织转录组进行测序分析，得到了EAAT2等与脂肪沉积有关的基因[19]．近些年，关于绵山羊等毛用动物皮肤毛囊转录组的研究已取得一定的进展．随着绵羊和山羊全基因组测定的完成，有关控制绵山羊毛绒生长的基因将会被进一步挖掘出来．毛囊的生长发育离不开多种信号通路以及相关基因的调控．调控毛囊周期性生长的信号分子主要属于Wnt信号通路、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor, FGF)家族、NOTCH信号通路、SHH信号通路、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)家族以及骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)家族等[20-21]．有些信号通路只参与了毛囊发育的部分阶段，有的则贯穿了整个发育时期，如Wnt信号通路，广泛参与了毛囊形成的各个阶段[22]，在绒山羊皮肤毛囊周期性生长、发育过程中扮演着重要的角色．为了揭示滩羊被毛卷曲的形成，康晓龙[23]运用转录组测序技术对不同月龄滩羊皮肤组织进行分析，共得到转录本30 081个，差异表达基因37个，其中高表达转录本角蛋白家族基因KRT71可能与滩羊被毛卷曲的形成有关．经过富集通路发现，一些可变剪切事件参与了Wnt、NORCH等与毛发生长相干的信号通路．毛囊生长的一个周期要经历三个阶段，即生长期、退行期和休止期．Geng[24]等对绒山羊的毛囊发育周期中的皮肤进行转录组测序，共检测出1 332个差异型表达基因．其中，生长期与衰退期的差异表达基因683个，生长期与休止期119个，衰退期与休止期119个．毛囊发育生长可能与Wnt、Shh、TGF-β和Notch信号通路有关，且这些差异表达基因在上述信号通路中伴有重要角色．初级毛囊与次级毛囊在结构上和生长时间上有所不同．为了进一步探究绒山羊毛囊独立发生的分子基础，Gao[25]等利用RNA-Seq技术对60胎龄、120胎龄及刚出生2小时绒山羊的皮肤组织进行转录组测序，发现初级毛囊的发生始于60胎龄，成熟于120胎龄，而次级毛囊的形态发生始于120胎龄直至出生．分别对各个胎龄皮肤组织转录组进行对比，得知差异表达基因主要存在于60胎龄羊与120胎龄和60胎龄与新生羊之中，而120胎龄羊与新生羊并没有明显的差异．通过分析表明，差异表达基因在上皮-间质和毛囊发生的免疫赦免、粘多糖的生物合成、细胞外基质受体相互作用等中起着主导作用．通过高通量转录组对绒山羊皮肤毛囊两个毛乳头细胞系进行测序，分析发现差异表达基因主要参与血管形成、细胞外基质受体相互作用等通路[26]．随着测序技术的日益增进，非编码RNA的作用机理成为科技人员热点研究的对象，并对其展开深入探讨．microRNA作为一类非编码小RNA，研究发现它在生物发育调控过程中具有非常重要的作用． Liu[27]等对山羊处于生长期的皮肤组织进行Solexa测序，共获得miRNAs 316个，其中68个miRNA在山羊上是保守的，经过进一步分析又得到了22个新的miRNA．通过对藏绵羊皮肤毛囊发育的三个时期进行测序，共获得244个成熟的microRNA.通过对两个不同时期得到的差异表达的miRNA进行比对，发现这些差异表达的miRNA靶向多条信号通路的基因以调控毛囊发育[28]．绵山羊非编码RNA的研究主要集中在对microRNA作用机制的研究，而对LncRNA的机理研究才刚刚起步．研究发现，LncRNA对次级毛囊的形态发生起到部分的调控作用，这为皮肤毛囊的分子作用机制提供了理论基础[29]．利用RNA-Seq技术对绵山羊的研究主要集中在对其肉品质和皮肤毛囊的研究当中，而对其他性状的研究应用也相继展开．羊奶在国际营养界被誉为“奶中之王”，其营养构成接近于人奶，更有利于人体的吸收．目前，对羊奶的研究主要集中在营养成分组成以及产品开发等方面[30-31]．为深入了解影响羊奶品质的有关因素，研究工作者借助分子生物学手段对山羊乳腺作进一步研究[32-33]．为阐明miR-103在羊产奶过程中的作用，Lin[34]等对哺乳期山羊乳腺进行高通量测序，得到高表达的miRNA共30个，并通过进一步分析，乳腺上皮细胞中miR-103的富集引起了羊奶中脂肪的堆积．AroaSuárez-Vega[35]利用转录组技术对两个不同品种的奶羊的乳体细胞进行测序，通过对这两个品种的四个不同泌乳阶段的研究发现，最高表达基因编码的蛋白质为酪蛋白和乳清蛋白，在泌乳点得到573个差异表达基因．在这两个品种之间共检测到256个差异表达基因．提高产羔数一直是绵山羊育种过程中亟欲解决的问题．一些生长因子的变化也会引起绵羊排卵的变化[36]．利用RNA-Seq技术对山羊卵巢进行研究，亦在揭示与绵羊多胎性状有关的分子机制，从而提高繁殖力[37]．作为一类长度仅为22 nt左右的非编码RNA，miRNA在山羊生殖调控等过程当中发挥的作用不可忽视[38]．为此，Zi[39]等对多产羊与非多产羊处于卵泡发育时期的卵巢进行了测序，鉴定出共表达miRNA 379个，差异表达miRNA 191个，其中120个上调，71个下调．通过分析发现，miR-21,miR-99a, miRNA-143, let-7f, miR-493 and miR-200b可能在卵泡发育过程中发挥着重要的作用．新一代测序技术的发展，无疑为生命科学的研究带来质的飞跃．绵山羊产业在我国草食畜牧业中占有重要比例，无论是对羊肉的需求量还是对于纺织业来说，都具有重要的作用．鉴于人们对其需求的不同，我国已育成多个新品种．未来的动物育种除了传统的育种方法外,还必将借助现代分子育种技术．目前，高通量测序技术日臻完善，测序费用也逐步降低，再次推进了转录组测序技术在动物育种中的应用．日益增进的分子生物学技术也为我国畜禽遗传资源的保护提供了新的技术与手段．目前，RNA-Seq技术已在单细胞层面上进行，这无疑为绵山羊某些性状的研究开启了新途径．【相关文献】[1] 谭晓山,李冰,赵永聚.我国绵、山羊育种工作现状与发展前景[J].中国畜牧杂志,2015,51(16):15-19.[2] 郑灿龙.羊肉的营养价值及其品质的影响因素[J].肉类研究,2003,(01):47-48.[3] 张莹,肖海峰.世界羊毛羊绒生产与贸易状况分析[J].中国草食动物科学,2014,(S1):427-430.[4] Lockhart D.J., WinzelerE.A.Genomics, gene expressand DNA arrays[J]. 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