下载文档原格式
多聚嘧啶区结合蛋白1促进肿瘤发展分子机制的研究进展王克朕，张慧鲲，谷峰，马勇杰天津医科大学肿瘤医院国家肿瘤临床医学研究中心天津市肿瘤防治重点实验室天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津300060摘要：多聚嘧啶区结合蛋白1（PTBP1）是一种已知的转录后基因表达调节因子，可以调控mRNA的可变剪接、翻译、稳定性和定位，具有多种与RNA代谢相关的分子功能。
PTBP1在多种恶性肿瘤中高表达，并可以通过影响肿瘤细胞的能量代谢、增殖、凋亡和转移等方式促进胶质瘤、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤的恶性进展，具有作为临床诊断标志物和治疗靶标的潜力。
关键词：多聚嘧啶区结合蛋白1；肿瘤；可变剪接；分子机制；能量代谢；增殖；凋亡；转移doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2021.17.028中图分类号：R730文献标志码：A文章编号：1002-266X（2021）17-0101-04恶性肿瘤严重危害人类健康，其发生发展与多种基因前体mRNA的可变剪接密切相关。
多聚嘧啶区结合蛋白1（PTBP1）是RNA结合蛋白（RBP）核不均一性核糖核蛋白（hnRNP）家族的成员，能够参与调控包括可变剪接在内的多种转录后修饰过程。
PTBP1参与神经细胞的生长分化、T细胞的活化、精子发生、胚胎发育、红细胞发育等多种细胞活动，在包括神经元转录、神经发生、突触成熟和分化在内的神经细胞整个发育过程中均扮演重要角色，其在正常神经发育过程中表达受到抑制，而在多种脑肿瘤细胞以及其他肿瘤细胞中高表达［1］。
PTBP1在肿瘤细胞中的功能受RBP、微小RNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）等多种分子调控，可直接或间接参与结直肠癌、肾细胞癌、乳腺癌和胶质瘤等多种肿瘤的发生发展，并在其中作为细胞能量代谢、增殖、凋亡、侵袭和转移的调节因子发挥促癌作用［2］。
现将PTBP1促进肿瘤发展的分子机制综述如下。
1PTBP1通过影响肿瘤细胞能量代谢发挥促癌作用肿瘤特异性能量代谢，即Warburg效应，是肿瘤的关键特性之一。
㊃基础研究㊃基金项目:天津市医学重点学科(专科)建设项目(TJYXZDXK⁃009A);天津医科大学肿瘤医院肿瘤转化医学种子基金(1910);天津市中医药管理局中医中西医结合科研课题(2021206㊁2023157)作者单位:300202 天津医科大学肿瘤医院重症监护科(武玉琳㊁王东浩),中西医结合科(崔亚萌);天津市中西医结合医院感染性疾病科(王翠菡);天津市河东区直沽中医医院中医内科(周钧)作者简介:武玉琳(1991-),硕士,住院医师㊂研究方向:肿瘤危重症的中西医结合诊疗㊂E⁃mail:wuyulin718@ 通信作者:王东浩(1970-),本科,主任医师㊂研究方向:肿瘤重症的临床及基础工作㊂E⁃mail:donghaow@清瘟败毒饮对脓毒症肺损伤大鼠的治疗作用及对铁死亡的影响武玉琳 王翠菡 崔亚萌 周钧 王东浩【摘要】 目的 研究清瘟败毒饮对盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)脓毒症肺损伤大鼠的治疗作用及机制研究㊂方法 取75只SD 健康雄性大鼠,按随机数字表法分为假手术组,模型组,清瘟败毒饮低㊁中㊁高剂量组,共5组㊂假手术组只切开腹壁并缝合,不进行CLP,灌胃等体积生理盐水,其余各组运用CLP 建立脓毒症肺损伤大鼠模型㊂检测治疗后各组大鼠生存率㊁肺组织的湿干重比㊁肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)总蛋白含量㊁BALF 总细胞数㊁肺组织脂质过氧化水平及肺组织HE 染色,研究清瘟败毒饮对脓毒症肺损伤的治疗作用㊂运用Western⁃Blot 法,检测各组大鼠肺组织中铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)㊁铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)㊁转铁蛋白(transferrin)㊁谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)蛋白表达情况,探讨清瘟败毒饮对脓毒症肺损伤大鼠模型中铁死亡相关因子的影响,初步研究其作用机制㊂结果 模型组生存率为40.00%,清瘟败毒饮低㊁中㊁高剂量组生存率分别为53.33%㊁60.00%㊁73.33%;同假手术组相比,模型组能明显增加脓毒症肺损伤大鼠肺湿干重比(W /D)(P <0.01),模型组BALF 上清液总蛋白含量显著增多(P <0.01),总细胞数显著增多(P <0.01)㊂同模型组相比,清瘟败毒饮中㊁高剂量组能减少脓毒症肺损伤大鼠肺W /D(P <0.05,P <0.01),清瘟败毒饮低㊁中㊁高剂量组均能显著减少BALF 上清液总蛋白含量(P <0.05,P <0.01),减少总细胞数(P <0.05);同假手术组相比,模型组大鼠白细胞介素⁃6(interleukin⁃6,IL⁃6)㊁白细胞介素⁃1β(interleukin⁃1β,IL⁃1β)㊁肿瘤坏死因子⁃α(tumor necrosis factor⁃α,TNF⁃α)㊁丙二醛(malondialdehyde,MDA)㊁4⁃羟基壬烯醛(4⁃hydroxide,4⁃HNE)㊁总谷胱甘肽(total⁃glutathione,T⁃GSH)㊁氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)和二价铁离子(Fe 2+)水平显著升高(P <0.01)㊂同模型组相比,清瘟败毒饮中剂量和高剂量组大鼠IL⁃6㊁IL⁃1β和TNF⁃α水平显著降低(P <0.01),清瘟败毒饮高剂量组大鼠MDA 和4⁃HNE 水平显著降低(P <0.01);清瘟败毒饮各剂量组均能降低GSSG 和Fe 2+水平,尤其以清瘟败毒饮高剂量组更为显著(P <0.01)㊂同假手术组相比,模型组大鼠中T⁃GSH㊁GSH 水平和GSH /GSSG 比值明显降低,清瘟败毒饮各剂量组均能显著提高T⁃GSH㊁GSH 水平和GSH /GSSG 比值(P <0.01),模型组大鼠FTH㊁FTL㊁Transferrin 蛋白表达量显著增加(P <0.01),GPX4蛋白表达明显下降(P <0.01)㊂同模型组相比,经各剂量清瘟败毒饮干预后FTH㊁FTL 的蛋白表达量显著降低(P <0.01),而中㊁高剂量清瘟败毒饮干预同样可以降低Transferrin 的蛋白表达量(P <0.01);此外,清瘟败毒饮各剂量组可明显升高GPX4蛋白表达(P <0.01)㊂结论 清瘟败毒饮对脓毒症肺损伤大鼠的治疗作用明确,其治疗机制可能同抑制铁死亡相关㊂【关键词】 脓毒症肺损伤; 铁死亡; 清瘟败毒饮; 铁蛋白重链; 铁蛋白轻链; 转铁蛋白; 谷胱甘肽过氧化酶4【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2024.05.005The therapeutic effect of Qingwen Baidu Decoction sepsis⁃induced lung injury in rats and its influence on ferroptosisWU Yulin,WANG Cuihan,CUI Yameng,ZHOU Jun,WANG DonghaoIntensive Care Unit of Tianjin Medical University Cancer Institute&Hospital,Tianjin300202,China Corresponding author:WANG Donghao,E⁃mail:donghaow@【Abstract】 Objective To investigate the therapeutic effect and mechanism of Qingwen Baidu Decoction on sepsis⁃induced lung injury in rats with cecal ligation and puncture(CLP).Methods A total of75healthy male SD rats were randomly divided into sham operation group,model group,and low, medium,and high dose Qingwen Baidu Decoction groups,with30rats in each group.The sham operation group only underwent laparotomy and suture without CLP and was orally administered with an equal volume of normal saline.The remaining groups underwent CLP to establish a sepsis⁃induced lung injury rat model. The therapeutic effect of Qingwen Baidu Decoction on sepsis⁃induced lung injury was investigated by detecting the survival rate,wet⁃to⁃dry weight ratio of lung tissue,total protein content and total cell count in bronchoalveolar lavage fluid(BALF),lung tissue lipid peroxidation level,and HE staining after treatment.In addition,the method of western blot was used to detect the expression of FTH,FTL, transferrin,and GPX4proteins in lung tissue of each group of rats,to explore the effect of Qingwen Baidu Decoction on iron death⁃related factors in sepsis⁃induced lung injury rat model,and to preliminarily study its mechanism of action.Results Qingwen Baidu Decoction intervention could effectively reduce the lung W/D ratio,total protein content,and total cell count in BALF of sepsis⁃induced lung injury rats.It could also decrease the levels of IL⁃6,IL⁃1β,TNF⁃α,MDA,and4⁃HNE in sepsis⁃induced lung injury rats, reduce the levels of GSSG,and Fe2+,increase the level of T⁃GSH,GSH,and improve the GSH/GSSG ratio.Moreover,Qingwen Baidu Decoction could reduce lung tissue pathological changes such as alveolar rupture or fusion and inflammatory cell infiltration caused by sepsis⁃induced lung injury.In addition, Qingwen Baidu Decoction could reduce the protein expression levels of iron death⁃related factors FTH,FTL and transferrin,while increase the protein expression level of GPX4.Conclusion Qingwen Baidu Decoction has a clear therapeutic effect on sepsis⁃induced lung injury in rats,and its therapeutic mechanism may be related to the inhibition of iron death.【Key words】 sepsis⁃induced lung injury; ferroptosis; Qingwen Baidu Decoction; ferritin heavy chain; ferritin light chain; transferrin; glutathione peroxidase4 脓毒症是机体在重症感染㊁严重创伤等情况下常见的并发症,可累及肺㊁肾㊁心等多个器官㊂肺脏作为脓毒症病理变化中最易受损害的靶器官之一,有高达68.2%的脓毒症患者合并肺损伤,若不及时救治,死亡率可达43%[1]㊂因此,脓毒症肺损伤是脓毒症器官衰竭中最主要的致死性并发症之一,也是当今急危重病医学面临的重大难题㊂脓毒症肺损伤发病机制错综复杂,致病环节层出不穷㊂因此,寻找安全有效的干预措施改善脓毒症肺损伤至关重要㊂研究发现,脂质过氧化物的堆积引起肺泡上皮细胞铁死亡,是脓毒症肺损伤的重要环节[2]㊂在脓毒症肺损伤小鼠肺组织中,铁离子和转铁蛋白水平较正常小鼠显著升高[3],脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平上升[4]㊂在脂多糖诱导的肺泡上皮细胞损伤模型中,同样发现总铁离子㊁活性氧(reactive oxygen species,ROS)㊁MDA处于较高水平㊂由此可见,通过调控铁死亡,抑制肺泡上皮细胞铁死亡,缓解脓毒症肺损伤可能是新的治疗手段㊂大量研究表明,中药复方及其有效成分在改善脓毒症肺损伤炎症反应,减轻脓毒症肺损伤等方面具有明显优势㊂研究发现,四逆汤可以通过调节ACE2⁃Ang(1⁃7)⁃Mas轴和抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路来改善脓毒症诱导的急性肺损伤[5]㊂甘草酸作为甘草的主要活性成分,能明显降低脓毒症小鼠炎症因子的表达,并可通过抑制HMGB1/TLR9通路,减少肺组织中中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)的形成,缓解脓毒症小鼠的肺损伤[6]㊂在脓毒症小鼠模型中,五味子甲素可以通过减少炎症因子的产生和细胞的异常凋亡而发挥抗炎作用,进一步减轻肺损伤[7]㊂清瘟败毒饮是清代著名温病学家余师愚在1794年所创制的名方,具有 清热解毒,凉血泻火”之功,广泛应用于脓毒症肺损伤的治疗[8]㊂临床研究表明,清瘟败毒饮可显著缓解脓毒症患者肺损伤症状,延缓疾病进展,有利于长期预后[9⁃10]㊂清瘟败毒饮缓解脓毒症肺损伤的作用不言而明,但是其具体作用机制尚不明确㊂基于此,本研究首先采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)法建立脓毒症肺损伤大鼠模型,灌胃不同剂量的清瘟败毒饮,明确清瘟败毒饮对脓毒症肺损伤的治疗作用,并研究清瘟败毒饮对脓毒症肺损伤大鼠铁死亡相关因子表达的影响,另外初步探讨清瘟败毒饮是否为通过调控铁死亡治疗脓毒症肺损伤的作用机制㊂1 材料和方法1.1 实验动物SPF级健康雄性SD大鼠75只,6~8周龄,体质量(200±20)g,购买于北京华阜康生物科技股份有限公司,合格证号:110322210100331916㊂饲养环境温度保持在(25±2)℃,相对湿度为(50±15)%,明暗周期12小时/12小时的环境下,自由饮水和进食㊂该实验经天津市肿瘤医院伦理委员会批准,批准号:NSFC⁃AE⁃2023135㊂1.2 实验药物及制备按原方比例,称取生石膏24g㊁生地黄6g㊁黄连3g㊁栀子9g㊁桔梗4.5g㊁黄芩9g㊁知母9g㊁赤芍9g㊁玄参9g㊁连翘9g㊁竹叶6g㊁甘草4.5g㊁牡丹皮9g,加入8倍体积水煎煮30分钟,浓缩成2g生药/mL, 4℃冷藏备用㊂1.3 主要试剂和仪器白细胞介素⁃6(interleukin⁃6,IL⁃6),批号:H007⁃1⁃1;白细胞介素1β(interleukin⁃1β,IL⁃1β),批号H002⁃1⁃2;MDA,批号C003⁃1⁃2;谷胱甘肽(glutathione,GSH);批号C006⁃2⁃1;总谷胱甘肽(total⁃glutathione,T⁃GSH)/氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG),即T⁃GSH/GSSG,批号:A061⁃1⁃2;铁离子浓度测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所㊂铁载蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH),批号:ab75973;铁载蛋白轻链(ferritin light chain,FTL),批号:ab75973;转铁蛋白(transferrin),批号:ab278498;谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase4,GPX4),批号:ab252833;β⁃肌动蛋白(β⁃actin),批号:ab179467;β⁃actin相应的二抗均购自Abcam公司;8%~12%SDS⁃PAGE,货号:P1200,购于Solarbio㊂PVDF膜,货号: YA1701,购于Solarbio㊂Eclipse Ci显微镜,日本Nikon公司;Infinite F50酶标仪,瑞士Tecan公司;全自细胞计数仪,美国BIO⁃RAD公司,506BR1436;5810型台式冷冻离心机,德国Eppndorf公司;DYCZ⁃24DN型垂直电泳槽,北京六一仪器厂;SH⁃523型化学发光成像系统,杭州申花科技有限公司㊂1.4 实验分组㊁造模及给药方法将75只大鼠,根据随机数字表法分为假手术组,模型组及清瘟败毒饮低㊁中㊁高剂量组5组,每组15只㊂除假手术组外,其余各组运用CLP法建立脓毒症肺损伤大鼠动物模型,CLP术后12小时插管监测大鼠平均动脉压,当平均动脉压下降30%或以上,认为造模成功[11]㊂造模过程中,模型组存活6只;清瘟败毒饮低剂量组存活8只;清瘟败毒饮中剂量组存活9只;清瘟败毒饮高剂量组存活11只㊂全部造模成功后,假手术组只切开腹壁并缝合,不进行CLP,用等体积生理盐水灌胃,按照人 大鼠体表面积给药剂量换算表计算,清瘟败毒饮组低㊁中㊁高剂量组每天给药剂量分别为0.7g/kg㊁1.3g/kg㊁2.5g/kg,每天1次,连续7天㊂末次给药24小时后,戊巴比妥麻醉动物,颈椎脱臼法予以安乐死,取肺组织备用㊂1.5 观察指标及检测方法1.5.1 大鼠生存率 造模给药后,每天统计各组大鼠存活的数量,连续观察7天㊂生存率(%)=存活大鼠数量/15×100%㊂1.5.2 肺组织的湿干重比 造模给药24小时后,取肺脏,生理盐水洗净吸干后,进行肺湿干重(W/ D)比测定㊂取右中叶肺组织称重(W)后,置于烤箱中,60℃烘烤至恒重后称干重(D),计算W/D㊂1.5.3 大鼠肺泡灌洗液总蛋白(total protein,TP)含量检测 造模给药24小时后,运用腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉大鼠并后仰卧固定于操作台,进行颈部解剖充分暴露气管和肺部,行气管插管并固定㊂随后用5mL无菌生理盐水分3次经导管注入轻轻按摩肺部30秒并收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),BALF回收率大约为85%~90%㊂用双层纱布过滤,以3000r/ min离心(离心半径=15cm)15分钟后,取上清液保存于-20℃冰箱内,采用ELISA法测定BALF中TP 的含量㊂1.5.4 大鼠BALF总细胞数检测 用500μL4℃预冷的PBS将BALF离心后得到的细胞沉淀重新悬浮,轻柔吹散混合均匀,取10μL细胞悬浮液注入细胞计数板中,使用全自动细胞计数仪测定总细胞数㊂1.5.5 肺组织脂质过氧化及铁离子水平检测 造模给药24小时后,收集各组大鼠肺组织,试剂盒检测造模给药后各组大鼠肺组织中IL⁃6㊁IL⁃1β㊁MDA㊁GSH和GSSG水平,并分别计算GSH总量(T⁃GSH =GSH+GSSG)和GSSG/T⁃GSH比值,免疫组化法检测脂质过氧化产物,4⁃羟基壬烯醛(4⁃hydroxide, 4⁃HNE)表达水平㊂同时试剂盒检测造模给药后各组大鼠肺组织中二价铁离子(Fe2+)水平㊂1.5.6 肺组织病理染色 各组大鼠肺组织经10%福尔马林溶液固定24小时,水洗20分钟后梯度酒精脱水,随后二甲苯透明后石蜡包埋,切片5μm,随后将肺组织石蜡切片于60℃烘烤,于二甲苯和梯度酒精中脱蜡并水化㊂苏木精染细胞核,伊红染细胞质,脱水封片后在光学显微镜下观察各组肺组织形态㊂1.5.7 肺组织中铁死亡相关因子表达 Western blot检测大鼠肾组织中FTH㊁FTL㊁Transferrin㊁GPX4蛋白的表达㊂收集大鼠肾组织,并加入150μL RIPA裂解缓冲液,匀浆离心后留取蛋白上清液㊂采用BCA蛋白测定试剂盒测定TP浓度,将样品蛋白浓度进行均一化㊂每个样品取等量蛋白20μg,8% ~12%SDS⁃PAGE电泳后分离的蛋白质转移到PVDF膜㊂将膜在室温下用5%脱脂奶粉封闭2小时后,分别加入不同的兔抗大鼠一抗FTH(稀释比例1∶3000)㊁FTL(稀释比例1∶3000)㊁Transferrin (稀释比例1∶2000)㊁GPX4(稀释比例1∶3000)㊁β⁃actin(稀释比例1∶5000),4℃孵育过夜㊂洗膜后加入二抗(羊抗兔IgG稀释比例按1∶9000),室温孵育2小时㊂TBST洗膜后加ECL化学发光法显影检测,之后使用Image Pro Plus6.0软件对条带灰度值进行量化分析㊂计量原理根据目的蛋白的着色深浅及分布面积来确定目的蛋白的表达量,通过测量出每张图片的累积光密度值(integrated option density,IOD)以及区域面积(area)值,再计算出平均光密度值(mean density),即mean density=IOD/ area,此值反映了目标蛋白的单位面积浓度㊂最后取每个样本的5个随机区域mean density的平均值作为此样本值㊂1.6 统计学方法采用SPSS25.0统计软件进行数据统计,计量数据以均数±标准差(x±s)表示,各组数据符合正态分布且方差齐,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD⁃t检验㊂P<0.05代表有统计学差异㊂2 结果2.1 各组大鼠生存率造模后24小时假手术组生存率100.00%,存活数量15只;模型组生存率为40.00%,存活数量6只;清瘟败毒饮低剂量组生存率53.33%,存活数量8只;清瘟败毒饮中剂量组生存率60.00%,存活数量9只;清瘟败毒饮高剂量组生存率73.33%,存活数量11只㊂见表1㊂表1 各组大鼠生存率组别初始数量(只)24小时后存活数量(只)存活率(%)假手术组1515100.00模型组15640.00清瘟败毒饮低剂量组15853.33清瘟败毒饮中剂量组15960.00清瘟败毒饮高剂量组151173.33 2.2 清瘟败毒饮对脓毒症肺损伤大鼠肺屏障功能的影响2.2.1 清瘟败毒饮对各组大鼠肺组织的湿干重比的影响 造模给药后,与假手术组相比,模型组能明显增加脓毒症肺损伤大鼠肺W/D值(P<0.05, P<0.01)㊂与模型组相比,清瘟败毒饮各剂量组均能一定程度减少脓毒症肺损伤大鼠肺W/D值(P<0.05,P<0.01),但清瘟败毒饮低剂量组无明显差异(P>0.05)㊂见表2㊂2.2.2 清瘟败毒饮对各组大鼠BALF总蛋白的影响 造模给药后,与假手术组相比,模型组BALF上清液TP含量显著增多(P<0.01)㊂与模型组相比,清瘟败毒饮低㊁中㊁高剂量组均能显著减少TP含量(P<0.01)㊂见表2㊂2.2.3 清瘟败毒饮对各组大鼠BALF总细胞数的影响 造模给药后,与假手术组相比,模型组BALF 的总细胞数显著增多(P<0.01)㊂与模型组相比,清瘟败毒饮各剂量组均能一定程度减少BALF中的总细胞数,其中清瘟败毒饮中㊁高剂量组有统计学差异(P<0.01)㊂见表2㊂2.3 清瘟败毒饮对各组大鼠脂质过氧化及铁离子水平的影响造模给药后,与假手术组相比,模型组大鼠IL⁃6㊁IL⁃1β㊁TNF⁃α㊁MDA和4⁃HNE水平显著升高(P<0.01)㊂与模型组相比,清瘟败毒饮中剂量和高剂量组大鼠IL⁃6㊁IL⁃1β和TNF⁃α水平显著降低(P<0.01),清瘟败毒饮高剂量组大鼠MDA和4⁃HNE水平显著降低(P<0.01)㊂另外,同假手术组相比,模型组大鼠GSSG和Fe2+水平显著升高(P<0.01),清瘟败毒饮各剂量组均能降低GSSG和Fe2+水平,尤其以清瘟败毒饮高剂量组更为显著(P<0.01)㊂同时,与假手术组相比,模型组大鼠中T⁃GSH㊁GSH水平和GSH/GSSG 比值明显降低(P<0.01),清瘟败毒饮各剂量组均能显著提高T⁃GSH㊁GSH水平和GSH/GSSG比值(P<0.05,P<0.01)㊂见表3㊂2.4 清瘟败毒饮对各组大鼠肺组织病理学形态的影响结果发现,正常组大鼠肺组织结构正常,肺间质未见明显炎性细胞浸润;模型组大鼠肺组织结构严重破坏,呈弥漫性病变,肺泡形状发生改变,肺泡膨胀不全,部分肺泡断裂或融合,肺泡间隔变厚,肺间质充满大量炎性细胞浸润;与模型组相比,清瘟败毒饮各组肺组织见肺泡间隔逐渐变薄,肺泡壁完整,肺泡腔逐渐清晰,肺间质间隙炎症细胞浸润逐渐减少㊂见图1㊂表2 清瘟败毒饮对脓毒症肺损伤大鼠肺屏障功能的影响(x±s)组别鼠只肺组织W/D BALF中的TP(mg/mL)BALF中的总细胞数(×105/个)假手术组15 4.90±0.548.62±0.6170.00±4.79模型组68.15±0.69a25.19±1.21a195.00±18.51a清瘟败毒饮低剂量组87.92±1.0720.43±1.01c174.50±10.19清瘟败毒饮中剂量组97.15±0.57b14.51±1.06c156.22±10.43c清瘟败毒饮高剂量组11 6.20±0.62c12.17±1.03c141.27±13.63c注:与假手术组相比,a P<0.01;与模型组相比,b P<0.05,c P<0.01㊂表3 清瘟败毒饮对各组大鼠脂质过氧化及铁离子水平的影响(x±s)组别鼠只IL⁃6(pg/mL)IL⁃1β(pg/mL)TNF⁃α(pg/mL)MDA(μmol/L)4⁃HNE(μmol/L)假手术组1595.31±11.9475.21±13.6582.81±9.59 1.53±0.4276.14±45.60模型组6688.24±106.99a405.53±102.21a646.72±86.79a 3.68±0.69a232.83±83.06a 清瘟败毒饮低剂量组8642.60±87.95397.90±393.45547.93±108.29b 3.28±0.42248.29±54.06清瘟败毒饮中剂量组9398.23±76.98c242.27±33.31c425.72±63.41c 2.72±0.59c203.21±34.58清瘟败毒饮高剂量组11298.46±45.09c194.87±27.43c292.26±47.30c 2.19±0.52c147.17±44.65c 组别鼠只T⁃GSH(μmol/L)GSH(μmol/L)GSSG(μmol/L)GSH/GSSG Fe2+(μmol/L)假手术组1514.59±3.7411.82±3.46 1.38±0.6211.04±7.61 1.00±0.18模型组6 6.17±1.40a 1.21±0.93a 2.48±0.57a0.52±0.35a 2.35±0.17a 清瘟败毒饮低剂量组89.98±2.19c 5.50±2.21c 2.24±0.71 2.86±1.49c 2.18±0.27清瘟败毒饮中剂量组910.04±3.02b 6.69±2.79c 1.68±0.68b 4.88±3.04c 1.44±0.28c 清瘟败毒饮高剂量组1112.07±3.88c9.00±3.73c 1.53±0.56c 6.88±4.22c 1.38±0.26c 注:与假手术组相比,a P<0.01;与模型组相比,b P<0.05,c P<0.01㊂ 注:A 假手术组;B 模型组;C 清瘟败毒饮低剂量组;D 清瘟败毒饮中剂量组;E 清瘟败毒饮高剂量组㊂图1 各组大鼠肺组织病理学形态学观察(HE,×100)表4 清瘟败毒饮对大鼠肺组织中FTH㊁FTL㊁Transferrin㊁GPX4表达的影响(x ±s )组别鼠只FTH /b ⁃actin FTL /b ⁃actin Transferrin /b ⁃actin GPX4/b ⁃actin 假手术组150.34±0.030.44±0.02 1.05±0.04 1.25±0.12模型组6 1.55±0.10a 1.53±0.04a 2.26±0.14a 0.57±0.02a 清瘟败毒饮低剂量组8 1.23±0.06b 1.12±0.03b 2.05±0.17 1.05±0.09b 清瘟败毒饮中剂量组9 1.21±0.08b 1.03±0.04b 1.71±0.10b 1.08±0.10b 清瘟败毒饮高剂量组111.06±0.02b0.98±0.03b1.20±0.15b1.26±0.13b注:与假手术组相比,a P <0.01;与模型组相比,b P <0.01㊂2.5 清瘟败毒饮对各组大鼠肺组织中铁死亡相关因子表达的影响与假手术组相比,模型组大鼠FTH㊁FTL㊁Transferrin 的蛋白表达量显著增加(P <0.01),GPX4蛋白表达明显下降(P <0.01);与模型组相比,经各剂量清瘟败毒饮干预后FTH㊁FTL 的蛋白表达量显著降低(P <0.01),而中㊁高剂量清瘟败毒饮干预可以降低Transferrin 的蛋白表达量(P <0.01);此外,清瘟败毒饮各剂量组可明显升高GPX4蛋白表达(P <0.01)㊂见表4和图2㊂注:A 假手术组;B 模型组;C 清瘟败毒饮低剂量组;D 清瘟败毒饮中剂量组;E 清瘟败毒饮高剂量组㊂图2 各组大鼠肺组织中FTH㊁FTL㊁Transferrin㊁GPX4蛋白表达Western Blot 结果3 讨论本研究通过运用CLP 建立脓毒症肺损伤大鼠动物模型,灌胃不同剂量的清瘟败毒饮,以明确清瘟败毒饮对脓毒症肺损伤大鼠的治疗作用,探讨清瘟败毒饮治疗脓毒症肺损伤大鼠的作用机制㊂肺屏障功能与肺损伤程度密切相关,肺W /D㊁BALF 总蛋白和BALF 总细胞数是直接反映肺屏障破坏情况的重要指标[12]㊂结果发现,清瘟败毒饮各组均能一定程度减少脓毒症肺损伤大鼠肺W /D㊁BALF 中的TP 含量和BALF 中的总细胞数㊂此外,当脓毒症肺损伤发生时,机体会释放大量的炎症细胞和ROS,这些物质会导致脂质分子中的不饱和脂肪酸受到氧化损伤,从而引发脂质过氧化反应,生成大量过氧化脂质㊂这些过氧化脂质可破坏细胞膜,影响细胞的结构和功能,进而影响细胞的生存能力[13]㊂IL⁃6㊁IL⁃1β㊁TNF⁃α㊁MDA 和4⁃HNE 与脂质过氧化有密切关系,T⁃GSH㊁GSH㊁GSSG㊁GSH /GSSG 是与细胞内氧化还原状态相关的指标,可以反映细胞内抗氧化能力和氧化应激水平[14⁃16]㊂Fe 2+的存在可以促进脂质过氧化反应的进行,从而导致细胞及组织的损伤㊂结果表明,清瘟败毒饮干预后可降低脓毒症肺损伤大鼠IL⁃6㊁IL⁃1β㊁TNF⁃α㊁MDA㊁4⁃HNE㊁GSSG 和Fe 2+水平,提高T⁃GSH㊁GSH 水平和GSH /GSSG 比值㊂最后,病理检查也发现清瘟败毒饮各剂量组可明显改善脓毒症肺损伤大鼠肺组织相关病理形态变化㊂由此可见,清瘟败毒饮各剂量组可不同程度上改善脓毒症肺损伤大鼠相关生化指标,缓解肺组织病理学变化,提示清瘟败毒饮对脓毒症肺损伤具有治疗作用㊂铁死亡是一种由铁依赖的不饱和脂肪酸磷脂氧化累积导致的细胞死亡方式,与脓毒症肺损伤的发生发展密切相关[17]㊂结果发现,清瘟败毒饮可以降低铁死亡相关因子FTH㊁FTL和Transferrin 的蛋白表达水平,同时升高GPX4蛋白表达水平㊂研究发现尿嘧啶(uridine)可以通过抑制巨噬细胞的铁死亡来缓解脓毒症所引起的急性肺损伤[18]㊂粘蛋白1是一种大分子跨膜糖蛋白,研究发现粘蛋白1通过GSK3抑制铁死亡可以减轻脓毒症诱导的急性肺损伤[19]㊂体外试验发现,异质核核糖核蛋白(AU⁃rich binding factor1,AUF1)作为一种RNA结合蛋白质,可以通过调控NRF2和ATF3来保护细胞免受铁死亡所导致的氧化损伤,从而减轻脓毒症所引起的急性肺损伤[20]㊂铁蛋白(ferritin)是人体内最主要的铁储存仓,可以通过储存细胞内的游离铁离子维持细胞铁稳态[21]㊂ferritin由铁蛋白轻链和重链(FTL㊁FTH)两种多肽链组成,其中FTL主要参与铁的储存,它能够与FTH结合形成二聚体,进而形成四聚体和八聚体的铁蛋白团簇,将多余的铁离子以安全㊁可控的方式储存㊂FTH主要参与铁的释放,它能够将铁蛋白团簇中的铁离子释放出来,以满足机体对铁的需求[22]㊂转铁蛋白(transferrin)是一种铁结合蛋白,主要由两个相同的多肽链组成,每个链上含有一个铁结合位点,能够结合两个三价铁离子㊂在体内,转铁蛋白通过循环系统运输铁离子,以满足机体各种细胞的铁需求㊂此外,转铁蛋白还与细胞表面的转铁蛋白受体结合,进入细胞内部,在细胞质中释放铁离子,以参与细胞内的生化反应[23]㊂GPX4是已知的唯一能够直接清除脂质过氧化物的酶,在铁死亡的过程中发挥核心调控的作用㊂抑制GPX4活性或使其表达缺失,都会引发不受控制的多不饱和脂肪酸氧化和脂肪酸自由基生成,随后进一步通过脂质ROS依赖性方式促进铁死亡的发生㊂反之,通过上调GPX4的表达则可以减少脂质ROS诱导的细胞铁死亡[24]㊂综上所述,本研究揭示了清瘟败毒饮对脓毒症肺损伤大鼠的治疗作用,同时研究发现,清瘟败毒饮对脓毒症肺损伤的作用机制可能与调节细胞中FTH㊁FTL㊁Transferrin和GPX4铁死亡相关因子水平相关,揭示了清瘟败毒饮通过调控铁死亡治疗脓毒症肺损伤的作用机制㊂参考文献[1] Zambon M,Vincent J L.Mortality rates for patients with acutelung injury/ARDS have decreased overtime[J].Chest,2008,133(5):1120⁃1127.[2] LIU P,FENG Y,LI H,et al.Ferrostatin⁃1alleviates lipopo⁃lysaccharide⁃induced acute lung injury via inhibitingferroptosis[J].Cellular&Molecular Biology Letters,2020,25(1):10.[3] 龙伟,徐丽华,成燕,等.铁死亡参与小鼠脓毒血症相关急性肺损伤的形成[J].西南国防医药,2020,30(8):4. [4] HE R,LIU B,XIONG R,et al.Itaconate inhibits ferroptosis ofmacrophage via Nrf2pathways against sepsis⁃induced acutelunginjury[J].Cell Death Discov,2022,8(1):43. [5] CHEN Q,LIU J,WANG W,et al.Sini decoction amelioratessepsis⁃induced acute lung injury via regulating ACE2⁃Ang(1⁃7)⁃Mas axis and inhibiting the MAPK signaling pathway[J].Biomed Pharmacother,2019,115:108971.[6] GU J,RAN X,DENG J,et al.Glycyrrhizin alleviates sepsis⁃induced acute respiratory distress syndrome via suppressing ofHMGB1/TLR9pathways and neutrophils extracellular trapsformation[J].Int Immunopharmacol,2022,108:108730.[7] LI W,HUANG Q,YU J,et al.Schisandrin improves lipopo⁃lysaccharide⁃induced acute lung injury by inhibiting theinflammatory response in vivo and invitro[J].J Food Biochem,2022,46(7):e14141.[8] 杨菊,张照,王加伟,等.清瘟败毒饮对脂多糖诱导急性肺损伤的改善作用及机制[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(15):1⁃13.[9] 罗峰,杨曼.清瘟败毒饮合大承气汤联合西药治疗肺炎合并脓毒症39例[J].中医研究,2019,32(7):3. [10] 易琼,戴飞跃,郭志华,等.清瘟败毒饮对毒瘀互结型脓毒血症患者炎症反应和脏器功能的影响[J].中国中西医结合杂志,2020,40(7):7.[11] ZHU Y,KUANG L,WU Y,et al.Protective effects of inhibitionof mitochondrial fission on organ function after Sepsis[J].FrontPharmacol,2021,12:712489.[12] LI T,WU Y N,WANG H,et al.Dapk1improves inflammation,oxidative stress and autophagy in LPS⁃induced acute lung injuryvia p38MAPK/NF⁃κB signaling pathway[J].Mol Immunol,2020,120:13⁃22.[13] CHEN H,LIN X,YI X,et al.SIRT1⁃mediated p53deacetylation inhibits ferroptosis and alleviates heat stress⁃inducedlung epithelial cells injury[J].Int J Hyperthermia,2022,39(1):977⁃986.[14] Jaganjac M,Milkovic L,Zarkovic N,et al.Oxidative stress andregeneration[J].Free Radic Biol Med,2022,181:154⁃165.[15] Owen J B,Butterfield D A.Measurement of oxidized/reducedglutathioneratio[J].Methods Mol Biol,2010,648:269⁃277.[16] Giustarini D,Dalle⁃Donne I,Milzani A,et al.Analysis of GSHand GSSG after derivatization with N⁃ethylmaleimide[J].NatProtoc,2013,8(9):1660⁃1669.[17] WANG W,XU R,ZHAO H,et al.CircEXOC5promotesferroptosis by enhancing ACSL4mRNA stability via binding toPTBP1in sepsis⁃induced acute lung injury[J].Immunobiology,2022,227(4):152219.[18] LAI K,SONG C,GAO M,et al.Uridine alleviates sepsis⁃induced acute lung injury by inhibiting ferroptosis of macrophage[J].Int J Mol Sci,2023,24(6):5093.[19] WANG Y M,GONG F C,QI X,et al.Mucin1inhibitsferroptosis and sensitizes vitamin E to Aileviate sepsis⁃inducedacute lung injury through GSK3β/Keap1⁃Nrf2⁃GPX4pathway[J].Oxid Med Cell Longev,2022,2022:2405943. [20] WANG Y,CHEN D,XIE H,et al.AUF1protects againstferroptosis to alleviate sepsis⁃induced acute lung injury byregulating NRF2and ATF3[J].Cell Mol Life Sci,2022,79(5):228.[21] Lee N K,Cho S,Kim I S.Ferritin⁃a multifaceted proteinscaffold forbiotherapeutics[J].Exp Mol Med,2022,54(10):1652⁃1657.[22] ZHANG N,YU X,XIE J,et al.New insights into the role offerritin in iron homeostasis and neurodegenerative diseases[J].Mol Neurobiol,2021,58(6):2812⁃2823.[23] Gomme P T,Mc C K B,Bertolini J.Transferrin:structure,function and potential therapeuticactions[J].Drug DiscovToday,2005,10(4):267⁃273.[24] Shimizu J,Murao A,Nofi C,et al.Extracellular CIRP promotesGPX4⁃mediated ferroptosis in sepsis[J].Front Immunol,2022,13:903859.(收稿日期:2023⁃07⁃30)(本文编辑:韩虹娟)。
