氮测定方法之二麝香草酚分光光度法测量硝酸盐氮

RP-HPLC和麝香草酚法检测硝酸盐氮的比较纪晓娜;刘晶;左妍;艾胜书;任志敏;边德军【摘要】针对处理后的城市污水,分别进行了反相高效液相色谱法(RP-HPLC)和麝香草酚法的硝酸盐氮检测试验,并结合检测原理对比研究了2种方法的线性范围、检出限、平行偏差、方法偏差、检测时间和试剂消耗等.结果表明:RP-HPLC的线性范围在2.00～25.00 mg·L-1之间,线性相关系数(R2)为0.999 93,检出限为0.001 mg·L-1,样品的平行偏差在0.01％～0.33％之间,检测时间为4 min,使用了3种药品;麝香草酚法样品的平行偏差在0.83％～12％之间,检测时间为6 min,使用7种药品;RP-HPLC相对于麝香草酚分光光度法的方法偏差在-6.3％～8.3％之间.【期刊名称】《长春工程学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(015)001【总页数】5页(P1-4,23)【关键词】硝酸盐氮;反相高效液相色谱法;麝香草酚分光光度法;城市污水【作者】纪晓娜;刘晶;左妍;艾胜书;任志敏;边德军【作者单位】长春工程学院理学院;吉林省城市污水处理重点实验室,长春130012;长春工程学院理学院;吉林省城市污水处理重点实验室,长春130012;长春工程学院理学院;吉林省城市污水处理重点实验室,长春130012;长春工程学院水利与环境工程学院;吉林省城市污水处理重点实验室,长春130012;长春工程学院水利与环境工程学院;吉林省城市污水处理重点实验室,长春130012;长春工程学院水利与环境工程学院;吉林省城市污水处理重点实验室,长春130012【正文语种】中文【中图分类】X832城市污水包括生活污水、工业废水和降水，城市污水具有总氮（TN）含量高的特点，在处理过程中，大部分转化为稳定的硝酸盐氮。

本实验室在研究城市污水处理反应器［1－2］的同时，研究了城市污水的硝酸盐氮检测方法，针对处理后的城市污水中硝酸盐氮含量高的特点，引入反相高效液相色谱法（RP－HPLC），该方法被成功地应用到了城市污水的检测中，目前这项应用还未见报道。

水质硝酸盐氮的测定酚二磺酸分光光度法1 适用范围本标准适用于测定饮用水、地下水和清洁地面水中的硝酸盐氮。

1．1 测定范围本方法适用于测定硝酸盐氮浓度范围在0．02-2．0mg／L之间。

浓度更高时，可分取较少的试份测定。

1．2 最低检出浓度采用光程为30mm的比色皿，试份体积为50ml时，最低检出浓度为0．02mg／L。

1．3 灵敏度当使用光程为30mm的比色皿，试份体积为50ml，硝酸盐氮含量为0．60mg／L时，吸光度约0．6单位。

使用光程为10mm的比色皿，试份体积为50ml，硝酸盐氮含量为2．0mg／L时，其吸光度约0．7单位。

1．4 干扰水中含氯化物、亚硝酸盐、铵盐、有机物和碳酸盐时，可产生干扰。

含此类物质时，应作适当的前处理，以消除对测定的影响。

2 原理硝酸盐在无水情况下与酚二磺酸反应，生成硝基二磺酸酚，在碱性溶液中，生成黄色化合物，于410nm波长处进行分光光度测定。

3 试剂本标准所用试剂除另有说明外，均为分析纯试剂，实验中所用的水，均应用蒸馏水或同等纯度的水。

3．1 硫酸：?=1．84g／ml。

3．2 发烟硫酸(H2SO4·SO3)：含13％三氧化硫(SO3)。

注：(1)发烟硫酸在室温较低时凝固，取用时，可先在40-50℃隔水浴中加温使熔化，不能将盛装发烟硫酸的玻璃瓶直接置入水浴中，以免瓶裂引起危险。

(2)发烟硫酸中含三氧化硫(SO3)浓度超过13％时，可用硫酸(3．1)按计算量进行稀释。

3．3 酚二磺酸(C6H3(OH)(SO3H)2)。

称取25g苯酚置于500ml锥形瓶中，加150ml硫酸(3．1)使之溶解，再加75ml发烟硫酸(3．2)，充分混和。

瓶口插一小漏斗，置瓶于沸水浴中加热2h，得淡棕色稠液，贮于棕色瓶中，密塞保存。

注：(1)当苯酚色泽变深时，应进行蒸馏精制。

国家环境保护局1987-03-14批准 1987-08-01实施(2)无发烟硫酸时，亦可用硫酸(3．1)代替，但应增加在沸水浴中加热时间至6h，制得的试剂尤应注意防止吸收空气中的水分，以免因硫酸浓度的降低，影响硝基化反应的进行，使测定结果偏低。

硝酸盐氮的两种测定方法对比分析来源:沧州水文局作者:张国庆硝酸盐氮是有机物经无机化作用最终阶段的分解产物。

如果水体中硝酸盐氮含量过高，可使儿童血液中变性血红蛋白增加，含氮亚硝酸盐可经氧化生成硝酸盐，硝酸盐在无氧环境中受微生物的作用还原为亚硝酸盐，是致癌物质。

在地表水中硝酸盐氮含量不高，但生活污水和某些工业废水中有时有较高的硝酸盐氮，会对人体形成危害。

一、两种测试方法1．酚二磺酸分光光度法(1)原理酚与浓硫酸作用生成酚二磺酸，在无水情况下，与硝酸盐作用生成酚二磺酸硝基，在碱性溶液中，生成黄色化合物，用分光光度计在410nm 波长处比色测定。

(2)试剂配制①精制酚制备：将苯酚(分析纯)(剧毒)，放入水温为70℃～80℃水浴锅内熔化，在置入蒸馏瓶内蒸馏，加热器不能是明火，流出液为精制苯酚。

②酚二磺酸的配制：称取15g精制苯酚于250mL锥形瓶中，加105mL浓硫酸使之溶解，充分混合。

瓶口插一小漏斗，小心置瓶于沸水浴中加热6小时，得淡棕色稠液，贮于棕色瓶中，密塞保存。

③硝酸盐标准贮备液：称取0.7218g经105℃～110℃烘干的硝酸钾，溶于水中，移至1000mL容量瓶。

用水稀释至标线。

此溶液为100mg/L 硝酸盐氮。

④硫酸银溶液：称取4.40g硫酸银溶于水中，稀释至1000mL，此溶液每毫升能去除1.0mg氯离子。

⑤氢氧化铝悬浮液：溶解125g硫酸铝钾于1000mL水中，加热至60℃，在不断搅拌下，徐徐加入55mL氨水，放置约1小时后，移人1000mL量简内，用水反复洗涤沉淀，最后至洗涤液中不含亚硝酸盐为止。

澄清后，把上清液尽量全部倾出，只留稠的悬浮物，最后加入300mL 水，使用前应振荡均匀。

⑥浓氨水。

(3)水样处理和测定①氯离子的去除：取一定量的水样，根据已测定的氯离子含量，加入相当量的硫酸银溶液充分混合。

在暗处放置0.5小时以上，使氯化银凝聚沉淀，取上清液或用慢速滤纸过滤后的水样。

②取50.0mL经预处理的水样，调节pH至中性，于蒸发皿中，置水浴锅中蒸干，加1.0mL酚二磺酸，用玻璃棒研磨，使试剂与残渣充分接触溶解。

麝香草酚分光光度法测硝酸盐氮空白值高的分析处理目的对运用麝香草酚分光光度法测定水样中硝酸盐氮空白值高的分析处理。

方法《生活饮用水标准检验方法无机非金属指标》（GB/T 5750.5-2006）麝香草酚分光光度法。

结果硫酸银对实验有正干扰，经提纯处理后配制的硫酸银硫酸溶液作标准曲线在0.5～10mg/L，回归方程为y=0.0725x+0.0272，相关系数r=0.9991；对同一水样A加入不同量（1.00、3.00、5.00μg）的标准物质，测定回收率分别为99.3%、98.9%、101.5%；提纯后配制的硫酸银硫酸溶液性能稳定，对同一标准样品连续六个月测定值均在标准值范围之内。

结论经提纯处理后配制的硫酸银硫酸溶液密闭保存稳定性好，空白值低，准确度和精密度高。

Abstract：Objective To study the determination of nitrate nitrogen blank in water samples by using thymol spectrophotometry.Methods “Standard method for drinking water-Inorganic non-metallic index”（GB/T 5750.5-2006）Thyme phenol spectrophotometric method.Results Silver sulfate has positive interference on the silver sulfate solution，the purified preparation for the standard curve in 0.5～10mg/L，the regression equation was y=0.0725x+0.0272，correlation coefficient r=0.9991；on the same samples adding different quantity（1.00，3.00，5.00μg）standard material，determine the recovery rate were 99.3%，98.9%，101.5%；the solution properties of stable silver sulfate in sulfuric acid purification after preparation，on the same standard sample for six consecutive months of measured values are in the standard range of values.Conclusion The silver sulfate solution prepared by the purification process has good stability，low blank value，high accuracy and high precision.Key words：Thymol spectrophotometric method；Nitrate nitrogen；Blank value；Silver sulfate硝酸盐氮是含氮有机物无机化作用的最终分解产物，如果水样中仅含有硝酸盐氮，有机氮和亚硝酸盐氮都不存在，就表示有机污染物已经完全分解；如果水样中含有较多量的硝酸盐氮，其他各种含氮化合物也存在，就表示水的自净作用正在进行，有机物的分解物还未完成[1]。

麝香草酚法测定饮用水中硝酸盐氮的验证《职业与腱康》2005年l0月第2l卷第l0期OCCUPA TIONANDHEALTHV o1.21No.10October,2005快速染色操作方法先加A液1份,数秒钟后再加B液2份,约1min后以自来水冲冼,自然干燥或吹干后镜检.根据镜下对穿刺液成分的观察判断穿刺是否成功,以便及时复穿.2.3结果判断所有涂片有专人检阅和观察,主要根据细胞学特点,结合临床症状及取出物性状等综合判断,对不典型的细胞涂片可做抗酸染色找结核杆菌,并同时做外周血ADA和TBAb,并追踪观察.3结果3.1不同部位淋巴结结核的性别分布724例淋巴结穿刺中324例确诊为淋巴结结核,占44.7%,其中男性为113例,女性为211例,男女比例为1:1.8,颈部LNTB320例,占98.7%,腋下和胺股沟LNTB分别为1和3例,占3%和9%.结果见表1.表1324例淋巴结结核性别分布(例)14793.2324例淋巴结结核诊断分析见表2.LNTB中单个淋巴结肿大和淋巴结活动好者比率分别为99%和98%,68%抽出物为干酪样坏死,细胞学涂片中可见类上皮细胞者占40%,可见结核结节者占28%,可见巨郎罕细胞者占10%,非典型者占2l%,生化检查中50%ADA阳性,37%TBAb阳性.表2324例淋巴结细针穿刺细胞学涂片法诊断分析[例(%)]4讨论FNAC检查临床应用的诊断价值己得到普遍承认l4J,我院和国内外部分医院一样,已把该方法作为门诊常规检查方法,由于这种方法痛苦小,简单,安全,快速,无须特殊设备和价廉等特点,加上技术水平的不断提高有取代活体组织检查之趋势l4J.结核病,特别是肺外结核病,仍然是常见且难以诊断的疾病之一,长期以来主要依赖x线影像学和临床体征,由于无特异性给临床诊断和治疗带来较大不便,FNAC直接抽吸病变部位组织,根据细胞学形态结合临床体征和相关检查可大大提高诊断的正确性.本组FNAC准确诊断淋巴结结核率为85%,高于文献报道(73.6%)l5J.为提高诊断正确率,作者分析了最近324例诊断为LNTB标本并结合2o余年工作经验,总结几点体会:①LNTB最常见部位是颈部淋巴结(占98.7%),因为该部位距呼吸道近,较易被结核菌感染,而且,绝大数为单个淋巴结受感染(占90%),发病周期较长,被感染的淋巴结质硬且活动度好:②抽出物多为干酪样坏死;③由于发病周期长(分5期),细胞学特点变化复杂,各期中以类上皮细胞最常见,而典型巨郎罕细胞少见(仅10%):④生化检查中50%ADA阳性,37%TBAb阳性;⑤女性发病率约为男性的2倍,这可能与性别之间免疫系统微细差别有关.根据这些特点,在利用FNAC诊断LNTB时符合下列条件之一者可被确诊:①涂片可见典型巨郎罕氏细胞+临床症状之一(见表2),②涂片可见结核结节形成+临床症状其中3项+穿出物其中l项,③涂片可见类上皮细胞+抽出物为血性带颗粒或脓性+临床症状其中2项,④非典型性细胞涂片+临床症状其中3项+ADA或TBAb阳性,⑤干酪样坏死物+临床症状其中2项.5参考文献[1]李天潢,黄受方.实用细针吸取细胞学.北京:科学出版社,2OOO.50.[2]陆忠鸣.2280例头颈部淋巴结针吸细胞学检查分析.川北医学院学报,1999,14(1):98.[3]荣福,郭苏,左六二,等.经支气管针吸活检在纵隔及肺门淋巴结结核诊断中的作用.中华结核和呼吸杂志,2OO2,25(6):330—332.[4]张先亮.细针抽吸细胞学检查的临床应用,实用医学杂志,1998,14(2):85—86.[5]遥字琪,杨霞,孙维刚.淋巴结常见良性病变的针吸细胞学特点及其诊断.临床与实验病理学杂志,1998,14(2):152—154.(收稿:20O5一O1—26)(本文编辑:张军)麝香草酚法测定饮用水中硝酸盐氮的验证杨国栋(江苏省徐州市疾病预防控制中心,221003)关键词麝香草酚法;回收率;精密度;稳定性中国图书资料分类号:R115文献标识码:B文章编号:1004—1257(2005)10—1479—02硝酸盐氮是含氮有机物无机化作用的最终分解产物,饮用水中过高的硝酸盐氮,主要会使儿童血液中变性血红蛋白增加,因此有必要对饮用水中的硝酸盐氮进行测定.生活饮用水中规定有多种测定方法[1.2].镉柱还原法灵敏度较高,但操作复杂;二磺酸酚法干扰严重,样品的预处理麻烦费时.笔者采用麝香草酚法测定饮用水中的硝酸盐氮,现报告如下.1材料与方法1.1方法原理在浓硫酸存在下,麝香草酚与硝酸盐生成硝基酚化合物,在碱性溶液中发生分子重排,产生黄色化合物,可比l4802005年1O月第2l卷第lO期OCCUPA TIONANDHEALTHV o1.21No.10October,2005 色测定.1.2仪器与试剂50ml具塞比色管;721型分光光度计.硝酸盐氮标准溶液:1.00ml含10.硝酸盐氮;1+4乙酸溶液;20L氨基磺酸铵溶液;5g/L麝香草酚乙醇溶液;10g/L硫酸银硫酸溶液;氨水(p2o=0.88g/,m1).1.3方法取1.00ml水样于干燥的50ml比色管中,管中加入0.1ml氨基磺酸铵溶液,放置5min.加0.2ml麝香草酚溶液(由管中央直接滴到溶液中,勿沿管壁流下).加入2.0ml硫酸银硫酸溶液,混匀,放置5min.加8ml纯水,混合后边摇边滴入浓氨水至溶液呈黄色达最深,且氯化银沉淀溶解为止(约9ml左右).加纯水到25ml,混匀.于415nm波长,用2cm比色杯,以试剂空白作参比,测定样品的吸光度.绘制标准曲线,查出硝酸盐氮含量.计算公式:p=m/Vp一水中硝酸盐氮的质量浓度,mg/L;m一从标准曲线上查得样品管中硝酸盐氮的含量, tzg;V一水样体积,ml.2结果与讨论2.1标准曲线与线性范围取50ml比色管7支,分别加入0.O0,0.02,0.05,0.10,0.30,0.50,0.70,1.00ml硝酸盐氮标准溶液,各用纯水补足到1.00ml.其他步骤同水样,制备标准曲线.所得回归方程为:;=0.01404+0.06325X,相关系数为:r=0.9998o线性范围是0.12～10mg/L.2.2回收实验取已知浓度水样1.00ml加标准液,按实验方法作回收实验,回收率在舛.4%～105.0%之间,说明此方法准确度良好.见表1.表1回收实验结果2.3重复性精密度试验3份样品均同时做4个平行试验,测定结果显示3份样品标准差分别为0.0021,0.0013,0.0017,变异系数分别为4.53%,0.61%,0.28%,表明方法的重复性精密度良好.见表2.2.4再现性精密度试验3份样品1d内测定3次(每次测定后样品放冰箱内保存),测定结果显示3份样品标准差分别为O.0021,0.0021,0.0036,变异系数分别为4.67%,0.98%,0.79%,表明方法的再现性精密度良好.见表3.表2重复性精密度试验结果2.5稳定性试验将反应生成的黄色化合物在常温下放置,分别相隔0.25,0.5,1,8,24h测定吸光度,结果显示化合物稳定性高.见表4.表4稳定性试验结果2.6注意事项麝香草酚法的线性范围是0.12～10mg/L,生活饮用水中硝酸盐氮国家标准是≤20mg/L,因此对硝酸盐氮含量较高的样品要进行稀释.麝香草酚法所取水样量较少,操作要精确,仔细,否则易造成较大的人为误差.3参考文献[1]陈亚妍.生活饮用水检验规范注解.北京:科学技术文献出版社, 20o1.57.[2]中华人民共和国卫生部.生活饮用水检验规范,2001.180—181. (收稿i2O(O一02—06)(本文编辑:张军)尿l—nl,I32一nl,Alb联合检测对糖尿病患者早期肾功能损害的诊断意义徐东强,刘硕(山东省威海市文登中心医院,264400)关键词糖尿病;肾功能;尿a1一微球蛋白;尿一微球蛋白;尿白蛋白中国图书资料分类号:R446.6文献标识码:B文章编号:1004—1257(2005)10—1480—02 笔者应用放射免疫分析法(mA)X~110例糖尿病(DM)患者尿液中的a一微球蛋白(a一m),&一微球蛋白(一m),尿白蛋白(Alb)的含量作了检测分析,现报告如下.1对象与方法1.1对象1.1.1DM组110例(男65,女45),年龄29～68岁,系由我院%4OOl16耋}耋}啷OOO棚OOOmOOO蛳OOO蝴OOOl23。

水质硝酸盐氮的测定酚二磺酸分光光度法1 适用范围本标准适用于测定饮用水、地下水和清洁地面水中的硝酸盐氮。

1．1 测定范围本方法适用于测定硝酸盐氮浓度范围在0．02-2．0mg／L之间。

浓度更高时，可分取较少的试份测定。

1．2 最低检出浓度采用光程为30mm的比色皿，试份体积为50ml时，最低检出浓度为0．02mg／L。

1．3 灵敏度当使用光程为30mm的比色皿，试份体积为50ml，硝酸盐氮含量为0．60mg／L时，吸光度约0．6单位。

使用光程为10mm的比色皿，试份体积为50ml，硝酸盐氮含量为2．0mg／L时，其吸光度约0．7单位。

1．4 干扰水中含氯化物、亚硝酸盐、铵盐、有机物和碳酸盐时，可产生干扰。

含此类物质时，应作适当的前处理，以消除对测定的影响。

2 原理硝酸盐在无水情况下与酚二磺酸反应，生成硝基二磺酸酚，在碱性溶液中，生成黄色化合物，于410nm波长处进行分光光度测定。

3 试剂本标准所用试剂除另有说明外，均为分析纯试剂，实验中所用的水，均应用蒸馏水或同等纯度的水。

3．1 硫酸：?=1．84g／ml。

3．2 发烟硫酸(H2SO4·SO3)：含13％三氧化硫(SO3)。

注：(1)发烟硫酸在室温较低时凝固，取用时，可先在40-50℃隔水浴中加温使熔化，不能将盛装发烟硫酸的玻璃瓶直接置入水浴中，以免瓶裂引起危险。

(2)发烟硫酸中含三氧化硫(SO3)浓度超过13％时，可用硫酸(3．1)按计算量进行稀释。

3．3 酚二磺酸(C6H3(OH)(SO3H)2)。

称取25g苯酚置于500ml锥形瓶中，加150ml硫酸(3．1)使之溶解，再加75ml发烟硫酸(3．2)，充分混和。

瓶口插一小漏斗，置瓶于沸水浴中加热2h，得淡棕色稠液，贮于棕色瓶中，密塞保存。

注：(1)当苯酚色泽变深时，应进行蒸馏精制。

国家环境保护局1987-03-14批准 1987-08-01实施(2)无发烟硫酸时，亦可用硫酸(3．1)代替，但应增加在沸水浴中加热时间至6h，制得的试剂尤应注意防止吸收空气中的水分，以免因硫酸浓度的降低，影响硝基化反应的进行，使测定结果偏低。

水质硝酸盐氮的测定酚二磺酸分光光度法1 适用范围本标准适用于测定饮用水、地下水和清洁地面水中的硝酸盐氮。

1．1 测定范围本方法适用于测定硝酸盐氮浓度范围在0．02-2．0mg／L之间。

浓度更高时，可分取较少的试份测定。

1．2 最低检出浓度采用光程为30mm的比色皿，试份体积为50ml时，最低检出浓度为0．02mg／L。

1．3 灵敏度当使用光程为30mm的比色皿，试份体积为50ml，硝酸盐氮含量为0．60mg／L时，吸光度约0．6单位。

使用光程为10mm的比色皿，试份体积为50ml，硝酸盐氮含量为2．0mg／L时，其吸光度约0．7单位。

1．4 干扰水中含氯化物、亚硝酸盐、铵盐、有机物和碳酸盐时，可产生干扰。

含此类物质时，应作适当的前处理，以消除对测定的影响。

2 原理硝酸盐在无水情况下与酚二磺酸反应，生成硝基二磺酸酚，在碱性溶液中，生成黄色化合物，于410nm波长处进行分光光度测定。

3 试剂本标准所用试剂除另有说明外，均为分析纯试剂，实验中所用的水，均应用蒸馏水或同等纯度的水。

3．1 硫酸：?=1．84g／ml。

3．2 发烟硫酸(H2SO4·SO3)：含13％三氧化硫(SO3)。

注：(1)发烟硫酸在室温较低时凝固，取用时，可先在40-50℃隔水浴中加温使熔化，不能将盛装发烟硫酸的玻璃瓶直接置入水浴中，以免瓶裂引起危险。

(2)发烟硫酸中含三氧化硫(SO3)浓度超过13％时，可用硫酸(3．1)按计算量进行稀释。

3．3 酚二磺酸(C6H3(OH)(SO3H)2)。

称取25g苯酚置于500ml锥形瓶中，加150ml硫酸(3．1)使之溶解，再加75ml发烟硫酸(3．2)，充分混和。

瓶口插一小漏斗，置瓶于沸水浴中加热2h，得淡棕色稠液，贮于棕色瓶中，密塞保存。

注：(1)当苯酚色泽变深时，应进行蒸馏精制。

国家环境保护局1987-03-14批准 1987-08-01实施(2)无发烟硫酸时，亦可用硫酸(3．1)代替，但应增加在沸水浴中加热时间至6h，制得的试剂尤应注意防止吸收空气中的水分，以免因硫酸浓度的降低，影响硝基化反应的进行，使测定结果偏低。

水质硝酸盐氮的测定酚二磺酸分光光度法1 适用范围本标准适用于测定饮用水、地下水和清洁地面水中的硝酸盐氮。

1．1 测定范围本方法适用于测定硝酸盐氮浓度范围在0．02-2．0mg／L之间。

浓度更高时，可分取较少的试份测定。

1．2 最低检出浓度采用光程为30mm的比色皿，试份体积为50ml时，最低检出浓度为0．02mg／L。

1．3 灵敏度当使用光程为30mm的比色皿，试份体积为50ml，硝酸盐氮含量为0．60mg／L时，吸光度约0．6单位。

使用光程为10mm的比色皿，试份体积为50ml，硝酸盐氮含量为2．0mg／L时，其吸光度约0．7单位。

1．4 干扰水中含氯化物、亚硝酸盐、铵盐、有机物和碳酸盐时，可产生干扰。

含此类物质时，应作适当的前处理，以消除对测定的影响。

2 原理硝酸盐在无水情况下与酚二磺酸反应，生成硝基二磺酸酚，在碱性溶液中，生成黄色化合物，于410nm波长处进行分光光度测定。

3 试剂本标准所用试剂除另有说明外，均为分析纯试剂，实验中所用的水，均应用蒸馏水或同等纯度的水。

3．1 硫酸：ρ=1．84g／ml。

3．2 发烟硫酸(H2SO4·SO3)：含13％三氧化硫(SO3)。

注：(1)发烟硫酸在室温较低时凝固，取用时，可先在40-50℃隔水浴中加温使熔化，不能将盛装发烟硫酸的玻璃瓶直接置入水浴中，以免瓶裂引起危险。

(2)发烟硫酸中含三氧化硫(SO3)浓度超过13％时，可用硫酸(3．1)按计算量进行稀释。

3．3 酚二磺酸(C6H3(OH)(SO3H)2)。

称取25g苯酚置于500ml锥形瓶中，加150ml硫酸(3．1)使之溶解，再加75ml发烟硫酸(3．2)，充分混和。

瓶口插一小漏斗，置瓶于沸水浴中加热2h，得淡棕色稠液，贮于棕色瓶中，密塞保存。

注：(1)当苯酚色泽变深时，应进行蒸馏精制。

国家环境保护局1987-03-14批准 1987-08-01实施(2)无发烟硫酸时，亦可用硫酸(3．1)代替，但应增加在沸水浴中加热时间至6h，制得的试剂尤应注意防止吸收空气中的水分，以免因硫酸浓度的降低，影响硝基化反应的进行，使测定结果偏低。