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医疗用品中内毒素检测标准一、检测方法医疗用品中的内毒素检测应采用鲎试剂法。
鲎试剂法是一种利用鲎血变形细胞溶解物与内毒素产生凝集反应的检测方法，具有灵敏度高、特异性强的特点。
二、灵敏度要求内毒素检测的灵敏度要求应达到0.1 EU/ml或更低。
这意味着在每毫升医疗用品中，内毒素的含量应不超过0.1 EU。
三、准确性要求内毒素检测的准确性要求较高，误差率应不超过±20%。
同时，应采用已知浓度的标准品对检测方法进行校正，以保证检测结果的准确性。
四、特异性要求内毒素检测应具有良好的特异性，避免与其他物质发生交叉反应。
对于医疗用品中可能存在的其他成分，应在检测时进行特异性验证，以确保结果的可靠性。
五、重复性要求内毒素检测的重复性要求较高，应采用多份样品进行平行试验，并计算变异系数（CV）。
CV值应不超过20%，以保证检测结果的稳定性和可重复性。
六、线性范围内毒素检测的线性范围应满足医疗用品中内毒素含量的要求。
线性范围的下限应达到灵敏度要求，上限应根据实际需要确定，一般可达到10 EU/ml或更高。
七、稳定性要求内毒素检测试剂的稳定性要求较高，应在规定的有效期内使用。
同时，应定期对试剂进行质量检查，以保证检测结果的可靠性。
八、操作简便性内毒素检测的操作应简便易行，不需要特殊设备和技能。
在操作过程中，应严格按照说明书进行操作，避免误差和偏差。
九、试剂安全性内毒素检测试剂应安全可靠，不会对操作者和环境造成危害。
同时，试剂的储存和运输也应注意安全问题，防止意外事故的发生。
十、符合国家相关法规和标准医疗用品中内毒素检测标准应符合国家相关法规和标准的要求。
具体来说，应遵循国家食品药品监督管理总局发布的《医疗器械注册管理办法》、《医疗器械监督管理条例》等法规的要求，以及国家标准化管理委员会发布的相关标准。
同时，还应关注国际上的相关法规和标准，以便与国际接轨。
******有限公司标准操作规程目的建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。
适用范围所有原料、成品的细菌内毒素检查。
责任人QC检验员内容1 简述1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。
1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。
供试品检测时可使用其中任何一种方法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.3 本规范适用于凝胶法检查。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。
1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素******有限公司标准操作规程的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。
1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。
阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。
2实验材料及用具2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。
2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。
细菌内毒素的耐热性
我们知道细菌内毒素除了具有各种生物活性外，还具很强的耐热性，一般的高压灭菌不能使其灭活，需250℃30分钟以上的干热灭菌才能使其灭活，目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处理为180℃2小时或250℃30分钟以上，而日本药局方第十三改正为250℃1小时以上。
其它各国药典也大都如此，据国外文献报导，当对细菌内毒素的稀水溶液，在不同温度下保温处理后进行检测，发现其内毒素活性在200℃1小时时还能检测出来。
而只有当加热到250℃1小时才能完全灭活，国内细菌内毒素标准品的耐热情况虽然未能考察，但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用250℃1小时以上的干烤处理。
细菌内毒素的除去方法
由于细菌内毒素具有很强的耐热性，因此对于它的去除采用一般的灭菌方法是无法达到的，尤其是制药行业注射剂中内毒素的除去，对于临床用药的安全性意义重大，因此对于药品中内毒素去除可以使用过滤及高压灭菌方法，而对于一般水溶液，则普通采用薄膜过滤后高压法，对于实验中所用器具可使用干热或射线给予灭活，其它也可使用酸、碱破坏的方法。
对于细菌内毒素检查法中所用实验用具的外源性内毒素除去方法，最好采用250℃2hr以上的干热灭菌方法。
中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》――凝胶法凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理去检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用eu/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标注值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水熔化，在旋涡混合器上搅匀15分钟，然后做成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每吸收一步均应当在旋涡混合器上搅匀30秒钟。
抢分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复水溶性后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18两支，其中16管分别重新加入0.1ml相同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行搞4管；另外2管重新加入0.1ml细菌内毒素检查用水做为阴性对照。
将试管中溶液轻轻搅匀后，半封闭管口，横向放进37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
当最小浓度2λ管均为阳性，最高浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效率。
按下式排序反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测量值(λc).λc=1g-1(∑x/4)式中x为反应终点浓度的对数值（1g）。
反应终点浓度就是指系列递增的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
阻碍试验按表中1制取溶液a、b、c和d，采用的供试品溶液应属未检验出来内毒素且不少于最小有效率吸收倍数（mvd）的溶液，按鲎试剂灵敏度为丛藓科扭口藓核试验项下操作方式。
（85）细菌内毒素检查法✹本章内容已与《欧洲药典》和/或《日本药局方》相应的内容统一，不一致的部分用符号（✹✹）标记。
✹细菌内毒素检查法（BET）系利用鲎试剂（美洲鲎或中国益）检测或量化革兰阴性菌产生的细菌内毒素。
可采用三种技术进行细菌内毒素检查：基于凝胶形成的凝胶法；基于内源性底物裂解后浊度变化的比浊法；基于合成胁显色基质复合物裂解后发生颜色变化的显色法。
可采用上述任意一种方法进行检测。
当对测定结果有怀疑或争议时，除另有规定外，以凝胶法测定结果为准。
本法操作过程中应防止内毒素的污染。
器具应按照经过验证的程序将所有玻璃器皿和其他热稳定材料置于干热烤箱中去除热原。
✹①✹通常使用的最低温度和最短时间为250℃加热30分钟。
如果使用多孔板和微量加样器吸头等塑料器具时，只有证明其不含有可检出的内毒素并对试验无干扰方可使用。
（注：本章中的“管”包括微孔板中的孔等所有反应容器。
）试剂和试液试剂是由鲎（美洲鲎或中国鲎）的阿米巴细胞（白细胞）溶解产物制得的冻干品。
这种试剂必须是按照权威机构认定的规程生产的产品。
（注：除内毒素外，鲎试剂也与P葡聚糖反应。
通过消除G因子或抑制G因子反应系统，能够制得不与葡聚糖反应的鲎试剂，此种鲎试剂可用于葡聚糖存在情况下的内毒素检查。
）内毒素检查（BET）用水在检测限内不与鲎试剂产生凝集反应的注射用水或用其他方法制备的水。
鲎测试液将鲎试剂溶解于内毒素检查用水或鲎试剂生产企业推荐的缓冲液中，轻轻混匀。
复溶的鲎试剂须按照生产企业的规定冷藏或冷冻保存。
溶液的制备内毒素标准品贮备液使用经现行WHO国际内毒素标准品标定过的美国药典内毒素标准品配制内毒素标准品贮备液。
按照包装说明书和标签上的规定制备、贮存贮备液。
内毒素的单位用EU表示。
[注：1个美国药典内毒素单位（EU）等于1个国际内毒素单位（IU）]内毒素标准品溶液将内毒素标准品贮备液充分混匀后，用内毒素检查用水进行连续稀释。
为避免因内毒素的吸附而导致失活，配制后的稀释液应尽快使用。
内毒素检测方法一、内毒素的检测方法常用的检测内毒素的方法有以下几种：1.凝胶法：通过鲎试剂（鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等）与内毒素发生凝集反应产生凝固蛋白（凝胶）的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。
凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。
此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。
2.动态浊度法；浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
内毒素与鲎试剂中的凝固酶原激活呈凝固酶，凝固酶可使凝固蛋白原变成凝固蛋白（即产生凝胶），使液体的浊度发生变化，通过动态观察浊度变化速率检测。
3.终点显色法:通过由于细菌内毒素激活鲎试剂（鲎试剂中含有C 因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等）C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质（含N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐），使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。
同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。
根据产物颜色判断内毒素浓度，又称为比色法。
4.动态显色法:内毒素可激活鲎试剂引起一系列酶促反应，产生黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm），在一定时间内，动态观察对硝基苯胺（pNA）的生成量，与细菌内毒素浓度成正相关。
但此方法需要带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件。
5.其他检测方法：还有一些直接测定内毒素定量的方法如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫学方法（如火箭免疫电泳试验法、L-聚赖氨酸法、双抗体夹心法、荧光偏振法等）等，这些方法的特点是特异性、准确性高，但其应用尚待大量临床实践的验证，操作尚待进一步简化；还有一些间接测定的方法，如生物学方法利用LPS刺激免疫细胞产生IL-1、TNF，通过间接测定IL-1、TNF等细胞因子含量，推算出待检样本中的LPS含量；化学发光法：应用CR1和CR3受体诱导中性粒细胞的氧化反应作为一个反应平台，通过测定内毒素对中性粒细胞的生物学作用来检测内毒素的含量；流式细胞术：应用针对内毒素表面抗原决定簇的单克隆抗体对内毒素进行荧光标定而后应用流式细胞仪进行检测。
去内毒素的方法及检查方法
注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。
热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。
其中脂多糖具有很强的热原活性。
由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。
【相关链接】热原的危害
一、热原的性质及除去热原的方法
1．高温法
热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。
因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。
但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
2．吸附法
热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。
由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
3．超滤法
热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4．蒸馏法
热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。
5．酸碱法
热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。
玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。
6．其它
包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
二、热原的检查方法
《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
1．热原检查法
由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。
家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用
于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。
2．细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。
鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏1 0倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法
内毒素在体外的减毒在体外有多种理化和生物学方法可以使内毒素的毒性减低，这些方法可用来研究内毒素毒性的化学结构基础，或用于消除某些制剂的致热原（即内毒素）污染，或用以制备防治用的免疫制剂等。
（1）物理方法：紫外线、射线、超声波等可使内毒素毒性降低。
Fust 等（1977）报导，内毒素经γ射线照射后，其对小白鼠致死性、狗体内降压作用以及抗补体等活性降低，且其程度与射线照射剂量成正比。
经照射的脂多糖激活补体经典途径的能力减低，如经验
0megarads照射的脂多糖，激活补体几乎全通过替代途径。
如前所述，经典途径由类脂A激发，可见照射主要作用于类脂A。
Nerdar 等（1977）指出经照射类脂A中的β羟经肉豆蔻酸即消失，且认为照射可使内毒素变为类毒素。
Szilsgyi(1978)通过家兔实验比较，提出大肠杆菌内毒素经60Co电离照射后，引致白细胞和血小板减少及局部Shwartzman反应的能力均明显减低，而对纤维蛋白原和补体的影响较小。
（2）化学方法：用化学药品使内毒素减毒。
所用化学药品种类繁多，其机制有酸或硷的水解作用、酰化作用、脱酰化作用，转酯化作用、羟胺解作用以及氢化铝锂（LiAIH4）的还原作用等，上述作用主要影响内毒素类脂A的脂肪酸部分，如L iAIH4，使酯键断裂，经NaOH 处理，使内毒素脂肪酸皂化，发生分子的化学构型改变而减毒。
若再加入95%乙醇或80%二甲基亚砜可加速其皂化，故用0.03N NaOH 的95%乙醇处理葡聚糖凝胶，以去除污染的致热原，效果很好。
（3）生物学方法：业已证实多粘菌素B具有使内毒素减毒的功能。
多粘菌素B的阳离子氨基与内毒素类脂A的带负电荷的磷酸根结合，使内毒素失却多种生物学活性（包括致死性、致热性、抗补体的经典
途径、促分裂活性、激发单核细胞产生组织因子、对白细胞、血小板和巨噬细胞的激发作用以及对鲎珠溶解物的凝固能力等等）。
因此认为多粘菌素B为类脂A的抑制剂。
Craig等（1974）在实验狗体内证实多粘菌素B有抗脂多糖的活性，然而必须使用高毒性剂量，以致临术应用极为困难。
Corrigan等（1979）以出血败血性巴斯德菌造成家兔的内毒素血症的前或后给予多粘菌素B，均可减低血液中内毒素量，从而提高实验动物的存活率。
由于抗菌素中和毒素的作用与其抗菌作用互不相关，且该菌对多粘菌素B的抗菌作用不敏感，故实验动物经用多粘菌素B处理后，血培养仍为阳性。
人体革兰氏阴性菌感染的临床症状主要由内毒素血症所引起，因此着重研究体内内毒素的中和作用具有实用意义。
