人腺病毒分子生物学常用检测技术

分子生物学检验技术分子生物学检验技术是一种用于研究和分析生物分子如DNA、RNA和蛋白质的技术手段，广泛应用于生命科学研究、医学诊断、药物研发等领域。

它的发展给生物学和医学研究带来了革命性的变化，为人类健康和疾病治疗提供了重要手段。

分子生物学检验技术有多种方法，其中最常见的包括：聚合酶链反应（PCR）、核酸杂交、DNA测序、蛋白质电泳等。

这些技术在生物学研究和医学诊断中发挥着重要作用。

聚合酶链反应（PCR）是一种通过体外扩增DNA片段的技术。

它利用DNA聚合酶酶和引物，通过多次循环反应，在较短的时间内扩增出大量目标DNA片段。

PCR技术广泛应用于基因检测、病原体检测、遗传疾病筛查等领域。

核酸杂交是一种通过互补配对原理来检测目标序列的技术。

它利用标记的探针与待测样品中的目标DNA或RNA序列互相结合，通过检测探针的标记物来确定目标序列的存在与否。

核酸杂交技术广泛应用于基因表达研究、病原体检测、基因定位等领域。

DNA测序是一种确定DNA序列的技术。

它通过化学或物理方法对DNA 分子进行断裂、扩增和测序，最终确定DNA的碱基序列。

DNA测序技术是基因组学研究的重要工具，也是研究基因突变、病因分析等领域的基础。

蛋白质电泳是一种通过电场作用使蛋白质在凝胶中分离的技术。

它根据蛋白质的大小、电荷和结构差异，将混合样品中的蛋白质分离成不同的条带，从而实现对蛋白质的分析和检测。

蛋白质电泳技术广泛应用于蛋白质组学研究、疾病标志物筛查等领域。

除了上述常见的技术，分子生物学检验技术还包括许多其他方法，如基因芯片技术、原位杂交技术、蛋白质质谱等。

这些技术在不同领域有着特定的应用，为科学研究和医学诊断提供了更多的手段和思路。

分子生物学检验技术的发展不仅推动了科学研究的进展，也在医学诊断和治疗中发挥着重要作用。

例如，在基因检测中，通过分子生物学检验技术可以检测人体携带的致病基因，帮助人们了解自己的遗传状况，预防或早期干预遗传性疾病。

分子生物学检测技术简介分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。

近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。

1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA 体外扩增技术（Polymerase Chain Reaction, PCR），以及90年代发展起来的DNA芯片技术（DNA Chip），又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。

一、核酸分子杂交（一）概述：具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。

应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。

到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。

核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的DNA 或RNA，以及用于检测的DNA或RNA探针。

探针标记的好坏决定检测的敏感性。

1、Southern印迹杂交是最经典和应用最广泛的杂交方法。

根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。

2、Northern 印迹杂交基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。

由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。

3、斑点杂交将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。

该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。

一、无菌检查 (2)（一）薄膜过滤法 (3)（二）直接接种法 (3)二、支原体检查 (4)第一法细胞培养法 (4)第二法指示细胞培养法（DNA染色法） (5)三、细胞内、外源病毒因子检查 (7)1 细胞形态观察及红细胞吸附试验（简称血吸附试验） (7)2 不同细胞传代培养法检测病毒因子 (7)3 接种动物和鸡胚法检测病毒因子 (8)4 逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测 (8)1）逆转录酶活性测定 (8)2）透射电镜检查 (11)3）感染性试验 (11)5 特殊外源病毒因子的检测 (11)四、致瘤性检查 (11)五、感染效率和病毒的产量等的测定 (12)六、细胞鉴别（染色体检查） (12)七、病毒敏感性检查 (13)八、细胞功能检查 (13)九、重组腺病毒滴度的测定 (14)十、病毒比滴度（比活性IU）测定 (16)十一、E1A区、E2B区、AA V及插入基因的检测 (16)一）E1A区的检测 (16)二）E2B区的检测 (17)三）AA V的检测 (18)四）插入基因的检测 (18)十二、病毒外源因子检查 (19)十三、内毒素测定 (19)供试品溶液的制备 (19)确定最大有效稀释倍数（MVD） (20)方法1 凝胶法 (20)鲎试剂灵敏度复核试验 (21)干扰试验 (21)检查法 (23)十四效力试验插入基因表达活性测定，插入基因的生物学活性测定 (24)十五复制型病毒（RCA）检测A549细胞检测法 (24)十六腺相关病毒的检测采用PCR法 (26)十七残留量测定应根据生产工艺及成品的添加成份，对有潜在危险性的成份进行残留量检测： (27)1残余宿主DNA含量测定 (27)2残余牛血清白蛋白含量测定 (27)3残余核酸酶含量测定 (28)十八重组病毒制品的稳定性试验 (28)一、无菌检查《药典》（2010版第三部）附录ⅫA无菌检查法①试验材料1、细胞培养上清液2、硫乙醇酸盐流体培养基酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g氯化钠 2.5g L-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸）0.5g (0.3ml）琼脂0.75g 水1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。

1、分子生物学检验技术：是以核酸或蛋白质为分析材料，通过分析基因的结构、表达的变化和由此而导致的基因功能的改变,为疾病的研究和诊断提供更准确、更科学的信息和依据的一门学科。

2、请说明分子生物学检验技术在临床试验诊断中的应用。

（1）感染性微生物的检测.如:用PCR技术进行甲型肝炎病毒的检测、乙型肝炎病毒的检测和解脲脲原体的检测等. （2)基因突变的检测.如：用PCR一限制性片段长度多态性（RFLP）技术检测地中海贫血基因突变。

（3）法医学检测。

如:用PCR微卫星检测技术进行亲子关系的鉴定和个体识别。

（4）基因异常表达的检测。

如：用cDNA表达的芯片技术进行基因异常表达的检测。

（5）基因定位。

如：用原位杂交技术进行组织与细胞中基因表达的定位。

3、基因组：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。

4、基因:是基因组中一个功能单位,是贮存有功能的蛋白质多肽链信息或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。

5、原核生物：是细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和蓝绿藻等原始生物的总称，是最简单的细胞生物体。

6、操纵子结构：是原核生物基因组的功能单位.7、质粒:是指细菌细胞染色体外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。

8、转座因子：又称为转座元件,是一类在细菌染色体、质粒和噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列.9、原核生物基因组的结构特征：(1）原核生物基因组通常仅由一个DNA分子构成，基因组中只有一个复制起点，具有类核结构。

（2）具有操纵子结构，模板mRNA为多顺反子mRNA。

编码区远远大于真核生物基因组，但又远远小于病毒基因组。

在基因组中存在多功能的识别区域，如复制起始区、转录启动区和终止区等，这些区域常常含有反向重复序列.（3）结构基因通常为单拷贝基因，编码顺序一般不重叠。

(4）具有编码同工酶的基因.（5)含有可移动的DNA序列。

10、病毒基因组的结构特点：（1）与细菌和真核生物基因组相比,病毒基因组结构简单，基因数少，所含信息量也少。

分子生物学检查的方法及在血液学中的应用1．分子生物学检查的方法血液分子生物学检验技术主要包括PCR技术、DNA测序技术、限制性片段长度多态性（RFLP）、转基因技术及基因芯片（DNA-chip）技术等分子生物学技术。

目前这些技术已应用于血液病基因分析、基因诊断、白血病分型、指导治疗、判断预后和微小残留病检测等方面。

2．分子生物学检查在血液学中的应用（1）恶性血液病融合基因的检测白血病染色体相互易位是导致染色体重排的最常见原因。

染色体重排在分子水平上常形成融合基因。

重组产生的融合基因及其融合蛋白是疾病的特异性分子标志。

融合基因检测对疾病的诊断、分型、治疗方案的选择、预后判断及微小残留病的检测都有重要的意义。

慢性粒细胞白血病(CML)Ph 染色体易位的后果是使位于9q34上的ABL原癌基因易位至22q11的BCR基因上，形成BCR-ABL融合基因，表达一个具有高酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，后者是CML发病的分子基础。

急性早幼粒细胞白血病(APL)特异性染色体易位是t(15；17)(q22；q21)，易位的结果使15号染色体的PML原癌基因与17号染色体上的维甲酸受体a(RARa)基因融合产生PML-RARa融合基因。

临床上变异型APL（M3v，M3b）与急性粒细胞白血病部分分化型(M2)较难鉴别，M2的t(8；21)可产生一种融合基因AML1-ETO，这种融合基因在M2中的发生率为20％-40％，在M2b中可达90％，通过融合基因的检测可准确鉴别这两种白血病。

融合基因的检测对治疗方案的选择有明确的指导作用，在ATRA和化疗达完全缓解(CR)的M3，PML-RARa融合基因阳性者极易在十个月内复发，而融合基因阴性者，复发率低。

（2）免疫球蛋白重链（IgH）基因和T细胞受体（TCR）基因重排的检测IgH和TCR的编码基因具有多态性。

IgH基因重排是产生个体多样性和独特性的主要原因。

由于白血病细胞源于造血干细胞，所以白血病细胞是单克隆性的。

腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染一、包装1.包装细胞详情见AD-293 Cells.pdf，AdEasy? Adenoviral Vector System.pdf（P31-P32）2.细胞转染方法一、详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P28-P29）C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf3.病毒收集详情见AdEasy? Adenoviral Vector System.pdf（P34）二、扩增详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P29-P30）三、纯化(i) 病毒上清（接一、包装3.病毒收集）.(ii) Add 51 ml of a 50% PEG 6000 solution.(iii) Add 21.7 ml of a 4 M NaCl stock solution.(iv) Add 23.3 ml of PBS. This will result in a final volume of 300 ml. The final PEG 6000 concentration will be 8.5% and the final NaCl concentration will be B0.3 M.(v) Distribute the sample as 150-ml aliquots in two 250-ml polypropylenewide-mouthed bottles.(vi) Store the bottles at 4 1C for 1.5 h. Mix contents every 20–30 min.(vii) Centrifuge bottles at 7,000g for 10 min at 4 1C using a Beckman fixed-angel JLA-10.500 rotor.(viii) After centrifugation, a white pellet should be visible.(ix) Carefully decant the supernatant and add 1.2 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, perbottle. Resuspend the pellets byvigorously pipetting liquid up and down.(x) Vortex the bottles vigorously for 20–30 s to further resuspend the pellets.(xi) Transfer the vector suspension into screw-cap microfuge tubes in aliquots of 100 ml.(xii) Snap-freeze the tubes in crushed dry ice and store at -80 。

腺病毒载体工艺平台介绍腺病毒载体是一种常用的基因传递工具，被广泛应用于基因治疗和基因工程研究领域。

为了应对不同研究需求和提高载体表达效率，许多研究人员和企业建立了腺病毒载体工艺平台，以帮助加速基因传递和基因治疗的研究进展。

腺病毒载体工艺平台是一种综合的研究和生产系统，主要包括以下几个方面：1. 载体构建：利用分子生物学技术，将感兴趣的基因序列插入腺病毒基因组的合适位点。

在载体构建过程中，可以根据需要选择不同的载体类型、启动子、响应元件等，以调控基因的表达水平和时机。

2. 载体包装：通过与辅助质粒（helper plasmid）共转染细胞，使细胞内形成完整的腺病毒基因组，并通过细胞内重组事件来复制和包装腺病毒颗粒。

载体包装的过程中，通常需要参考文献中的方法和优化步骤，以获得高效的包装效率。

3. 病毒扩增：将包装好的腺病毒载体接种到适宜的宿主细胞中，通过培养和扩增过程，使腺病毒繁殖并增加至足够的浓度。

扩增过程中要注意控制细胞的生长状态、感染剂量和细胞培养条件，以获得高产量和活性的腺病毒。

4. 病毒纯化：通过离心、超滤和柱层析等技术手段，从扩增培养物中纯化腺病毒颗粒。

纯化过程中，可以采用单步或多步骤的方法来去除杂质、浓缩和提纯腺病毒。

5. 固定化：对腺病毒进行固定化处理，可用于获得更稳定、可储存和长期使用的腺病毒制剂。

常用的固定化方法包括酶解固定化、化学固定化、冻干固定化等。

6. 质量检测：对纯化的腺病毒产品进行质量鉴定，包括病毒滴度测定、细胞感染测定、基因表达水平测定等。

同时，还可以进行病毒颗粒观察、基因序列测定、重组蛋白表达等验证实验。

腺病毒载体工艺平台的建立有助于提高基因治疗和基因工程研究的效率和可靠性。

通过系统、规范和高效的工艺流程，可以大幅度减少研究人员在载体构建、病毒包装和纯化等环节上的工作量，同时提高腺病毒的产量和纯度。

这为基因治疗的临床应用以及基因工程研究提供了可靠的技术支持。

腺病毒载体工艺平台是基因治疗和基因工程研究中不可或缺的一部分。

检验科常见分子生物学检测方法与解读分子生物学检测方法是现代医学检验科技中不可或缺的一部分，在疾病诊断、预后评估、治疗效果监测等方面发挥着重要的作用。

本文将介绍几种常见分子生物学检测方法，并解读其结果的意义。

一、PCR（聚合酶链反应）PCR是一种体外扩增DNA的方法，可以在短时间内快速复制DNA，从而达到检测基因、病原体等目的。

PCR主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。

通过引物和DNA聚合酶的作用，可以在样本中扩增目标片段。

PCR结果通常以荧光信号表示阳性或阴性，用于检测病原体、基因突变等。

二、实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR是PCR的一种改进方法，可以精确计量PCR反应产生的DNA量。

通过在PCR反应体系中加入荧光探针，利用荧光信号的增强与反应产物DNA量的增加成正比关系，从而实现DNA的定量检测。

实时荧光定量PCR广泛应用于检测病原体、基因表达水平等领域。

三、核酸杂交核酸杂交是一种基于互补配对的分子识别方法。

通过采用标记的探针与待检测样品中的目标序列发生互补配对，并利用标记物的检测手段检测信号，可以实现对目标序列的检测。

核酸杂交广泛应用于基因型鉴定、病原体检测等领域。

四、蛋白质电泳蛋白质电泳是一种常用的蛋白质分离和定量方法。

通过将待测样品中的蛋白质经过电泳分离，可以获得一条包含不同大小蛋白质的蛋白条带。

根据蛋白条带的相对迁移距离和分子质量，可以分析样品中蛋白质的组成和含量，用于血清蛋白分析、肿瘤标志物检测等。

五、蛋白质质谱蛋白质质谱是一种高通量的蛋白质分析技术，可以通过测量蛋白质分子的质量和序列来鉴定和定量蛋白质。

蛋白质质谱常用的方法包括质谱分析和液相色谱质谱联用技术。

通过蛋白质质谱分析，可以深入了解蛋白质的组成、修饰以及功能，广泛应用于蛋白质组学研究和生物标记物检测等领域。

以上介绍的是几种常见的分子生物学检测方法，它们在疾病检测与诊断中发挥着重要的作用。

当然，在实际应用中，分子生物学检测结果的解读也是至关重要的。

临床医学检验：分子生物学检验技术1、多选对核酸一蛋白质杂交实验的描述，正确的是()A．又称为Southwestern杂交B．可鉴定蛋白质与DNA的特异结合C．可以大概确定结合蛋白质的分子量D．该技术（江南博哥）最先由中国人应用E．蛋白质-DNA复合物经紫外线照射后可分离正确答案：A, B, C2、单选?女，45岁，由于低热、盗汗、感冒、咳嗽并带血丝入院。

实验室检查：痰普通培养无致病菌生长；X片见肺纹理增粗，肺门有发光点状物。

初步考虑为()A．矽肺B．肺结核C．肺出血D．COPDE．肺炎正确答案：B3、单选Southern印迹的DNA探针可与以下何种成分杂交()A．只与完全相同的片段B．可与任何含有相同序列的DNA片段C．可与任何含有互补序列的DNA片段D．可与用某些限制性内切核酸酶切成的DNA片段E．以上都是正确答案：C4、单选编码蛋白质都能与GTP结合的癌基因家族为()A．mybB．mycC．sisD．rasE．erb正确答案：D5、判断题蛋白质的溶解度随温度的增高表现为增加()正确答案：错6、单选下列哪些基因以典型的串联形式存在于真核生物基因组()A．球蛋白基因B．组蛋白基因C．rRNA基因D．肌动蛋白基因E．线粒体基因正确答案：B7、名词解释核酸分子杂交正确答案：单链的核酸分子在合适的温度和离子强度下，通过碱基互补形成双链杂交体的一类技术。

8、配伍题断裂基因指()假基因指()A．由不连续的几个编码序列组成的基因B．一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA和一条多肽链C．编码与生物氧化有关的一些蛋白质和酶的基因D．失去表达活性的基因E．基因家族成簇地分布在某一条染色体上，可同时合成某些蛋白质正确答案：A,D9、单选?男，45岁，发现有动脉硬化症状。

查体：见角膜有老年性色素环。

查血：TC12.00mmol/L，TG2.6mmol/L。

如果需要进一步确诊并明确病因，需要进行()A．VLDL基因检测B．查找家族遗传史C．CETP基因检测D．ApoB基因分型E．LDL基因检测正确答案：D10、名词解释DNA芯片正确答案：DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。

人类腺病毒分子生物学研究进展及病毒治疗人类腺病毒是一种常见的呼吸系统病毒，它可以引起婴儿和幼儿的上呼吸道感染。

尽管腺病毒感染通常不会导致严重的健康问题，但仍然有一些人会出现严重症状，例如肺炎、支气管炎等。

为了防止儿童患上腺病毒感染，人们经常会接种腺病毒疫苗。

然而，由于该病毒有多种变异株，目前的疫苗并不能涵盖所有的变异株。

因此，对人类腺病毒分子生物学的研究至关重要，这将帮助科学家更好地理解该病毒的特性，从而开发更有效的治疗方法。

一、人类腺病毒的分子生物学研究进展人类腺病毒属于腺病毒科，是一种非常小的病毒，其大小大约为20-30纳米。

尽管它的尺寸很小，但该病毒的体内基因组却非常大，其基因组长约30kb。

根据研究，人类腺病毒的基因组中含有31个基因，其中28个是编码蛋白质的基因，剩下的3个则是非编码RNA基因。

在分子生物学研究中，科学家发现，人类腺病毒的核心部分由四种结构蛋白组成，这四种蛋白分别是：VP1、VP2、VP3和VP4。

其中，VP1、VP2和VP3蛋白对于病毒的抗原性非常重要，病毒的一些变异也是由于这三种蛋白的突变引起的。

此外，人类腺病毒的分子生物学研究还揭示了该病毒的复制机制。

具体来说，人类腺病毒需要依赖于细胞内的一些分子才能够进行复制。

首先，它必须将其基因组导入宿主细胞内，使其与细胞核融合。

然后，病毒基因组中的mRNA会通过转录和翻译被转化为蛋白质。

最终，这些蛋白质会合成新的病毒颗粒，进而释放入细胞外界。

二、病毒治疗的发展除了研究人类腺病毒的分子生物学特性外，科学家还在尝试开发针对该病毒的病毒治疗方法。

病毒治疗是一种利用病毒技术来治疗疾病的方法，与传统的药物治疗相比，它具有更准确的作用、更低的毒副作用等优点。

下面将介绍一些目前正在研究的腺病毒病毒治疗方法。

1.利用基因工程技术改良病毒近年来，随着基因工程技术的发展，科学家开始研究利用该技术来改造人类腺病毒的基因组，以使其成为更为安全和有效的病毒疫苗。

分子生物学常用检测技术分子生物学是一门研究生物体内分子互动和功能的科学，其研究领域涵盖了基因组学、蛋白质组学、转录组学、代谢组学等。

这些领域的研究需要借助各种检测技术来实现，以下是几种常用的分子生物学检测技术。

1、基因测序技术：基因测序技术是测定DNA序列的技术，它可以直接读出基因序列，是分子生物学研究的重要工具。

基因测序技术可用于基因组学研究，解析物种的基因组结构和功能，也可以用于疾病的诊断和治疗。

2、聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种用于快速、灵敏地扩增特定DNA片段的分子生物学技术。

通过PCR，我们可以将微量的DNA片段进行数百万倍的扩增，从而可以进行后续的分析和检测。

PCR技术广泛应用于基因克隆、突变分析、疾病诊断等领域。

3、生物芯片技术：生物芯片是一种高密度DNA阵列技术，可以同时对大量基因进行检测和分析。

生物芯片技术可用于基因表达谱分析、基因多态性研究、疾病预测和诊断等。

4、质谱技术：质谱技术是一种用于分析生物样品中分子质量和组成的技术。

通过质谱技术，我们可以对蛋白质、多糖、脂质等生物分子进行定性和定量分析。

质谱技术广泛应用于蛋白质组学研究、药物发现、疾病诊断等领域。

5、细胞荧光染色技术：细胞荧光染色技术是一种用于观察细胞内生物分子活性的技术。

通过荧光染料对目标分子进行标记，我们可以在显微镜下观察到细胞内分子的分布和活性。

细胞荧光染色技术广泛应用于细胞信号转导、药物筛选等领域。

以上仅是分子生物学领域中的几种常用检测技术，实际上还有许多其他的实验技术和方法如核磁共振技术、双向电泳、免疫沉淀等等，这些技术的发明和发展都为分子生物学的研究提供了强有力的支持。

各种技术的选择和使用主要取决于研究目的和研究样本的类型。

随着科学技术的发展，未来的分子生物学检测技术将更加灵敏、高效和个性化。

分子生物学常用技术及其应用分子生物学是一门研究生物大分子结构和功能的科学，包括DNA、RNA 和蛋白质等。

ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２１．０２．０１·专家论坛·分子生物学技术在感染性疾病诊断中的应用进展 作者简介：吕晶南，１９８９年生，女，技师，硕士，从事临床微生物检验工作。

通信作者：余方友，主任技师，博士研究生导师，博士，Ｅ ｍａｉｌ：ｗｚｊｘｙｆｙ＠１６３．ｃｏｍ。

吕晶南１，余方友２（１．苏州大学第二附属医院检验科，江苏苏州２１５００４；２．同济大学附属上海市肺科医院检验科，上海２０００８２）摘要：临床常见病原菌的检测方法中，传统的病原菌分离培养及表型鉴定方法检测周期耗时长，且操作繁琐、敏感性低、特异性差。

相比这下，分子诊断技术可有效弥补传统方法的不足，尤其是２０１９新型冠状病毒（２０１９ ｎＣｏＶ）的暴发，使分子生物学理论和技术飞速发展并得到广泛应用，对指导临床预防、诊断、治疗及疗效评价起到重要的作用。

该文从呼吸道感染、中枢神经系统感染、血流感染及胃肠道感染４个方面系统化介绍核酸检测技术在病原体鉴定中的应用，同时阐述这些方法在临床实验室应用时可能遇到的挑战和机遇。

关键词：分子生物学技术；分子诊断技术；感染性疾病；病毒中图分类号：Ｒ４４６．５ 文献标志码：Ａ ２０１９新型冠状病毒（２０１９ ｎＣｏＶ）的暴发，使分子生物学技术在临床感染性疾病诊断、治疗、疗效评价及预防等方面得到前所未有的重视和飞速发展。

本文就近年来基于核酸检测技术鉴定病原体进行系统化讨论，同时也对这些方法在临床实验室应用时可能遇到的挑战和机遇进行阐述。

１　呼吸道感染１．１　病毒　呼吸道病毒的感染对全球流行病公共卫生可引起严重的威胁，如１９１８年甲型流感大流行，２００３年严重急性呼吸系统综合征（ＳＡＲＳ）冠状病毒暴发，２００９年甲型Ｈ１Ｎ１流感引起的大流行，２０１２年阿拉伯半岛出现由冠状病毒引起的中东呼吸综合征（ＭＥＲＳ），２０１９年２０１９ ｎＣｏＶ的暴发。

值得注意的是，仅基于体征和症状区分病毒来源较困难，同时不同病毒感染采取的治疗方案不同，因此，呼吸道病毒对人类健康构成严重威胁［１］。

呼吸道合胞病毒和腺病毒检测与分型首都儿科研究所 邓洁大家好！下面我跟大家交流一下呼吸道合胞病毒和腺病毒的检测与分型方法。

呼吸道合胞病毒是属于副粘液病毒科的一种RNA病毒。

它是造成世界范围内婴幼儿下呼吸道病毒性感染最常见的原因之一，特别是2 — 6个月的小婴儿在感染呼吸道合胞病毒以后常常可以发生严重的毛细支气管炎和肺炎。

另外呢它还是引起老年人慢性支气管炎加重以及免疫损伤患儿下呼吸道感染的重要病原。

呼吸道合胞病毒最早是在1956年在伴有感冒症状的猩猩体内分离到的。

在1957年又从患有下呼吸道疾病婴儿的鼻咽分泌物中分离到，由于它在细胞中可以引起细胞融合病变，所以呢就根据它在组织培养中的细胞病变特征呢命名为呼吸道合胞病毒。

呼吸道合胞病毒呢它是由包裹负链RNA的核衣壳和包膜组成，其RNA全长为15225个核苷酸，编码10个蛋白。

其中呢G蛋白和F蛋白呢是位于病毒颗粒的表面，是呼吸道合胞病毒的主要糖蛋白。

呼吸道合胞病毒的抗原变异，在70年代应用动物高价免疫血清的交叉中和试验即证明呼吸道合胞病毒毒株之间存在着细微的差异。

在80年代随着特异的呼吸道合胞病毒单克隆抗体的应用，发现呢在G蛋白、F 蛋白、P蛋白以及N蛋白等蛋白上存在着抗原的变异性。

呼吸道合胞病毒亚型有什么差异呢？我们说呼吸道合胞病毒分为两个亚型A和B，它们的主要区别呢，主要是在于G、F、N、P蛋白上的抗原组成不同，其中G蛋白的可变性最高。

A和B亚型G蛋白之间仅存在5%的抗原相关性，而F蛋白则接近50%。

在氨基酸水平上，A和B亚型G蛋白只有53%的同源性，而F蛋白则为89%。

那么呼吸道合胞病毒亚型与反复感染有什么关系呢？我们说由于G蛋白是激发机体产生保护性抗体最主要的病毒抗原之一，而不同亚型呼吸道合胞病毒G蛋白激发机体产生的保护性抗体呢，不能有效地提供亚型间的交叉保护作用。

所以亚型的存在呢可能是同呼吸道合胞病毒的反复感染有关。

那么呼吸道合胞病毒A、B亚型的致病性又有哪些区别呢？这都是一些文献的报道，有一些文献报道呢，说A亚型呼吸道合胞病毒呢具有较强的致病性。

常见的分子生物学检验技术常见的分子生物学检验技术包括PCR、Western blot、Northern blot、Southern blot、DNA测序等。

PCR（聚合酶链式反应）是一种能够在试管中扩增DNA片段的技术。

它利用DNA聚合酶酶活性的特性，通过不断重复的循环反应，在体外合成大量的目标DNA。

PCR技术广泛应用于基因重组、基因突变检测、DNA测序等领域。

Western blot是一种分析蛋白质表达的常用技术。

它可以通过将蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并使用特异性抗体检测目标蛋白质的存在和数量。

Western blot技术在生物医学研究中常用于研究蛋白质的变化、鉴定蛋白质亚型等。

Northern blot是一种检测RNA表达的方法，类似于Western blot。

它可以在RNA样品中检测特定的RNA序列，并用于研究基因表达调控、寻找新的RNA转录本等。

Northern blot技术已被更先进的技术如RT-PCR取代，但在某些特定情况下仍然有其应用价值。

Southern blot是一种检测DNA序列的技术。

通过将DNA片段在电泳中分离，然后用特异性探针与目标DNA结合，可以检测特定的DNA序列。

Southern blot技术在基因组学研究中常用于检测基因突变、DNA重组等。

DNA测序是一种确定DNA序列的技术，也是分子生物学中最重要的技术之一。

通过测序反应和测序仪的分析，可以准确地确定DNA 的碱基序列。

DNA测序技术在基因组学、遗传学、进化生物学等领域中有广泛的应用，为科学家们提供了大量的基因信息。

除了以上几种常见的分子生物学检验技术，还有一些衍生的技术，如RT-PCR、荧光定量PCR、原位杂交等。

RT-PCR是一种能够通过逆转录将RNA转化为DNA，并在PCR反应中扩增的技术，常用于研究基因表达调控。

荧光定量PCR是一种在PCR反应中利用荧光信号定量检测DNA或RNA的技术，具有高灵敏度和高特异性。