线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性检测试剂盒说明书 50T 24S 可见分光光度法

纯化线粒体呼吸控制率（RCR）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途纯化线粒体呼吸控制率（RCR）定量检测试剂是一种旨在通过极谱法检测系统（polarographic system）测定新鲜活体线粒体在ADP存在（III态呼吸）与否（IV态呼吸）的情况下溶解氧（dissolved oxygen）的消耗差异，即呼吸控制率（RCR），以评价线粒体结构和功能完整性以及氧化磷酸化效率的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。

可以被用于线粒体生理功能和药物作用机制等的研究。

产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景线粒体是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心。

电子传递和ATP合成通过质子梯度偶联成一体。

线粒体结构完整，功能正常，底物充分，电子传递形成的质子梯度不断被消耗，电子得以顺畅传递，氧气快速消耗，其耗氧率大，为III态呼吸。

ADP耗竭，质子梯度不能消耗，阻碍电子传递，氧气消耗减少，为IV态呼吸。

呼吸控制率（respiratory control ratio或respiratory control index；RCR），又称呼吸调节比，是指III态（加入ADP）的呼吸速率与IV态（ADP耗竭）的呼吸速率之比。

正常线粒体的RCR为3至10：RCR降低意味着线粒体ATP 合成功能损伤，呼吸障碍；RCR增高意味着细胞活动旺盛，代谢加快。

产品内容介质液（Reagent A）毫升态底物液（Reagent B）微升态底物液（Reagent C）微升产品说明书 1份保存方式保存在－20℃冰箱里，有效保证6月用户自备CLARK氧电极仪：用于测定溶解氧浓度实验步骤实验开始前，制备好新鲜的线粒体置于冰槽里备用；同时将－20℃冰箱里的试剂融化，并预热氧电极仪到25℃。

然后进行下列操作。

1．加入xx毫升介质液（Reagent A）到反应玻璃槽2．使用微型磁力子搅拌，充分混匀3．密封反应槽4．开始记录氧浓度：起始饱和氧浓度值为0.240微摩尔分子氧/毫升（25℃）5．持续记录1分钟后，注射加入xx微升待测的线粒体（总量2毫克）（注意：氧浓度可能瞬时增加5％）6．持续记录1分钟后，注射加入xx微升态底物液（Reagent B）――开始IV态呼吸（注意：参见注意事项9）7．持续记录2分钟：出现氧浓度缓慢下降）（8．继续注射加入xx微升态底物液（Reagent C注意：氧浓度在10秒钟内开始下滑）――开始III态呼吸（注意：参见注意事项9）9．持续记录直至出现线性下行斜线出现拐点10．分别测算III态呼吸速率和IV态呼吸速率：氧浓度降低值÷实际时间（分钟）11．计算呼吸控制率：III态呼吸速率÷IV态呼吸速率注意事项1．本产品为20次操作2．操作时，须戴手套3．确保反应玻璃槽洁净，密闭，以免氧气流入4．线粒体样品须新鲜制备，建议不要冻存；制备的线粒体膜须完整，非常重要；建议使用GENMED线粒体分离试剂盒－GMS10006.15．注射加入反应槽时，避免气泡和空气注入6．避免乙醇污染；乙醇增加氧浓度；如果底物或抑制剂须使用乙醇溶解，则加注10微升7．保持反应槽温度恒定，温度降低，氧浓度升高8．反应液充分混匀，和环境氧保持平衡9．加注态底物液（Reagent B）和态底物液（Reagent C）前，须充分冻融和混匀10．严格按照规定加注试剂，切莫增加加注试剂容量11．本公司提供系列线粒体检测试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感。

BC0310 -- 第 1 页，共 4 页辅酶Ⅰ NAD(H)含量检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号: BC0310规格: 50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件酸性提取液液体15 mL×1瓶2-8℃保存碱性提取液液体15 mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体20 mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体6 mL×1瓶2-8℃保存试剂三液体16mL×1瓶2-8℃保存试剂四液体3 mL×1瓶-20℃保存试剂五液体40 mL×1瓶2-8℃保存试剂六液体75 mL×1瓶（自备）常温保存NAD 标准品粉剂×1支-20℃保存NADH 标准品粉剂×1支-20℃保存溶液的配制：1、试剂三：需要严格避光；2、试剂六：72 mL乙醇和3 mL 蒸馏水混合，备用；3、NAD 标准品：临用前加入1.5 mL 蒸馏水，即2 µmol/mL ，将其稀释为1.25 nmol/mL 的NAD 标准溶液备用；4、NADH 标准品：临用前加入1.4 mL 蒸馏水，即2 µmol/mL ，将其稀释为1.25 nmol/mL 的NADH 标准溶液备用。

产品说明：辅酶I 包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。

氧化型辅酶I 又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。

中间产物会将脱下的氢递给NAD ，使之成为NADH （还原型辅酶I ）。

而NADH 则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成ATP 。

NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。

植物根系活力检测试剂盒（TTC法）说明书可见分光光度法货号：BC5270规格：50T/24S溶液的配制：1、试剂一：临用前取一瓶试剂一B加入一瓶试剂一A中，加入30mL试剂二溶解。

现用现配。

配制好后置于2-8℃保存，一周内使用，若出现红色，则不能使用。

2、试剂四：乙酸乙酯，自备。

提供一60mL棕瓶3、标准品：临用前加入1mL试剂二，充分震荡混匀, 即10mg/mL TTC标准液。

2-8℃可以保存1周，若出现红色，则不能使用。

产品说明：根系是植物吸收水分和矿质营养的主要器官，同时又是植物体中重要物质如氨基酸、激素等物质合成、同化、转化的器官，因此根的生长情况和活动能力直接影响植物个体的生长情况、营养水平和产量水平等，根系活力具有重要的实际意义。

TTC可被氢还原成不溶性的红色三苯基甲臜（TTF），TTF在485nm处有吸收峰。

当TTC溶液渗入到植物根部组织时，呼吸过程产生的还原物质可将其还原成TTF(红色)，植物根部组织被染成红色。

根系活力强弱可用TTC 的还原量来表示。

此方法检测的根系活力即植物根系的脱氢酶活性。

reducing substancesTTC TTF（485nm）注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、乙酸乙酯，冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）样本的制备：将根部组织洗净，去除根上的泥土，轻轻擦干，不要过分挤压破坏根系细胞。

二、测定步骤1、可见分光光度计预热30min以上，调节波长至485nm，可见分光光度计用乙酸乙酯调零。

2、标准溶液的稀释：（1）临用前取10μL 10mg/mL TTC标准液，加入1990μL试剂二，充分混匀，配制成50μg/mL TTC标准溶液，现用现配。

线粒体呼吸链复合物I活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途线粒体呼吸链复合物I（NADH－辅酶Q还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同功类似物和特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。

其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－辅酶Q还原酶的特异性活性检测。

其用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。

产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景线粒体呼吸链复合物I，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q还原酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase；NADH-CoQ reductase），又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是线粒体电子传递链中最大的结构成分：含有30至40多个多肽结构。

其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的NADH－辅酶Q还原酶（NADH:Q Reductase）。

复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的第一步。

基于辅酶Q底物，在鱼藤酮存在与否的情况下，通过NADH－辅酶Q还原酶的催化，转化成还原型泛醌（CoQH2），同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），在分光光度仪下产生吸收峰值的变化（340nm 波长），由此定量测定NADH －辅酶Q还原酶的特异活性。

线粒体呼吸链复合物I活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途线粒体呼吸链复合物I（NADH－辅酶Q还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同功类似物和特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。

其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－辅酶Q还原酶的特异性活性检测。

其用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。

产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景线粒体呼吸链复合物I，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q还原酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase；NADH-CoQ reductase），又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是线粒体电子传递链中最大的结构成分：含有30至40多个多肽结构。

其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的NADH－辅酶Q还原酶（NADH:Q Reductase）。

复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的第一步。

基于辅酶Q底物，在鱼藤酮存在与否的情况下，通过NADH－辅酶Q还原酶的催化，转化成还原型泛醌（CoQH2），同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），在分光光度仪下产生吸收峰值的变化（340nm 波长），由此定量测定NADH －辅酶Q还原酶的特异活性。

线粒体复合体Ⅲ活性检测试剂盒使用说明微量法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定货号:BC3245规格：100管/96样产品内容：试剂一：液体100mL×1瓶，-20℃保存；试剂二：液体20mL×1瓶，-20℃保存；试剂三：液体1.5mL×1支，-20℃保存；试剂四：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂五：粉剂×1支，-20℃保存；试剂六：液体2.5mL×1瓶，-20℃保存；产品简介：线粒体复合体Ⅲ（EC1.10.2.2）又称CoQ-细胞色素C还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素C。

与氧化型细胞色素C不同，还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。

试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：(1)准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

(2)将匀浆600g，4℃离心5min。

(3)弃沉淀，将上清液转移至另一离心管中，11000g4℃离心10min。

(4)上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄露的复合体Ⅲ（此步可选做）。

(5)步骤（4）中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20%或200W，超声3秒，间歇10秒，重复30次），用于复合体Ⅲ酶活性测定。

二、测定步骤：1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2.样本测定（1）工作液的配制：临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂4℃可保存一周；（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、25μL试剂六和200μL工作液，立即混匀，记录550nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

线粒体呼吸链复合体活性检测相关研究⼀、线粒体呼吸链简介：线粒体呼吸链，在⽣物细胞中，接受代谢物上脱下的氢（或电⼦）的载体有三种—— NAD+、NADP+和FAD。

其中NADPH不进⼊呼吸链合成ATP，⽽是作为⽣物合成的还原剂；只有NADH和FADH2进⼊呼吸链。

⼆、线粒体呼吸链传递体顺序呼吸链中的电⼦传递有着严格的⽅向和顺序，即电⼦从氧化还原电位较低的传递体依次通过氧化还原电位较⾼的传递体逐步流向氧分⼦递氢体与电化学梯度的建⽴。

三、线粒体呼吸链复合体呼吸作⽤是⽣物体内zui基础的能量代谢活动之⼀，是由位于线粒体内膜上的四种呼吸链蛋⽩复合物分步完成的，这四种蛋⽩复合物分别为复合物 I（NADH 脱氢酶）、复合物 II（琥珀酸-辅酶 Q 还原酶）、复合物 III（细胞⾊素 c 还原酶）和复合物 IV（细胞⾊素 c 氧化酶）。

四、线粒体呼吸链复合体的⽣物学意义据统计，约有30-40%线粒体病是由于线粒体呼吸链酶复合体缺陷所致，通常采⽤线粒体基因组分析与线粒体呼吸链酶活性检测相结合的⽅式予以确诊。

帕⾦森病（Parkinson’s disease, PD）、亨廷顿舞蹈病（Huntington's disease，HD）等神经退⾏性疾病的线粒体功能障碍和能量代谢异常已成为当今共识的早期病理现象, Cardellach研究表明PD患者线粒体复合体I、IV酶活性功能受损； Lambert MP研究证明线粒体机能障碍在HD发病机制中扮演着重要⾓⾊，其线粒体复合体II酶活性丢失，铁硫中⼼和FAD两个亚基表达降低。

线粒体呼吸链复合体I/II/III/IV/V的结构和功能已被⼴泛研究。

⽬前临床上以营养⽀持对症治疗复合体缺陷或酶活性异常，从⽽改善患者症状及延缓病情发展，然⽽其确切的发病机制和特异性治疗⽅法仍亟待解决。

五、电⼦传递链相关研究⼯具CheKine™线粒体呼吸链复合体Ⅰ-Ⅴ活性检测试剂盒（⽐⾊法）提供了⼀种更细致准确的复合体Ⅰ-Ⅴ活性检测⽅法，可以兼容检测多种类型的样本。

线粒体呼吸功能测试是评估线粒体在细胞内进行氧化磷酸化过程中的功能的方法。

下面介绍一种常用的线粒体呼吸功能测试方法，称为"线粒体氧化磷酸化（mitochondrial oxidative phosphorylation）"实验。

步骤如下：
1. 提取线粒体：首先，从感兴趣的组织或细胞中提取线粒体。

这可以通过破碎细胞的方法来实现，通常使用特定的细胞裂解缓冲液。

2. 线粒体定位：通过测量线粒体的蛋白质含量来确定提取线粒体的纯度。

这可以通过比色法（如BCA法）或使用线粒体特异性标记蛋白的免疫印迹来完成。

3. 准备线粒体呼吸底物：为线粒体提供呼吸底物。

常见的呼吸底物包括琥珀酸、丙酮酸、乳酸和葡萄糖。

4. 准备呼吸底物混合物：将适当浓度的呼吸底物与其他必要的试剂（如线粒体缓冲液、辅因子等）混合在一起。

这个混合物将被添加到线粒体悬液中。

5. 开始实验：将线粒体悬液与呼吸底物混合物混合，并在适当的温度和pH条件下进行反应。

这可以通过使用光度计、荧光光度计或电极来监测线粒体呼吸速率的变化。

6. 分析结果：根据实验的设计，可以测量线粒体呼吸速率的各个方面，如基础呼吸速率、最大呼吸速率、耦联呼吸速率等。

这些数据可以用来评估线粒体的功能状态。

需要注意的是，线粒体呼吸功能测试方法可能会因实验目的和研究对象的不同而有所差异。

因此，在具体实施之前，最好参考相关文献或专家的建议，以确保使用适合的方法。

兔子线粒体呼吸链复合物II(琥珀酸-辅酶Q还原酶)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定兔子血清，血浆，细胞上清及相关液体样本中线粒体呼吸链复合物II(琥珀酸-辅酶Q还原酶)的活性。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中兔子线粒体呼吸链复合物II(琥珀酸-辅酶Q还原酶)水平。

用纯化的兔子线粒体呼吸链复合物II(琥珀酸-辅酶Q还原酶)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入线粒体呼吸链复合物II(琥珀酸-辅酶Q还原酶)，再与HRP标记的线粒体呼吸链复合物II(琥珀酸-辅酶Q还原酶)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的线粒体呼吸链复合物II(琥珀酸-辅酶Q还原酶)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中兔子线粒体呼吸链复合物II(琥珀酸-辅酶Q还原酶)浓度。

样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。