结核与耐药结核快速诊断技术40页PPT

6,530名医疗工作人员筛查潜伏性结核结果
Infection Control and Hospital Epidemiology结2核01病0:的31诊,1断279-1285
IGRAs的测试结果稳定吗?
• 接续QFT测试的阴转率为TST的25倍 • 阴转者多为γ干扰素刚超过临界值，且为TST与
IGRA结果不一致者(TST-/IGRA+) • 没阴转者多为γ干扰素值较高，且为TST与IGRA结
TST, Close contact, 0
Close contact
TST QFT
Good test agreement between TST & QFT Brock, 2004
QFT与TST的比较
QFT
• 体外试验
• 使用特异性抗原 • 试验无boosting现象 • 只须测试一次 • 不一致性出现在实验室操作 • 一天内可判读结果 • 需要抽血 • 有对照组
– 参考标准为PPD-S (Siebert’s Lot 49608) – 目前有三个剂量型态: 1 TU, 5 TU, 250 TU
结核病的诊断
结核菌素简介
• 结核菌素是萃取自结核菌的蛋白质，全世界最 早采用 OT(oldtuberculin)，后来又加以改良成为 PPD(purifiedproteinderivative)
• 目前广为各国所使用的结核菌素有PPD-S、及 PPD RT23两种；根据效价比较，PPD RT23 2TU所 引发的反应强度与PPD-S 5TU相当，都是经世界 卫生组织认可的标准剂量；自2011年9月1日 起，台湾由使用PPD RT23 1TU改为 2TU
结核病的诊断
曼托克司皮肤试验(Mantoux test)

全世界约三分之一的人群感染了结核分枝杆菌，《2012年全球结核病报告 》显示，在2011年有870万新发病例， 140万人死于结核病
活动性结核与潜伏性结核
新发TB病例来自潜伏性结 核感染人群
潜伏性结核感染（hidden epidemic）人群数量巨大— —“定时炸弹”
活动性TB – 全球每年900万新发病
５．结核菌素试验 检出结核分枝杆菌感染，而非检出结核
病。对儿童、少年及青年的结核病诊断 有参考意义。不能区分自然感染或是卡 介苗接种的免疫反应。 方法：结核菌素纯蛋白衍生物（PPD_RT23)。左侧前臂屈侧中上部1/3处， 0.1ml(5IU)皮内注射，26号10cm一次性 短斜面针头和和1cm注射器。
肺结核诊断
５．结核菌素试验 48—72小时观察及判断结果。测量硬结
的横径及纵径，平均直径（横径+纵径） /2。 ＜4mm为阴性 5—9mm弱阳性 10—19mm阳性 ＞20mm或虽＜20mm但局部出现水泡和淋 巴管炎为强阳性
肺结核诊断
５．结核菌素试验
阴性反应结果的儿童，一般表明未受过 结核分枝杆菌的感染，可除外结核病。
ＴＳ）
我国疫情
高感染率 高肺结核患病率 高耐药率 死亡人数多 递降率低 中青年患病多 地区患病率差异大 实施ＤＯＴＳ项目的地区患病率低
结核分枝杆菌
种属 放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。 分类 人型、牛型、非洲型和鼠型４类。
生物学特性
１．多形性：细长稍弯曲两端圆形，痰标 本中可呈T、V、Ｙ形，及丝状、球状、 棒状。
２．传播途径： 飞沫传播：通过咳嗽、喷嚏、大笑、 大声谈话产生微滴排到空气中传播
结核病在人群中的传播
３．易感人群 自然抵抗力：与遗传因素、生活贫 困、居住拥挤、营养不良有关。婴 幼儿、老年人、HIV感染者、免疫抑 制剂使用者、慢性疾病患者易患。 获得性特异性抵抗力：来自自然或 人工感染。山区及农村居民移居城 市易感。

传统技术 现代技术
影像学
涂片镜检
培养
皮肤菌素试验
IGRA
分子诊断
可诊断活动期结核感染 无法区分活动期结核与潜伏期结核
当前临床诊治的难点
依据抗酸染色为基础的结核初筛的不可靠性



敏感性为~50%
结核/非结核分枝杆菌不能区分（NTM可能占到40%）

以培养为基础的结核确诊和药敏对治疗的影响
2个月才获得药敏结果，导致患者脱落
是否WHO推荐
耐药结核诊断
否
否
否
否
否
结核及耐药结核 初始诊断
仪器通量 出报告时间 试剂储存条件 涂阳培阳样本 MTB灵敏度 涂阴培阳样本 MTB灵敏度 耐药灵敏度
或12（选用杂交仪 可同时做12个样品） 6小时 部分试剂需冷冻 无 无
痰标本与处 理液 1：2混合 标本自动 清洗过滤 超声裂解 DNA提纯 DNA和 PCR反应 试剂混合 半巢式实 时荧光定 量核酸扩 增检测
分子信标
吸取2ml处理 样品 到反应盒
靶序列
杂交体
打印 检测 报告
将反应盒放入检 测模块（手工操 作完成）
SPC
每个探针用不同的荧光染料标记，允许同时检测。
获得检测结果时间：1小时 45分钟
不应当替代可检测结核和利福平耐药的快速分子诊断技术，尤其是耐药结核高危人群
由于缺乏证据，TB-Lamp对于持续有肺结核症状的HIV患者的诊断价值，是否优于涂片尚不清楚 TB-Lamp 的推荐只适用于检测持续有肺结核症状的患者的痰液样本 TB-Lamp对儿童患者的检测由于缺乏数据，仅是推测
恒温扩增 — 试纸条法
操作步骤： 1. 将痰液液化、离心、灭活，制备成核酸扩增 模板液 2. 取0.4ul移入1.5ml PCR管中，放入恒温装置 中扩增 3. 使用水浴锅或金属浴；63℃扩增1小时； 4. 将完成扩增的 PCR管放入一次性防污染扩增 物试纸条检测装置中检测 , 15 分钟目测定性 结果

其他耐药分子生物学检测方法：
多重PCR技术
基因芯片技术 测序
基因芯片技术
Kurbatova 等同时使用Xpert MTB/ RIF 法和TB-Biochip(®)MDR 生
物芯片法对俄罗斯2 个耐药结核高流行地区的238 份标本检测。
• TB-Biochip 检出结核分枝杆菌复合群的敏感性是97.3%(95 % CI, 91.0-99.5 %)，特异性是78.1%(95 % CI, 61.5-89.9 %)。 • 与MGIT 药敏相比，TB-Biochip 检测利福平耐药的准确率是100％ (95 % CI, 94.2-100 %) ，利福平药物敏感的准确率是94. 7％ (95 % CI, 76.7-99.7 %) . 异烟肼耐药和敏感的准确率为98. 2 ％(95 % CI, 91.4-99.9 %)和78. 6％(95 % CI, 52.1-94.2 %)。
N Engl J Med, 2012, 366(23):2161-2170.
耐药结核病快速诊断进展
结核病新诊断技术, July 2012
耐药结核病的检测方法
细菌学诊断——以培养为基础的药敏实验
• 金标准 • 操作繁琐，时间长，技术要求高。 • 生物安全要求高。
分子生物学诊断——以核酸扩增为基础的检测
初治结核中的MDR-TB比例
Figures are based on the most recent year for which data have been reported, which varies among countries WHO. Global tuberculosis report 2012
耐药结核病诊断及治疗进展
中国CDC结核病防治临床中心 首都医科大学附属北京胸科医院 初乃惠

杂交
结果判读
结果需要人工判读，或配备专门的设备
▪ 年推荐用于涂阳标本检测，年更新推荐检测二线药物 ▪ 全程检测需小时 ▪ 配套设备繁多，需个房间，需仪、杂交仪等 ▪ 手工操作步骤繁多，复杂的结果判读
基因芯片
▪ 基于的基因突变，快速检测分离株或者痰液样本中结核杆菌的两种一线抗结核药耐药 — 利福平、异烟 肼
学检查 只参考传统的微生物检测结果
因为这些检测的不可靠性， 不得不采取非常规手段，特别提
结核诊断的常见技术
传统技术
现代技术
影像学
涂片镜检
培养
皮肤菌素试验
分子诊断
可诊断活动期结核感染 无法区分活动期结核与潜伏期结核
当前临床诊治的难点
依据抗酸染色为基础的结核初筛的不可靠性 敏感性为 结核非结核分枝杆菌不能区分（可能占到）
▪ 未评估或推荐 ▪ 鉴定与药敏需用两套试剂盒，鉴定药敏各需小时 ▪ 配套设备：需不同室，需仪、杂交仪、扫描仪等，需配备扫描仪及配套软件判读
熔解曲线
核酸提取
扩增
检测结果
▪ 原理：一定环境下，双链在其长度和序列一定时，值也一定，发生错配时，值下降，下降幅度与发生错 配的碱基数目、类型和位置有关
▪ 小时获得结果，目前通过的有利福平和异烟肼耐药两套试剂盒 ▪ 未评估或推荐 ▪ 配套设备：核酸提取仪、仪等
以培养为基础的结核确诊和药敏对治疗的影响 个月才获得药敏结果，导致患者脱落 个月后调整治疗方案，导致耐药患者的漏诊和传播
我国结核诊断现状 结核诊断新技术 结核诊断指南更新
结核诊断新技术
▪ 技术 ▪ 等温扩增检测技术 ▪ 线性探针 ▪ 基因芯片 ▪ 熔解曲线 ▪ 巢式 ▪ 血清学检测
原理：机体感染过结核分枝杆菌，淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌时，产生和分泌特异性的细胞因子γ