磷酸三苯酯对斑马鱼早期生命阶段的神经毒性研究

《舍曲林对斑马鱼的神经行为毒性及作用机制研究》篇一一、引言随着环境与人类健康之间关系的日益密切，药物及其残留对水生生物的影响越来越受到研究者的关注。

舍曲林，作为一种广为使用的抗抑郁药物，其在水生环境中的行为及潜在影响也成为了研究热点。

本文将着重探讨舍曲林对斑马鱼的神经行为毒性及作用机制进行研究，为进一步理解药物对水生生物的生态影响提供科学依据。

二、材料与方法1. 材料实验选用健康的斑马鱼作为研究对象。

舍曲林药物购自正规渠道，并经过纯化处理。

实验过程中使用的所有试剂均为分析纯。

2. 方法（1）药物暴露实验：将斑马鱼分为对照组和不同浓度的舍曲林处理组，进行不同时间段的暴露实验。

（2）神经行为学检测：采用行为学观察和电生理学方法，检测斑马鱼的神经行为变化。

（3）样本收集与处理：收集各组斑马鱼的血液和组织样本，进行生物化学和分子生物学分析。

（4）数据分析：运用统计学方法对实验数据进行处理和分析。

三、实验结果1. 神经行为毒性表现实验结果显示，随着舍曲林浓度的增加和暴露时间的延长，斑马鱼表现出明显的神经行为毒性症状，包括活动性降低、避光反应减弱等。

2. 生理生化指标变化通过对血液和组织样本的分析，发现舍曲林处理组的斑马鱼在生化指标上出现显著变化，如神经递质水平的变化、氧化应激指标的升高等。

3. 分子机制研究通过分子生物学手段，我们发现舍曲林可能通过影响斑马鱼体内的相关基因表达，进而影响神经传导和神经保护等相关通路。

四、讨论1. 神经行为毒性的可能原因舍曲林对斑马鱼的神经行为毒性可能与药物干扰神经递质传递、影响神经元功能等有关。

此外，药物在体内的代谢过程也可能产生有毒物质，进一步加重对神经系统的损伤。

2. 作用机制探讨舍曲林的作用机制可能涉及多个方面，包括影响神经递质系统、干扰细胞能量代谢、诱导氧化应激等。

这些机制可能导致斑马鱼出现神经行为毒性症状。

3. 环境意义与人类健康的关联本研究不仅有助于理解舍曲林对水生生物的生态影响，也为评估药物在环境中的潜在风险提供了依据。

《典型酚类抗氧化剂对斑马鱼的神经毒性效应研究》篇一一、引言随着现代工业的快速发展，环境污染问题日益严重，特别是化学物质对水生生物的毒性影响成为了科学研究的热点。

其中，酚类化合物作为一类典型的有机污染物，在环境中广泛存在，其生态毒理效应受到广泛关注。

典型酚类抗氧化剂因其具有优良的抗氧化性能而被广泛应用于各种工业领域，然而，这类物质对水生生物的潜在神经毒性却鲜有报道。

本研究以斑马鱼为研究对象，探讨典型酚类抗氧化剂对其神经毒性效应的影响。

二、材料与方法1. 材料本研究所用斑马鱼为成年野生型斑马鱼，购自某水产养殖基地。

实验所用的典型酚类抗氧化剂为某市售产品，其化学结构明确。

2. 方法（1）实验设计：将斑马鱼分为对照组和实验组，实验组分别暴露于不同浓度的典型酚类抗氧化剂中。

（2）暴露处理：将斑马鱼置于不同浓度的酚类抗氧化剂溶液中，持续暴露一定时间。

（3）行为学观察：观察并记录斑马鱼的行为变化，包括游动、觅食等。

（4）神经毒性检测：采用电生理学方法检测斑马鱼神经系统的功能变化。

（5）数据统计与分析：运用统计软件对实验数据进行处理和分析。

三、实验结果1. 行为学观察结果在实验过程中，我们发现随着酚类抗氧化剂浓度的增加，斑马鱼的行为发生了明显变化。

高浓度暴露组斑马鱼的游动速度明显减慢，觅食能力下降。

在浓度较低时，斑马鱼虽然能够继续正常生活，但其行为已表现出一定程度的不稳定。

这些结果表明典型酚类抗氧化剂对斑马鱼的神经行为具有潜在的毒性影响。

2. 神经毒性检测结果电生理学检测结果显示，随着酚类抗氧化剂浓度的增加，斑马鱼神经系统的功能出现了明显异常。

主要表现为神经传导速度减慢、神经元兴奋性降低等。

这表明典型酚类抗氧化剂对斑马鱼神经系统具有显著的神经毒性效应。

四、讨论本研究表明，典型酚类抗氧化剂对斑马鱼的神经行为和神经系统功能具有潜在的毒性影响。

这可能与酚类抗氧化剂的结构、浓度、暴露时间等因素有关。

在环境中广泛存在的酚类化合物可能通过食物链进入水生生物体内，对其神经系统产生潜在的危害。

《典型酚类抗氧化剂对斑马鱼的神经毒性效应研究》篇一一、引言抗氧化剂作为现代生活中的常见添加剂，其在保护人体和生物体免受氧化应激的伤害方面具有重要作用。

然而，过量或不当使用抗氧化剂也可能对生物体产生潜在的神经毒性效应。

本篇论文将探讨典型酚类抗氧化剂对斑马鱼的神经毒性效应，为科学合理使用抗氧化剂提供理论依据。

二、材料与方法2.1 实验材料本实验选用斑马鱼作为实验对象，典型酚类抗氧化剂作为实验材料。

2.2 实验方法将斑马鱼分为对照组和实验组，对照组不接触抗氧化剂，实验组分别暴露于不同浓度的典型酚类抗氧化剂中。

通过观察斑马鱼的行为变化、生理指标变化以及神经元结构变化，评估其神经毒性效应。

三、实验结果3.1 行为变化实验组斑马鱼在接触不同浓度的典型酚类抗氧化剂后，表现出不同程度的异常行为，如活动减少、逃避行为等。

其中高浓度组的斑马鱼表现尤为明显。

3.2 生理指标变化通过对实验组和对照组的斑马鱼进行生理指标检测，发现实验组斑马鱼的呼吸频率、心率等生理指标均有所变化，且随着暴露浓度的增加，变化程度逐渐加剧。

3.3 神经元结构变化通过显微镜观察实验组和对照组的斑马鱼神经元结构，发现实验组斑马鱼的神经元结构出现异常，如神经元萎缩、突触结构改变等。

高浓度组尤为明显。

四、讨论4.1 典型酚类抗氧化剂的神经毒性效应实验结果表明，典型酚类抗氧化剂对斑马鱼具有明显的神经毒性效应。

这可能与抗氧化剂在生物体内的代谢过程、与生物大分子的相互作用等因素有关。

此外，不同浓度的抗氧化剂对斑马鱼的神经毒性效应也存在差异，高浓度组的表现尤为明显。

4.2 潜在影响因素及作用机制影响典型酚类抗氧化剂神经毒性效应的因素可能包括生物体的种类、暴露浓度、暴露时间等。

此外，抗氧化剂的化学结构、生物活性等因素也可能影响其神经毒性效应。

其作用机制可能与抗氧化剂干扰生物体内正常的氧化还原平衡、影响神经元结构与功能等方面有关。

五、结论本研究通过实验发现典型酚类抗氧化剂对斑马鱼具有明显的神经毒性效应。

BDE-28及BDE-99对斑马鱼早期生命阶段HPT、HPG和HPA轴功能基因表达水平的影响靳亚茹;刘红玲;韩志华;花小雪【摘要】2,4,4’-三溴联苯醚(2,4,4’-tribromodiphenyl,BDE-28)和2,2’,4,4’,5-五溴联苯醚(2,2’,4,4’,5-pentabromodiphenyl ether,BDE-99)在水环境中广泛存在,并且发现在我国长江下游鱼体内和底泥中检出含量较高.目前针对2,2’,4,4’-四溴联苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether,BDE-47)的水生生物内分泌干扰效应和机制报道较多,而对于检出水平较高的BDE-28和BDE-99的相关方面研究还比较缺乏.本文将斑马鱼鱼卵分别暴露于2、20和200 μg· L-1的BDE-28和BDE-99溶液中,借助q-RT-PCR的方法研究它们对斑马鱼幼鱼的下丘脑-垂体-甲状腺(hypothalamus-pituitary-thyroidal,HPT)、下丘脑-垂体-性腺(hypothalamus-pituitary-gonadal,HPG)和下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal,HPA)轴上50个基因的影响.结果发现,在受精后120 h (hours post fertilization,hpf)时,暴露于2、20和200 μg· L-1的BDE-28和BDE-99的实验组中斑马鱼HPT、HPG和HPA轴上相关基因的表达均受到影响,其中BDE-28主要导致三轴相关基因显著上调,而BDE-99导致三轴相关基因显著下调.BDE-28和BDE-99对斑马鱼早期阶段3个主要内分泌分子通路的影响将导致内分泌功能的改变,从而可能会对斑马鱼的后期生长发育产生影响.另外,主成分分析发现2种不同溴取代个数的PBDE类物质(BDE-28和BDE-99)通过不同的毒性机制对斑马鱼产生不良影响.【期刊名称】《生态毒理学报》【年(卷),期】2018(013)001【总页数】13页(P106-118)【关键词】多溴联苯醚;斑马鱼;下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴;下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴;下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴【作者】靳亚茹;刘红玲;韩志华;花小雪【作者单位】南京大学环境学院污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京210023;南京大学环境学院污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京210023;环境保护部南京环境科学研究所,南京210042;环境保护部南京环境科学研究所,南京210042【正文语种】中文【中图分类】X171.5多溴联苯醚(poly brominated diphenyl ethers, PBDEs)作为一种曾被广泛应用的溴代阻燃剂[1]，已被禁止生产和使用近10年[2]，但仍能在许多环境介质包括空气[3]、水体[4]、土壤[5]、灰尘、底泥[6]和各种生物体[7-10]甚至人体母乳、血液、头发、胎盘以及婴儿血液[11-15]中检出它们的存在。

三氯生和双酚A对斑马鱼神经毒性的比较研究
韩晓雯;徐婕妤;王伟伟;钱秋慧;王慧利
【期刊名称】《中国环境科学》
【年(卷),期】2024(44)2
【摘要】本研究选择常见的两种典型内分泌干扰物三氯生(TCS)和双酚A(BPA)为对象,以斑马鱼作为脊椎模式生物,分析比较了TCS和BPA对斑马鱼神经发育和行为的影响.结果表明:TCS和BPA均会诱导斑马鱼胚胎产生表观畸形,如心包水肿、卵黄囊肿、游囊关闭等;TCS和BPA暴露会抑制幼鱼的运动活性,对运动相关神经元有损伤作用,并影响幼鱼体内乙酰胆碱酯酶的活性,进而造成神经行为的失调.此外,TCS和BPA均会导致斑马鱼幼鱼新生神经元细胞的数量下降,幼鱼的脑部凋亡细胞明显增加,对中枢神经系统发育产生影响.药靶预测结合京都基因与基因组百科全书(KEGG)和基因本体(GO)分析比较了TCS和BPA作用的代谢通路及其致毒机制存在不同.本研究为TCS和BPA环境暴露的健康风险评估和风险预警提供了重要参考.
【总页数】11页(P1111-1121)
【作者】韩晓雯;徐婕妤;王伟伟;钱秋慧;王慧利
【作者单位】苏州科技大学环境科学与工程学院;温州医科大学检验医学院生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】X174
【相关文献】
1.双酚F和双酚S联合暴露下的斑马鱼富集及神经毒性
2.微塑料和三氯生对斑马鱼的神经毒性效应研究
3.四氯双酚A对斑马鱼幼鱼运动行为的影响及神经毒性机制研究
4.双酚AP和双酚AF对斑马鱼的早期神经发育毒性作用研究
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DBP和TPP联合暴露对斑马鱼胚胎发育的影响作者：张明君户沙沙姜伟伟李艳孙桂金来源：《安徽农业科学》2021年第20期摘要 [目的]研究邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和磷酸三苯酯（TPP）单独及联合暴露对斑马鱼胚胎发育的影响。

[方法]将受精后4 hpf（hour post-fertilization，hpf）斑马鱼胚胎分别暴露于DBP（0、0.5和1.0 mg/L）、TPP（0和0.5 mg/L）和TPP+DBP（0.5 mg/L+0.5 mg/L和0.5 mg/L+1.0 mg/L），统计72 hpf胚胎孵化率以及96 hpf仔鱼存活率、孵化率、畸形率和体长。

[结果]DBP和TPP单独及联合暴露引起斑马鱼卵黄囊肿、心脏畸形、脊柱弯曲和尾巴畸形，导致斑马鱼孵化率和存活率下降、畸形率增加和体长缩短。

[结论]DBP和TPP联合暴露对斑马鱼存活率、畸形率和体长影响存在交互作用，对孵化率的影响无交互作用。

关键词 DBP;TPP;联合暴露;斑马鱼胚胎;发育中图分类号 S 917.4 文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）20-0105-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.027开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Effect of Combined Exposure to DBP and TPP on the Development of Zebrafish （Danio rerio） EmbryosZHANG Ming-jun，HU Sha-sha，JIANG Wei-wei et al （School of Food Science and Engineering，Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences），Jinan，Shandong 250000）Abstract [Objective]To study the effect of individual and combined exposure to dinbutyl phthalate （DBP） and triphenyl phosphate （TPP） on the development of zebrafishembryos.[Method]Zebrafish embryos at 4 hpf（hour post-fertilization，hpf） were exposed to DBP （0，0.5 mg/L and 1.0 mg/L），TPP （0 and 0.5 mg/L） and TPP+DBP （0.5 mg/L+0.5 mg/L and 0.5 mg/L+1.0 mg/L）.The hatching rate of zebrafish embryos was recorded at 72 hpf，and the survival rate，hatching rate，malformation rate and body length of zebrafish larvae were recorded at 96 hpf.[Result]Exposure to individual and combined of DBP and TPP resulted in obvoius malformations in zebrafish，including yolk-sac edema，cardiac deformities，spinal curvature and tail malformation，decreased hatching and survival rates，increased malformation rate and reduced body length in zebrafish embryos.[Conclusion]It has an interaction effect on the survival rate，malformation rate and body length of zebrafish，and no interaction on the hatching rate of zebrafish.Key words DBP;TPP;Combined exposure;Zebrafish embryos;Development基金項目国家级大学生创新创业训练计划项目（201910431048）。

《舍曲林对斑马鱼的神经行为毒性及作用机制研究》篇一一、引言随着环境与人类健康之间关系的日益密切，环境污染物对生物体特别是水生生物的毒性影响逐渐成为研究热点。

舍曲林作为一种广泛使用的抗抑郁药物，其在水环境中的残留及其对水生生物的潜在影响逐渐受到关注。

斑马鱼作为一种常见的模式生物，常被用于研究药物对神经系统的毒性影响。

本文旨在探讨舍曲林对斑马鱼的神经行为毒性及其作用机制，以期为环境保护和药物生态风险评估提供科学依据。

二、材料与方法1. 材料（1）实验药物：舍曲林。

（2）实验动物：斑马鱼。

（3）实验设备：行为观察箱、显微镜、离心机等。

2. 方法（1）药物处理：将斑马鱼暴露于不同浓度的舍曲林溶液中，设定对照组和实验组。

（2）行为观察：观察并记录斑马鱼的行为变化，包括活动量、游泳速度、社交行为等。

（3）组织学分析：取斑马鱼脑部组织进行显微镜观察和病理学分析。

（4）分子生物学实验：利用PCR、Western Blot等技术分析舍曲林对斑马鱼脑部基因表达及蛋白质表达的影响。

三、实验结果1. 行为学观察结果通过行为学观察发现，随着舍曲林浓度的增加，斑马鱼的活动量逐渐减少，游泳速度变慢，社交行为减少。

这些结果表明舍曲林对斑马鱼的神经行为具有明显的抑制作用。

2. 组织学分析结果显微镜观察和病理学分析显示，舍曲林处理后，斑马鱼脑部组织结构出现明显变化，包括神经元损伤、神经胶质细胞增生等现象。

这表明舍曲林对斑马鱼的神经系统具有明显的毒性作用。

3. 分子生物学实验结果分子生物学实验结果表明，舍曲林处理后，斑马鱼脑部相关基因表达及蛋白质表达发生改变。

这些基因和蛋白质主要涉及神经传导、神经保护、氧化应激等方面，进一步证实了舍曲林对斑马鱼神经系统的毒性作用。

四、讨论根据实验结果，我们可以得出以下结论：舍曲林对斑马鱼具有神经行为毒性作用，主要表现为活动量减少、游泳速度变慢、社交行为减少等症状。

此外，舍曲林还能导致斑马鱼脑部组织结构变化、神经元损伤及神经胶质细胞增生等现象。

雌性斑马鱼暴露于环境剂量三唑磷对亲代生殖和氧化应激及子代胚胎发育的影响汪和祥;李瑞娇;张建禄;张春云;王立新;陈绪;梁昊;熊冬梅【期刊名称】《水生生物学报》【年(卷),期】2024(48)2【摘要】三唑磷作为一种广泛使用的有机磷杀虫剂,该药物在自然水体中的残留可对非靶标生物产生潜在威胁,文章旨在探究三唑磷对斑马鱼的毒性效应。

研究将3月龄雌性斑马鱼(Danio rerio)持续暴露于环境相关浓度的三唑磷(10μg/L)21d,然后与健康雄鱼自然受精产卵;通过测定雌鱼生殖力、亲代与子代的氧化应激及子代胚胎发育相关指标,评估三唑磷对亲代雌鱼及其子代的毒性效应。

主要研究结果:亲代雌鱼经10μg/L三唑磷暴露后,产卵量显著提高(P<0.05),肝脏内乙酰胆碱酯酶(AChE)活性显著降低(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著增加(P<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和羧酸酯酶(CarE)活性均显著增强(P<0.05);所产子代胚胎受精率、受精卵直径、胚胎心率和初孵仔鱼体长均显著降低(P<0.05),仔鱼畸形率显著增加(P<0.05),孵化率无显著性差异;仔鱼AChE与SOD活性呈下降趋势但差异不显著,MDA含量显著增加(P<0.05),GPx 与GST活性显著降低(P<0.05),CarE活性显著提高(P<0.05)。

以上研究结果表明环境浓度三唑磷21d暴露可提高雌性斑马鱼的生殖力,诱导亲代及子代氧化应激反应,并对子代胚胎发育过程产生不良影响。

【总页数】8页(P185-192)【作者】汪和祥;李瑞娇;张建禄;张春云;王立新;陈绪;梁昊;熊冬梅【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院水产科学系;陕西省水产研究与技术推广总站;陕西省秦岭生态安全重点实验室【正文语种】中文【中图分类】X171.5【相关文献】1.高氯酸钠急性暴露对斑马鱼胚胎发育及氧化应激的影响2.戊唑醇暴露亲代斑马鱼诱发子代胚胎发育神经毒性的研究3.[C_(4)mim]Cl亲代暴露对F1代斑马鱼胚胎-幼体发育毒性的影响因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

《典型酚类抗氧化剂对斑马鱼的神经毒性效应研究》篇一一、引言抗氧化剂在现代工业及食品中广泛应用，对于预防食品变质和保持生物活性分子稳定起着关键作用。

然而，许多人工合成的抗氧化剂，尤其是酚类抗氧化剂，可能会对生物体产生不同程度的毒性影响。

本文旨在探讨典型酚类抗氧化剂对斑马鱼神经系统的毒性效应，以期为环境保护和食品安全提供理论依据。

二、材料与方法1. 实验材料本实验选取了常见的几种典型酚类抗氧化剂，如BHA（丁基羟基茴香醚）、BHT（二丁基羟基甲苯）和TPHP（叔丁基-羟基茴香醚），并使用斑马鱼作为实验动物模型。

2. 实验方法实验将斑马鱼分为对照组和实验组，实验组分别暴露于不同浓度的酚类抗氧化剂中。

通过观察斑马鱼的行为变化、神经元活性、神经递质水平等指标，评估酚类抗氧化剂的神经毒性效应。

三、实验结果1. 行为变化实验发现，随着酚类抗氧化剂浓度的增加，斑马鱼的行为出现明显变化。

低浓度下，斑马鱼活动性增强；高浓度下，斑马鱼活动性降低，出现异常行为，如游动迟缓、失去方向感等。

2. 神经元活性通过电生理技术检测发现，实验组斑马鱼神经元活性明显降低，且随着抗氧化剂浓度的增加，神经元活性逐渐减弱。

3. 神经递质水平实验结果显示，实验组斑马鱼脑部神经递质水平发生显著变化。

部分神经递质水平升高，部分则降低，表明酚类抗氧化剂可能对斑马鱼神经系统的信息传递产生干扰。

四、讨论本研究表明，典型酚类抗氧化剂对斑马鱼的神经系统具有一定的毒性效应。

这可能与抗氧化剂干扰神经元功能、影响神经递质传递等有关。

此外，不同浓度的抗氧化剂对斑马鱼的影响也不同，低浓度可能产生一定的刺激作用，而高浓度则可能对神经系统造成损害。

五、结论本研究通过实验发现典型酚类抗氧化剂对斑马鱼的神经系统具有一定的毒性效应。

因此，建议在实际应用中严格控制酚类抗氧化剂的用量和浓度，以降低其对生物体的潜在危害。

此外，为更好地保护环境生态和保障食品安全，未来仍需深入研究酚类抗氧化剂在环境中的累积效应及长期影响。

新型阻燃剂TCPP对斑马鱼的毒性研究皮天星;蔡磊明;蒋金花;赵学平;王彦华;吴声敢;苏连水;汤涛【摘要】为了明确新型阻燃剂磷酸三(2-氯丙基)酯(TCPP)的生态风险,本研究采用斑马鱼为模式生物,评价了TCPP对成鱼和胚胎的毒性效应.急性毒性研究结果表明,TCPP对斑马鱼成鱼的96 h致死中浓度(LC50)为47.06 mg-L-1,而对胚胎96 h-LC50为26.01 mg·L-1,且会影响胚胎的正常发育,导致孵化出的仔鱼产生畸形.成鱼14 d延长毒性试验结果表明,TCPP对斑马鱼成鱼的无可观察效应浓度(NOEC)为1.00 mg· L-1,染毒暴露后肝脏和性腺指数随TCPP浓度增加轻微下降,但肝脏中卵黄蛋白原(VTG)的含量和性腺中芳香化酶的活性随TCPP浓度增加普遍升高.此外,TCPP的暴露还会导致斑马鱼脑垂体中合成促性腺激素的相关基因表达量增加.因此,TCPP对斑马鱼成鱼和胚胎的急性毒性均为低毒级,但长期暴露会干扰内分泌系统的调控功能,影响斑马鱼的正常发育.【期刊名称】《生态毒理学报》【年(卷),期】2016(011)002【总页数】10页(P247-256)【关键词】磷酸三(2-氯丙基)酯(TCPP);斑马鱼;发育毒性【作者】皮天星;蔡磊明;蒋金花;赵学平;王彦华;吴声敢;苏连水;汤涛【作者单位】新疆农业大学草业与环境科学学院,乌鲁木齐830052;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所浙江省植物有害生物防控重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地,农业部农药残留检测重点实验室,杭州310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所浙江省植物有害生物防控重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地,农业部农药残留检测重点实验室,杭州310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所浙江省植物有害生物防控重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地,农业部农药残留检测重点实验室,杭州310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所浙江省植物有害生物防控重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地,农业部农药残留检测重点实验室,杭州310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所浙江省植物有害生物防控重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地,农业部农药残留检测重点实验室,杭州310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所浙江省植物有害生物防控重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地,农业部农药残留检测重点实验室,杭州310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所浙江省植物有害生物防控重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地,农业部农药残留检测重点实验室,杭州310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所浙江省植物有害生物防控重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地,农业部农药残留检测重点实验室,杭州310021【正文语种】中文【中图分类】X171.5Received 9 July 2015 accepted 25 December 2015磷酸三(2-氯丙基)酯(tris(2-chloroisopropyl) phosphate, TCPP)是一种有机磷酸酯类阻燃剂(organophosphate flame retardants, OPFRs)。

有机磷阻燃剂TCPP和铅联合暴露对斑马鱼发育的影响张晓顺;纪秋怡;向阳;许永杰;宋珊珊;孟晓静【期刊名称】《生态毒理学报》【年(卷),期】2024(19)1【摘要】近年来,电子废弃物不断增多,电子废弃物处理厂周边环境污染问题严重,有机磷阻燃剂磷酸三(2-氯丙基)酯(tris(2-chloroisopropyl)phosphate,TCPP)和铅(Pb)是电子废弃物处理厂2种主要的污染物,对周围环境及人群健康造成影响。

目前还没有关于TCPP和Pb联合暴露对水生生物及人类发育影响的相关研究。

本研究选用斑马鱼模式生物作为研究对象,探讨Pb(190μg·L^(-1))、TCPP(200、2000、6000μg·L^(-1))单独及联合暴露对斑马鱼胚胎发育的影响。

结果表明,Pb和低中高3个剂量TCPP单独和联合暴露对斑马鱼的存活率和孵化率无明显影响。

同时,Pb和低中2个剂量TCPP单独和联合暴露对斑马鱼脊柱弯曲率和自发运动行为无明显影响。

而与TCPP、Pb单独暴露相比,高剂量TCPP联合Pb暴露(Pb:190μg·L^(-1)+TCPP:6000μg·L^(-1))抑制斑马鱼的自发运动(P<0.01),导致其体长下降(P<0.01)、96 hpf(hours post-fertilization,hpf)和120 hpf心率下降(P<0.001)。

同时,脊柱发育相关基因(col8a1a、ngs、bmp2a、bmp2b、runx2b)和神经发育相关基因(mbp、elavl3、gfap、gap43)表达下调(P<0.05)。

以上的实验结果表明,高剂量TCPP联合Pb暴露扰乱脊柱和神经发育相关基因的表达,影响斑马鱼脊柱和神经的早期发育。

【总页数】11页(P232-242)【作者】张晓顺;纪秋怡;向阳;许永杰;宋珊珊;孟晓静【作者单位】南方医科大学公共卫生学院职业卫生与职业医学系【正文语种】中文【中图分类】X171.5【相关文献】1.铅和得克隆联合暴露对斑马鱼胚胎的神经毒性作用2.铅和邻苯二甲酸二丁酯联合暴露对斑马鱼胚胎的影响3.胚胎期铅暴露对斑马鱼行为发育的影响4.有机磷阻燃剂TDMPP对斑马鱼早期器官发育毒性的研究5.DBP和TPP联合暴露对斑马鱼胚胎发育的影响因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析揭示了磷酸三苯酯（TPP）肝毒性途径的机制导读磷酸三苯酯(TPP) 在各种环境介质和生物群中均有发现，说明人类对其接触广泛。

然而，TPP暴露对肝毒性健康风险的信息仍然缺乏。

在本研究中，TPP能够诱导人类正常肝细胞(L02)凋亡、损伤细胞亚显微结构并且提高ROS的水平。

多基因组学(转录组、蛋白组学和代谢组学)整合分析被用来进一步研究机制。

转录组学分析发现TPP暴露能够显著影响细胞凋亡、促癌基因的活化、氧化还原内稳态以及DNA损伤和修复。

此外，蛋白组学分析发现与凋亡、氧化应激、代谢和膜结构相关的基因受到影响。

代谢组学证实代谢的信号通路，包括糖酵解、柠檬酸循环、氧化磷酸化、脂质和蛋白代谢受到严重破坏。

基于多组学的结果研究者构建了一个假说网络，旨在发现TPP应答中关键的细胞内事件，并且阐述TPP诱导L02细胞肝毒性的机制。

因此，分子应答可以在多个生物学水平阐明并且多组学的分析能够为探究毒性的相关机制以及化学风险评估提供科学的工具。

前言有机磷阻燃剂(OPFRs)的用量增加并且到2015年将达到680 kts。

基于实验证据以及预测模型OPFRs 在环境中持久存在，并且广泛积聚在大气、雪、海水以及生物群中，甚至是在极地地区以及遥远的海洋，因此引起公众的关注。

磷酸三苯酯(TPP)作为一种亲脂性的OPFRs，不能与聚合物化学结合，因此增加了TPP向空气中释放。

越来越多的研究发现TPP能够导致神经毒性、基因毒性以及内分泌干扰效应。

TPP能够导致日本鹌鹑胚胎生长和休息代谢速率减弱。

环境中TPP的浓度也会影响中枢神经系统的发育，导致早期斑马鱼幼虫的神经毒性。

因此进一步研究TPP深层毒理学机制是非常必要的。

肝脏是机体内重要的代谢器官，在酶的合成以及异生污染物的移除中发挥重要作用。

肝细胞在维持代谢的平衡以及污染物毒性中发挥作用。

然而很少有报道研究OPFRs对肝脏的毒性效应。

TDCPP以及TCEP 能够显著增高大鼠肝脏的重量。

密级学校代码10488TCIPP和TCEP对斑马鱼胚胎/仔鱼神经发育的影响研究学位申请人：王恒琦学科专业：公共卫生与预防医学指导教师：张志兵李瑞雯答辩日期：2019年5月22日A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirementsfor the Degree of Master in MedicineThe adverse effect of TCIPP and TCEP on neurodevelopment of zebrafishembryos/larvaeMaster Candidate：Wang HengqiMajor：Public health and preventive medicine Supervisor ：Prof. Zhang Zhibing Dr Li RuiwenWuhan University of Science and TechnologyWuhan, Hubei 430081, P.R.ChinaMay, 2019摘要目的：本项目拟以广泛存在于环境介质中的氯代有机磷阻燃剂（TCEP及TCIPP）为研究对象，以斑马鱼为模式生物，探讨TCEP及TCIPP对斑马鱼仔鱼早期神经发育的影响，以揭示TCEP及TCIPP对斑马鱼的神经毒性作用及潜在的分子机制。

方法：将斑马鱼胚胎（受精后2小时[hpf]内）暴露于不同浓度的TCEP及TCIPP （0, 100, 500及2500 μg/L）直至120 h，同时选用典型的神经毒性物质毒死蜱（CPF，100 μg/L）作为阳性对照。

实验过程中对斑马鱼仔鱼72 hpf孵化率、96 h死亡率以及畸形率等生长发育指标进行测定，同时对斑马鱼仔鱼在光暗交替刺激下的自主运动行为、乙酰胆碱含量和乙酰胆碱酯酶活性、中枢神经发育相关的基因（主要包括：α1-tubulin、mbp、syn2α、gfap、shha、ache及gap43）和蛋白等指标进行测定，综合评价TCEP和TCIPP对斑马鱼早期神经发育的影响，并与CPF进行对比研究。

EE2与DBP对斑马鱼生长发育的联合毒性研究摘要：本研究旨在探究EE2和DBP对斑马鱼生长发育的联合毒性作用及其机制。

实验采用斑马鱼作为模式生物，设立EE2 (10 ng/L、100 ng/L、1000 ng/L) 和DBP (50 μg/L、200 μg/L、500 μg/L) 单独或联合处理组，在14天、28天和42天时测量生长指标、生殖指标、抗氧化指标、组织损伤及代谢毒性指标。

结果显示，EE2和DBP虽然单独处理对斑马鱼产生一定的毒性作用，但其联合处理造成了更严重的毒性效应。

具体来说，联合处理组表现出更严重的生长迟缓、发育异常和繁殖受损等生殖损伤表现，这些表现与其诱导的氧化应激、细胞凋亡和肝脏损伤等病理变化密切相关。

同时，联合处理还导致细胞色素P450类酶的表达显著增加，影响了斑马鱼内分泌系统的正常功能。

综上所述，本研究的结果对于深入了解EE2和DBP联合处理的毒性效应、揭示其机制以及提高水环境中化学品的安全评估具有重要的科学价值。

关键词：EE2；DBP；斑马鱼；联合毒性；内分泌干扰1. 引言化学品在工业生产中有着广泛应用，然而它们也经常被排放到水环境中，对水生生物造成不可逆转的毒性和环境污染。

近年来，由于不断增加的化学品种类和数量，水环境中的污染物复合污染问题受到了广泛关注。

很多研究表明，污染物通过其单独或复合作用对水环境中生物的生长发育、繁殖等产生了不利影响，其中包括内分泌干扰物质(EDCs)。

EDCs是一类能够干扰生物体内正常内分泌系统功能的化学物质，包括药物、工业化学品、农药和个人护理用品等。

目前，EDCs已经成为环境和公共健康领域的热点问题之一。

EE2和DBP是两种典型的EDCs，它们在自然界和水环境中的广泛存在及其对生物体的严重危害已经引起了高度关注。

EE2是一种合成的人工激素类似物，常用于口服避孕药品中，此外还在养殖业中广泛使用。

DBP则是一种广谱性杀菌剂，用于水处理、个人护理用品和塑料制品等领域。

《典型酚类抗氧化剂对斑马鱼的神经毒性效应研究》篇一一、引言近年来，随着环境污染和食品安全问题的日益突出，化学物质对生物体的毒性效应逐渐成为研究热点。

酚类抗氧化剂作为一类广泛使用的化学物质，其潜在的神经毒性效应引起了广泛关注。

斑马鱼作为一种常用的模式生物，具有繁殖周期短、基因组与人类高度相似等优点，成为研究化学物质神经毒性效应的理想对象。

本研究以典型酚类抗氧化剂为研究对象，探究其对斑马鱼神经系统的毒性效应。

二、材料与方法1. 材料实验所用斑马鱼购自当地鱼店，实验前在实验室饲养环境中适应一周。

实验所用酚类抗氧化剂为市售常见产品，经纯化后用于实验。

2. 方法（1）暴露实验：将斑马鱼暴露于不同浓度的酚类抗氧化剂溶液中，观察其行为变化及生存情况。

（2）神经元分析：通过荧光染色法标记斑马鱼神经元，观察神经元形态及数量变化。

（3）生物化学检测：测定斑马鱼体内相关生化指标，如神经递质含量、抗氧化酶活性等。

（4）数据分析：采用统计学方法对实验数据进行处理和分析。

三、结果1. 行为变化及生存情况实验结果显示，随着酚类抗氧化剂浓度的增加，斑马鱼出现行为异常的比例逐渐增加。

高浓度暴露组中，斑马鱼出现游动迟缓、失去平衡等症状，且生存率明显降低。

2. 神经元形态及数量变化荧光染色法结果显示，暴露于酚类抗氧化剂溶液中的斑马鱼神经元形态发生明显变化，表现为神经元数量减少、突起断裂等现象。

高浓度暴露组中，神经元损伤更为严重。

3. 生物化学检测结果生物化学检测结果显示，暴露于酚类抗氧化剂溶液中的斑马鱼体内神经递质含量降低，抗氧化酶活性降低。

这些结果表明酚类抗氧化剂可能对斑马鱼的神经系统功能产生负面影响。

四、讨论本研究结果表明，典型酚类抗氧化剂对斑马鱼的神经系统具有潜在的毒性效应。

高浓度暴露条件下，斑马鱼出现行为异常、神经元损伤等症状，同时伴有体内神经递质含量降低和抗氧化酶活性降低等生化指标的变化。

这些结果提示我们，酚类抗氧化剂可能对生物体的神经系统功能产生负面影响。

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第4期2023年8月V ol.18,No.4Aug.2023㊀㊀基金项目:中国农业科学院科技创新工程项目(CAAS -ASTIP -IQSTAP);国家乳液技术创新中心创建重点项目(2021-国家乳创中心-10)㊀㊀第一作者:卯明彩(1996 ),女,硕士研究生,研究方向为食品质量与安全,E -mail:*****************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:***************DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221010001卯明彩,孟瑞媛,李亚梦,等.环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性研究[J].生态毒理学报,2023,18(4):411-420Mao M C,Meng R Y ,Li Y M,et al.Neurotoxicity of ciprofloxacin on early life stages of Danio rerio [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(4):411-420(in Chinese)环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性研究卯明彩,孟瑞媛,李亚梦,赵小余,钱永忠,邱静中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,农业农村部农产品质量安全重点实验室,北京100081收稿日期:2022-10-10㊀㊀录用日期:2022-12-16摘要:环丙沙星是恩诺沙星的主要代谢产物,因其抗菌谱广㊁杀菌力强㊁起效快等优点而被广泛应用,在土壤㊁水体等环境中被不同程度检出,然而目前有关环丙沙星对鱼类早期生命发育阶段的神经毒性效应研究较少㊂采用模式动物斑马鱼(Danio re -rio )作为研究对象,在0.1㊁1mg ㊃L -1浓度水平上,从胚胎自发运动㊁运动活性㊁乙酰胆碱酶活性及多巴胺㊁血清素通路和神经发育关键基因的表达等方面评估环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性㊂结果表明,0.1mg ㊃L -1浓度组抑制斑马鱼胚胎自发运动(P <0.001),1mg ㊃L -1浓度组诱导乙酰胆碱酯酶活性(P <0.05);1mg ㊃L -1浓度组斑马鱼运动行为活跃(P <0.05)和光照刺激惊恐反应性增加(P <0.01);同时,胆碱能系统㊁多巴胺㊁血清素通路和神经发育系统的ache ㊁shha ㊁th2㊁htr1aa ㊁htr5a 表达上调(P <0.05),gfap ㊁dat ㊁nestin 基因表达下调(P <0.05)㊂这些结果表明环丙沙星可能通过影响多巴胺㊁血清素和神经发育关键基因的表达产生神经毒性,进而影响运动行为㊂关键词:环丙沙星;斑马鱼;神经毒性;行为学;乙酰胆碱酯酶文章编号:1673-5897(2023)4-411-10㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:ANeurotoxicity of Ciprofloxacin on Early Life Stages of Danio rerioMao Mingcai,Meng Ruiyuan,Li Yameng,Zhao Xiaoyu,Qian Yongzhong,Qiu JingInstitute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory for Quality and Safety of Agricultural Products of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Beijing 100081,ChinaReceived 10October 2022㊀㊀accepted 16December 2022Abstract :Ciprofloxacin is the main metabolite of enrofloxacin,which is widely used because of its broad antibac -terial spectrum,strong bactericidal force and rapid onset of action,and has been detected in soil,water and other environments to varying degrees.However,there are few studies on the neurotoxic effects of ciprofloxacin on early life stages of fish development.Therefore,in this study,the model animal zebrafish (Danio rerio )was used to assess the neurotoxicity of ciprofloxacin on zebrafish at early developmental stages in terms of embryonic spontaneous movements,motor activity,acetylcholinesterase activity and expression of dopamine and serotonin pathways and key neurodevelopmental genes at concentrations of 0.1mg ㊃L -1and 1mg ㊃L -1.Our results showed that the 0.1mg ㊃L -1concentration group inhibited the spontaneous movement of zebrafish embryos (P <0.001),and the 1mg ㊃L -1concentration group induced acetylcholinesterase activity (P <0.05).Zebrafish in 1mg ㊃L -1group showed active lo -comotor activity (P <0.05)and increased startle response upon light stimulation (P <0.01);at the same time,upregu -412㊀生态毒理学报第18卷lation of the expression levels of genes ache,shha,th2,htr1aa and htr5a(P<0.05),and downregulation of the ex-pression levels of genes gfap,dat and nestin(P<0.05)were observed,which regulate the cholinergic,dopaminergic, serotoninergic and neurodevelopmental systems.These results suggested that ciprofloxacin produced neurotoxicity by affecting the expression of dopamine,serotonin and key neurodevelopmental genes,thereby causing alterations in motor behavior.Keywords:ciprofloxacin;zebrafish;neurotoxicity;behaviors;acetylcholinesterase㊀㊀氟喹诺酮类(fluoroquinolones,FQs)抗生素是喹诺酮类药物在6位上加上一个氟原子后形成的第三代药物,具有更强的抗菌活性,因其广谱性和抑制大多数细菌的脱氧核糖核酸旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ的能力使其适用于治疗多种养殖动物和鱼类的感染[1]㊂FQs类药物进入环境生态系统,主要源自医疗行业㊁水产养殖以及畜牧业的大量使用[2]㊂其在体内不能完全代谢,大部分会通过粪便,尿液等途径释放到水生系统中[3]㊂大量研究报道废水中FQs类抗生素残留水平较高[4]㊂研究表明已在多种水生环境中检测到μg㊃L-1水平的抗生素,甚至在mg㊃L-1和mg㊃kg-1浓度水平,在地表河水中检测到恩诺沙星的含量为0~136ng㊃L-1,生产兽用抗生素的制药公司的废水中氟喹诺酮类药物的含量最高达大约200mg㊃L-1[5-8],此外,根据2020年全国农产品抽检报告可知,2020年水产品中恩诺沙星与环丙沙星检出范围之和为18.7~13800.0μg㊃kg-1,平均值为895.4015μg㊃kg-1[9];2020年阿根廷市场上的水产品检出情况为恩诺沙星(太平洋鲑鱼17.37μg㊃kg-1㊁鲥鱼22.63μg㊃kg-1㊁鳟鱼3.91μg㊃kg-1),环丙沙星(太平洋鲑鱼13.2μg㊃kg-1㊁鳟鱼70.41μg㊃kg-1)[10]㊂环丙沙星具有抗菌谱广㊁杀菌力强㊁起效快㊁不易产生耐药性㊁价格低廉等特点[11],而被广泛应用,其也是恩诺沙星的主要代谢产物,由于氟喹诺酮类药物本身的性状和不合理使用现象的存在,引起了一系列的不良反应,主要包括胃肠道反应㊁中枢神经系统毒性㊁光毒性㊁肝毒性和过敏反应等[12],氟喹诺酮类药物引起的中枢神经毒性发生率仅次于胃肠道反应,中枢神经毒性主要表现为失眠㊁头痛㊁头昏,严重者会精神异常㊁昏厥等[13],研究表明诺氟沙星是通过诱导神经系统内细胞凋亡的发生,扰乱神经元和神经胶质细胞系的分化平衡来引发神经毒性[14],环丙沙星在高浓度组(50mg㊃kg-1)表现出诱发抑郁和焦虑状态,是通过降低脑部血清素和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的含量,并增强氧化应激及降低抗氧化防御系统来引起神经毒性的[15],诺氟沙星单独或与磺胺甲噁唑联合使用可抑制金鱼的乙酰胆碱酯酶活性[16]㊂当恩诺沙星暴露鲇鱼时体内乙酰胆碱酯酶的活性发生了变化[17]㊂以往研究表明环丙沙星引起的神经毒性强于依诺沙星㊁培氟沙星,但对其引发的神经毒性的机制尚未明确㊂目前研究认为,该毒性可能与γ-氨基丁酸A受体和N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体活性相关[18]㊂通过对FQs暴露后的斑马鱼幼鱼的行为效应和组织病理学分析,发现FQs对神经具有显著的毒理学效应,但其神经毒性作用机制尚未完全明确,因此需要进一步的研究来阐明斑马鱼幼鱼与FQs相关的神经毒性作用机制[19]㊂乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)被认为是检测神经毒性的生物标志物[20],da Silva Santos 等[21]的研究表明药物长期暴露后斑马鱼的AchE活性升高是斑马鱼产生神经毒性的原因之一,章子男等[22]报道了神经性毒剂塔崩染毒小鼠后使AchE活性上升㊂运动行为指标相较于死亡率和孵化率等指标对水生环境中的污染物更为敏感,而斑马鱼早期生命阶段的运动行为已被用来评估化学物质的发育神经毒性[23]㊂斑马鱼(Danio rerio)因生理机制与哺乳动物具有高度保守性㊁基因与人类基因同源性高㊁产卵量大㊁繁殖能力强㊁胚胎透明㊁发育周期短㊁借助显微镜可观察到胚胎活体状态下的发育过程等[24]优点而被广泛用于毒理学㊁遗传学㊁免疫学和损伤修复[25]等研究领域㊂鉴于此,本研究选取环丙沙星为暴露用药,将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的环丙沙星,通过测定斑马鱼胚胎自发运动㊁运动行为㊁乙酰胆碱酯酶活性和神经递质㊁神经发育系统标志基因表达,从而探究环丙沙星对斑马鱼胚胎的神经毒性影响㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀试剂和仪器环丙沙星(纯度>99%,天津阿尔塔科技有限公司);乙酰胆碱酯酶活性试剂盒(南京建成生物工程研究所);RNA提取㊁反转录和荧光定量PCR试剂盒第4期卯明彩等:环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性研究413㊀(北京京北日晟生物科技有限公司)㊂斑马鱼养殖系统(Z-A-S5,上海海圣生物实验设备有限公司,中国)㊁体式光学显微镜(SZX2-ILLT,日本奥林巴斯);人工气候培养箱(RXM智能型,宁波江南仪器厂,中国);酶标仪(Infinite M200PRO,美国TECAN公司),斑马鱼行为分析仪(DanioVison,Nol-dus公司,荷兰);荧光定量PCR仪(CFX96TM Real Time PCR Detection System,BioRad,美国)㊂1.2㊀实验动物本实验所用斑马鱼为AB系野生鱼,购自南京一树梨花生物科技有限公司㊂饲养条件如下:光照周期14h(光)/10h(暗),水温(28ʃ0.5)ħ,pH=7.20ʃ0.3,电导率(500ʃ30)S㊃m-1,每天投喂丰年虾活体(Artemia nauplii)2次㊂实验前一晚,将健康斑马鱼按雌鱼和雄鱼2ʒ2(个体数目比)的比例放置于产卵缸内,次日清晨完成交配和产卵,挑选发育正常的斑马鱼胚胎用于药物暴露实验㊂1.3㊀斑马鱼胚胎暴露实验实验前配制系列浓度暴露溶液,实验共设3个环丙沙星浓度梯度:0(超纯水)㊁0.1㊁1mg㊃L-1,收集斑马鱼胚胎,于显微镜下挑选发育正常,同一时期的胚胎置于6孔板中,加入相应体积的暴露液,于恒温培养箱中培养至120hpf(hours post fertilization, hpf),每个浓度设置6个平行,每个平行30枚胚胎,每24h更换一次暴露液,暴露浓度依据农产品抽检结果和预实验结果选定㊂分别在暴露0h和24h取100μL暴露液进行浓度测定,色谱条件:XBridge@C18色谱柱(2.1mm ˑ100mm,3.5μm),流动相为0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B),流速为0.4mL㊃min-1;柱温为40ħ;进样量为1μL㊂质谱条件:电喷雾离子源;去簇电压(DP)为73V;正离子模式扫描;离子源电压为4500V;雾化器温度为500ħ;检测方式为多反应监测(multiple reaction monitoring mode,MRM),碰撞能为23V,保留时间为2.02min㊂1.4㊀胚胎自发运动测定从不同浓度暴露组中随机挑选20枚发育至24 hpf的斑马鱼胚胎,于显微镜下视频记录并计数斑马鱼胚胎的自发胎动情况,每次30s,重复观察2次,观测前,将胚胎置于显微镜下适应2min㊂1.5㊀运动行为测定分析经环丙沙星暴露后,每组随机取出30条发育至120hpf的斑马鱼幼鱼进行运动行为分析测定㊂将选取的幼鱼置于96孔板内,每孔1尾幼鱼和300μL暴露液㊂完成准备工作后,将96孔板置于斑马鱼行为分析仪中进行运动行为测试,测试幼鱼在持续光照(自由游泳行为)㊁光暗周期下(运动活性监测)和不同光照刺激时长(光照刺激惊恐反应)下的运动行为㊂自由游泳行为检测程序为10min暗-20min 亮,检测斑马鱼仔鱼在连续光照下的运动行为;运动活性监测测定程序为10min暗-5min亮-5min暗-5 min亮-5min暗,检测斑马鱼仔鱼在光暗周期刺激下的游泳行为;光照刺激惊恐反应检测程序为10 min暗-1min亮-5min暗-2min亮-5min暗-3min 亮,检测斑马鱼仔鱼在不同强光刺激时长下的应激惊恐行为㊂1.6㊀乙酰胆碱酯酶活性检测按照上述暴露条件处理斑马鱼胚胎至120hpf,收集幼鱼并整体组织匀浆,检测其乙酰胆碱酯酶活性㊂每个处理组3个平行,每个平行30条幼鱼(剔除未正常发育个体)㊂使用乙酰胆碱酯酶检测试剂盒进行测定㊂测定过程为:准确称取幼鱼组织质量,按照质量(g)ʒ体积(mL)为1ʒ9的比例,加入9倍体积的生理盐水,在0ħ下超声破碎15min,2500r ㊃min-1离心10min,于冰上待用,取上清液30μL用于测定乙酰胆碱酯酶活性,依次添加底物缓冲液和显色应用液500μL(以上步骤于冰上避光操作),混匀,37ħ准确反应6min后,依次添加抑制剂30μL㊁透明剂100μL(以上步骤于常温条件下操作),混匀,静止15min后,使用酶标仪于412nm测定各管吸光度值㊂为了消除样品制备时由于蛋白量的差异而造成的误差,使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测样品蛋白量㊂1.7㊀实时荧光定量PCR按照上述暴露条件处理斑马鱼胚胎至120hpf,收集幼鱼,每个处理组3个平行,每个平行50条幼鱼(剔除未正常发育个体),液氮速冻,置于-80ħ冰箱保存,使用试剂盒进行总RNA提取,提取过程为:获得的幼鱼组织中,加入500μL的Buffer RL1于20ħ条件下破碎匀浆15min,将匀浆液转移至DNA-Cleaning Column中(DNA-Cleaning Column放入收集管中),12000r㊃min-1离心2min,移除DNA-Cleaning Column,保留收集管内上清液,加入1.6倍体积的Buffer RL2,轻柔混匀,将混合液转移至RNA-Only Column中(纯化柱放入收集管中),12000 r㊃min-1离心1min,弃收集管中的废液,重复一次,414㊀生态毒理学报第18卷向纯化柱中加入500μL的Buffer RW1,12000r㊃min-1离心1min,弃收集管中的废液,加入700μL 的Buffer RW2,12000r㊃min-1离心1min,弃收集管中的废液,重复一次,将纯化柱放入收集管中, 12000r㊃min-1空管离心2min,将纯化柱转移至新的收集管中,加入已于65ħ预热的RNase-Free ddH2O,室温放置2min,12000r㊃min-1离心1 min,收集RNA溶液,注意以上全程常温操作,勿低温离心㊂cDNA的合成依据All-in-One First-Strand Syn-thesis MasterMix(with dsDNase)试剂盒说明书进行,荧光定量PCR按照2ˑSYBR Green qPCR Premix (Universal)试剂盒进行操作,使用实时荧光定量PCR 仪对各个基因进行扩增,以β-actin为内参基因,Re-al-time PCR扩增结束后,用2-ΔΔC t相对定量法计算各组基因的相对表达量,目的基因引物序列信息[26-27]如表1所示㊂1.8㊀统计与分析实验数据采用Graphpad Prism8软件进行数据分析和绘图㊂组间差异分析通过单因素方差分析(ANOV A)并以Dunnett s检验进行多重比较,设P< 0.05时有统计学差异,*P<0.05㊁**P<0.01㊂2㊀结果(Results)2.1㊀环丙沙星暴露前后浓度测定在暴露0h和24h时取100μL暴露液进行浓度测定,对其峰面积进行定量㊂定量结果为0.1mg㊃L-1(0h:4.21E+05,24h:3.83E+05)㊁1mg㊃L-1(0h: 4.32E+05,24h:4.05E+05),这表明,在24h暴露期间药物浓度基本维持恒定㊂根据定量结果,每24h 更换一次暴露液可维持暴露浓度恒定㊂2.2㊀环丙沙星暴露对胚胎自发运动的影响斑马鱼胚胎的自主摆尾运动主要是斑马鱼尾部的摆动,与斑马鱼的次级神经元无关,是受到初级神经元支配的运动,不依赖斑马鱼的脑部神经元,是可检测到的最早神经行为[28-29],可作为检测神经毒性的初始指标㊂各浓度暴露组的24hpf自主运动次数如图1所示,0.1mg㊃L-1浓度组与对照组相比其胚胎自发运动次数(1.80次㊃min-1)显著降低(P< 0.001),1mg㊃L-1浓度暴露下的胚胎自发运动次数(2.25次㊃min-1)与对照组(2.90次㊃min-1)相比显著降低(P<0.05),因此其可显著抑制胚胎早期的自主运动次数,这表明,环丙沙星抑制斑马鱼胚胎的自主运动行为㊂表1㊀目的基因引物序列信息Table1㊀Gene primer sequence information 基因Gene引物序列(5 ~3 )Primer sequence(5 ~3 )β-actin F:CGAGCAGGAGATGGGAACCR:CAACGGAAACGCTCATTGC acheF:CCCTCCAGTGGGTACAAGAAR:GGGCCTCATCAAAGGTAACA th1F:GGTCTCACGGCTGGTATCCTR:TGCCTCGCAGAGCTTCACT datF:TGGACTTCCGCGCCTGTATGATGR:TCCGGGCAGCGAGCAGAACTTGTA nr4a2bF:GAAGACGGCGAAATCGATGCR:CTGGCGGTTCTGACAACTTCC bdnfF:ATAGTAACGAACAGGATGGR:GCTCAGTCATGGGAGTCC th2F:ACATTCACGGCTGAGGAGTTTR:ATGCTGCCATACGTTTGGTC htr1aaF:TTCTACATCCCGCTCATCCTCAR:CCTCCAAGTTTTACCCACCTCTC htr5aF:TGGATCAAAGAGGACCAACACCR:CTGAAACGTCACCGTGGCAT htr1bF:GCTACGTCAACTCACTCATCAAR:TCCTATCGTCTGCAACATCTAAA htr2aF:TACGGTGGCTGGGAACATTTTAGR:GGGACACAGTGATGCAGGGAAA syn2aF:CTCCCAGCCCACCAATAAGGR:CATCCGTGTGCGAAAAGCAG mbpF:AATCAGCAGGTTCTTCGGAGGAGAR:AAGAAATGCACGACAGGGTTGACG shhaF:GCAAGATAACGCGCAATTCGGAGAR:TGCATCTCTGTGTCATGAGCCTGTα1-tubulin F:AATCACCAATGCTTGCTTCGAGCCR:TTCACGTCTTTGGGTACCACGTCA gfapF:GGATGCAGCCAATCGTAATR:TTCCAGGTCACAGGTCAG elavl3F:AGACAAGATCACAGGCCAGAGCTTR:TGGTCTGCAGTTTGAGACCGTTGA gap43F:TGCTGCATCAGAAGAACTAAR:CCTCCGGTTTGATTCCATC nestinF:ATGCTGGAGAAACATGCCATGCAGR:AGGGTGTTTACTTGGGCCTGAAGA manfF:AGATGGAGAGTGTGAAGTCTGTGTGR:CAATTGAGTCGCTGTCAAAACTTG chrnα7F:TCAGTATTTTGCCACCACCAR:CTTTGTCTTCGCCAGGTCTC第4期卯明彩等:环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性研究415㊀图1㊀环丙沙星暴露对斑马鱼胚胎自主运动的影响注:与对照组相比,*表示P <0.05,***表示P <0.001㊂Fig.1㊀Effect of ciprofloxacin exposure on the autonomicmovement of zebrafish embryosNote:Compared with control,*represents P <0.05,***represents P <0.001.2.3㊀环丙沙星暴露对幼鱼运动行为的影响在设定的检测程序内,暴露至120hpf 的幼鱼在光暗周期㊁持续光照和不同光照刺激时长下的运动速度如图2(a)~(c)所示,在运动活性(图2(a))监测时间内,与对照组相比,各剂量组的运动速度随着暴露浓度的升高而降低,1mg ㊃L -1浓度组(0.411mm ㊃s -1)与对照组(0.659mm ㊃s -1)相比显著降低(P <0.05);自由游泳行为(图2(b))检测结果显示,在持续光照刺激下,各浓度组的运动速度与对照组相比,有降低的趋势,但未见显著性差异;在不同光照刺激时长(图2(c))下,与对照组(0.729mm ㊃s -1)相比,0.1㊁1mg ㊃L -1暴露组的运动速度(1.02mm ㊃s -1㊁1.06mm ㊃s -1)随着暴露浓度的升高而加快,且具有显著差异(P <0.05),这表明环丙沙星可能使仔鱼处于应激紧张状态,改变其运动行为㊂2.4㊀环丙沙星暴露对幼鱼乙酰胆碱酯酶活性的影响一般认为乙酰胆碱酯酶是水环境中暴露于神经性药物的生物标志物,乙酰胆碱酯酶通过催化水解乙酰胆碱来终止其对胆碱受体的兴奋作用,维持神经冲动㊂由图3可知,与对照组相比,不同浓度的环丙沙星能够诱导乙酰胆碱酯酶活性上升,且1mg ㊃L -1(8.92U ㊃mg -1)与对照组(6.96U ㊃mg -1)之间有显著差异(P <0.05),乙酰胆碱酯酶活性的升高使乙酰胆碱的受体减少,抑制兴奋的传递从而破坏神经递质系统,这表明环丙沙星对斑马鱼幼鱼存在神经毒性作用,其作用可能是由于乙酰胆碱供应不足而导致的㊂2.5㊀环丙沙星影响胆碱能系统相关基因表达为了探究乙酰胆碱酯酶活性变化的原因,本研究对胆碱类的相关基因(chrn α7和ache )进行验证,结果如图4所示,烟碱型胆碱受体α7(chrn α7)与对照组相比,其表达量随着环丙沙星浓度的升高而下调,未见显著差异㊂乙酰胆碱酯酶(ache )基因表达量随着浓度升高而上调,1mg ㊃L -1浓度组与对照组相比有显著差异(P <0.05),这与酶活测量结果一致,表明环丙沙星上调ache 基因表达,诱导乙酰胆碱酯酶图2㊀环丙沙星暴露对幼鱼运动行为的影响注:(a)幼鱼在光暗周期下的运动速度,(b)幼鱼在持续光照条件下的运动速度,(c)幼鱼在不同光照刺激时长下运动速度;与对照组相比,*表示P <0.05,**表示P <0.01㊂Fig.2㊀The effect of ciprofloxacin exposure on the movement behavior of juvenile fishNote:(a)The movement speed of zebrafish larvae under light dark cycle,(b)The movement speed of zebrafish larvae under continuous light conditions,(c)The movement speed of zebrafish larvae under different light stimulation duration;compared with control,*represents P <0.05,**represents P <0.01.416㊀生态毒理学报第18卷图3㊀环丙沙星暴露对幼鱼乙酰胆碱酯酶活性的影响注:与对照组相比,*表示P <0.05㊂Fig.3㊀Effect of ciprofloxacin exposure on acetylcholinesteraseactivity of juvenile fishNote:Compared with control,*represents P <0.05.活性,破坏胆碱能系统㊂2.6㊀环丙沙星影响神经递质相关基因表达为了探究环丙沙星暴露引起的运动活性和应激惊恐反应行为变化的原因,测定了多巴胺通路关键基因(th1㊁dat ㊁nr4a2b 和bdnf )和血清素通路关键基因(th2㊁htr1aa ㊁htr5a ㊁htr1b 和htr2a )的表达㊂结果如图5(a)所示,在多巴胺通路所验证的基因只有dat 出现显著差异(P <0.01),随着浓度的升高而下调;th1和nr4a2b 基因表达量下调,bdnf 基因表达上调,未见显著差异㊂如图5(b)所示,血清素通路的th2㊁htr1aa 和htr5a 基因表达量随着浓度升高而显著上调(P <0.05),而htr1b 和htr2a 基因表达量亦上调,未见显著差异,这提示环丙沙星影响多巴胺和血清素通路关键基因的表达,影响仔鱼运动活性和光照刺激惊恐反应㊂2.7㊀环丙沙星影响神经发育相关的基因表达为了进一步探究环丙沙星对斑马鱼神经毒性的内在机制,测定了神经发育系统的关键基因表达,结果如图6所示,syn2a ㊁mbp ㊁α1-tubulin ㊁gfap ㊁nestin 和manf 基因表达量下调,shha ㊁elavl3基因表达量上调,gap43基因表达量低浓度上调㊁高浓度下调,而shha ㊁gfap 和nestin 基因表达量与对照组相比有显著差异(P <0.05),表明环丙沙星扰乱幼鱼的神经发育关键基因的表达,从而影响仔鱼运动行为,诱导神经毒性㊂图4㊀环丙沙星暴露对幼鱼胆碱类受体相关基因表达的影响注:与对照组相比,*表示P <0.05㊂Fig.4㊀Effect of ciprofloxacin exposure on the expressionof choline receptor related genes in juvenile fishNote:Compared with control,*represents P<0.05.图5㊀环丙沙星暴露对幼鱼神经递质相关基因表达的影响注:(a)多巴胺通路相关基因的表达水平,(b)血清素通路相关基因的表达水平;与对照组相比,*表示P <0.05,**表示P <0.01㊂Fig.5㊀Effect of ciprofloxacin exposure on expression of neurotransmitter related genes in juvenile fishNote:(a)The expression level of dopamine pathway related genes,(b)The expression level of serotoninpathway related genes;compared with control,*represents P <0.05,**represents P <0.01.第4期卯明彩等:环丙沙星对斑马鱼早期发育阶段的神经毒性研究417㊀图6㊀环丙沙星暴露对幼鱼神经发育基因表达的影响注:与对照组相比,*表示P <0.05㊂Fig.6㊀Effect of ciprofloxacin exposure on the expression of neurodevelopmental genes in juvenile fishNote:Compared with control,*represents P <0.05.3㊀讨论(Discussion )3.1㊀环丙沙星对运动行为的影响斑马鱼胚胎的自发运动反映斑马鱼的神经元活力,20~28hpf 的自发运动表型为尾部交替摆动,其运动频率较为稳定[30]㊂本研究结果表明,环丙沙星抑制斑马鱼胚胎的自发运动次数,具有浓度依赖性,这种自发运动行为常作为生命早期阶段神经发育毒性的评价指标[31]㊂刘倩等[32]的研究表明双酚S (BPS)显著抑制斑马鱼仔鱼的平均速度,对其运动行为能力产生影响,说明BPS 对斑马鱼仔鱼具有早期神经毒性作用;胡占英和张靖溥[33]研究结果显示长春新碱暴露斑马鱼胚胎后出现运动速度降低,不活跃运动持续时间增加等神经抑制行为;尚艳楠等[34]用细辛脑溶液暴露斑马鱼胚胎后导致其运动行为活跃度减低,表明细辛脑对斑马鱼胚胎有神经发育毒性作用㊂而本研究结果显示,环丙沙星暴露后,光暗周期下的运动速度降低㊁不同光照刺激时长条件下运动速度上升,惊恐反应性增加,使仔鱼处于应激紧张状态,改变其运动行为㊂3.2㊀环丙沙星对神经递质相关基因的影响乙酰胆碱酯酶是水环境中暴露于神经性药物的生物标志物,乙酰胆碱酯酶通过催化水解乙酰胆碱来终止其对胆碱受体的兴奋作用,维持神经冲动[35]㊂本研究结果表明,环丙沙星暴露后斑马鱼幼鱼的乙酰胆碱酯酶酶活性升高,表明乙酰胆碱受体减少,抑制神经兴奋冲动的传递㊂本研究也验证了胆碱能系统相关基因的表达,乙酰胆碱酯酶活性基因表达上调,与酶活结果一致,另烟碱类胆碱受体(乙酰胆碱)表达量下调,这表明环丙沙星暴露抑制胆碱类受体的表达,抑制兴奋传递,进而破坏胆碱能系统,对斑马鱼仔鱼产生神经性影响㊂有文章报道神经递质的合成分泌㊁神经元发育和眼部发育等因素能够影响斑马鱼幼鱼的运动行为[36-37]㊂多巴胺调节斑马鱼的运动活性,血清素调节斑马鱼焦虑行为[38],因此,本研究选择中枢神经发育系统㊁多巴胺和血清素通路的关键基因进行验证,探究环丙沙星暴露对斑马鱼幼鱼运动行为的内在分子机制变化㊂在多巴胺信号通路中,酪氨酸羟化酶(TH)是合成多巴胺的限速酶[39],而多巴胺转运蛋白(DAT)可转运多巴胺至胞浆分解,是调节多巴胺的神经递质,nr4a2b 负责多巴胺祖细胞的成熟㊁分化和存活,而bdnf 基因在神经发育中发挥着重要作用[40]㊂杨丽华等[41]用双酚A 暴露斑马鱼后干扰了nr4a2b 和th1的表达,促进神经递质的分化㊂在本研究中,dat 基因显著下调,th2㊁htr1aa ㊁htr5a 和htr2a 基因表达显著上调,这与Jia 等[27]的研究结果一致,这提示环丙沙星暴露扰乱斑马鱼幼鱼的多巴胺神经递质系统,进而引发运动活性和自由游泳行为的改变;上调血清素受体表达,促进兴奋传递,进而影响斑马鱼幼鱼的光照应激惊恐反应行为㊂3.3㊀环丙沙星对神经发育相关基因的影响验证中枢神经系统(CNS)相关基因的表达,其中α1-tubulin ㊁gfap 和nestin 对神经系统形成有重要作用,syn2a 参与突触形成,mbp 参与髓鞘形成,shha 在神经系统中充当信号分子,elavl3负责一种RNA 结合蛋白的表达,gap43负责神经细胞修复,而manf 是一种重要的神经营养因子[42-43],杨玉莹等[44]的研418㊀生态毒理学报第18卷究表明全反式维甲酸通过抑制mbp与syn2a的表达干扰斑马鱼仔鱼的神经发育及行为活力㊂而本研究中mbp与syn2a的基因表达下调,朱晓宇等[45]的研究结果表明仲丁威暴露斑马鱼胚胎后α1-tublin㊁shha㊁elavl3㊁gap43㊁syn2a㊁gfap㊁mbp和manf等基因的表达显著下调㊂本研究结果显示,shha基因表达量与对照组相比显著上升;gfap和nestin与对照组相比表达量显著下调,这表明环丙沙星暴露可能通过扰乱中枢神经系统的发育,进而对斑马鱼胚胎产生神经发育毒性㊂综上所述,环丙沙星暴露会抑制斑马鱼胚胎24 hpf自发运动,诱导乙酰胆碱酯酶活性,运动行为活跃和光照应激惊恐反应改变㊂同时,基因表达结果显示,多巴胺通路㊁中枢神经发育系统的dat㊁gfap和nestin基因下调,血清素通路㊁胆碱能系统和中枢神经发育系统的th2㊁htr1aa㊁htr5a㊁ache和shha基因上调可能与环丙沙星暴露后引起的神经毒性相关,但神经毒性背后的机制往往是高度复杂的,今后还需要进一步研究以深度解析环丙沙星对斑马鱼胚胎的神经毒性机制㊂通信作者简介:邱静(1979 ),男,研究员,博士生导师,研究方向为农产品质量安全风险评估㊂参考文献(References):[1]㊀Bird A.Molecular biology.Methylation talk between his-tones and DNA[J].Science,2001,294(5549):2113-2115 [2]㊀Bondarczuk K,Markowicz A,Piotrowska-Seget Z.Theurgent need for risk assessment on the antibiotic resist-ance spread via sewage sludge land application[J].Envi-ronment International,2016,87:49-55[3]㊀Chai T T,Cui F,Yin Z Q,et al.Chiral PCB91and149toxicity testing in embryo and larvae(Danio rerio):Appli-cation of targeted metabolomics via UPLC-MS/MS[J].Scientific Reports,2016,6:33481[4]㊀Costa V,Angelini C,De Feis I,et al.Uncovering thecomplexity of transcriptomes with RNA-seq[J].Journalof Biomedicine&Biotechnology,2010,2010:853916 [5]㊀Silveira A T,Maranho L A,Torres N H,et al.Assessmentof14C-sulfadiazine on Danio rerio(zebrafish)[J].Journalof Radioanalytical and Nuclear Chemistry,2018,318(2): 1001-1008[6]㊀Datson N A,van der Perk J,de Kloet E R,et al.Identifi-cation of corticosteroid-responsive genes in rat hippocam-pus using serial analysis of gene expression[J].The Euro-pean Journal of Neuroscience,2001,14(4):675-689[7]㊀Ding L H,Zang L X,Zhang Y N,et al.Joint toxicity offluoroquinolone and tetracycline antibiotics to zebrafish(Danio rerio)based on biochemical biomarkers and his-topathological observation[J].The Journal of Toxicologi-cal Sciences,2017,42(3):267-280[8]㊀Ellerbrock R E,Canisso I 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strip[J].ChineseJournal of Veterinary Medicine,2022,58(7):38-43(inChinese)[13]㊀牛曰华,张天闻,邹红梅,等.恩诺沙星及其代谢物环丙沙星在大黄鱼体内的代谢动力学[J].中国渔业质量与标准,2018,8(1):24-33Niu Y H,Zhang T W,Zou H M,et al.Pharmacokineticsof enrofloxacin and its metabolite ciprofloxacin in Larim-ichthys crocea[J].Chinese Fishery Quality and Standards, 2018,8(1):24-33(in Chinese)[14]㊀沈荣.三种氟喹诺酮药物的生物毒性研究[D].重庆:重庆大学,2019:18-22Shen R.Study on the biological toxicity of three fluoro-quinolones[D].Chongqing:Chongqing University,2019: 18-22(in Chinese)[15]㊀俞春红,潘任桃,孙志良,等.氟喹诺酮类药物致神经系统和软骨毒性的机制研究进展[J].中国抗生素杂志, 2013,38(11):810-814Yu C H,Pan R T,Sun Z L,et al.Recent advances in thestudy of mechanisms of neurotoxicity and chondrotoxicitycaused by fluoroquinolones[J].Chinese Journal of Anti-。

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第14卷第3期2019年6月V ol.14,No.3Jun.2019㊀㊀基金项目:国家自然科学基金(31670508);博士科研启动课题(5101219170132);博士后科研经费(5101219470216)㊀㊀作者简介:张杏丽(1987-),女,博士,研究方向为新型有机污染物的生态毒理与分子机制研究,E -mail :zhangxingli@ ㊀㊀*通讯作者(Corresponding author ),E -mail:zhouqx@DOI :10.7524/AJE.1673-5897.20190107001张杏丽,邹威,周启星.基于代谢组学技术分析磷酸三苯酯诱导斑马鱼胚胎发育毒性的分子机制[J].生态毒理学报,2019,14(3):79-89Zhang X L,Zou W,Zhou Q X.Molecular mechanisms of developmental toxicity of triphenyl phosphate on zebrafish embryo revealed by metabonomics [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2019,14(3):79-89(in Chinese)基于代谢组学技术分析磷酸三苯酯诱导斑马鱼胚胎发育毒性的分子机制张杏丽1,邹威1,周启星2,*1.河南师范大学环境学院,黄淮水环境与污染防治教育部重点实验室,河南省环境污染控制重点实验室,新乡4530072.南开大学环境科学与工程学院,环境污染过程与基准教育部重点实验室,天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室,天津300071收稿日期:2019-01-07㊀㊀录用日期:2019-03-11摘要:磷酸三苯酯(TPhP)是广泛存在于环境介质和生物体内的一种典型有机磷阻燃剂㊂为探求TPhP 诱发水生动物发育毒性的分子机制,本研究以斑马鱼为模式动物,将发育至2.5hpf (hours post fertilization)的斑马鱼胚胎暴露于0.0025㊁0.1㊁1㊁10㊁100和1000μg ㊃L -1TPhP 溶液至7dpf (days post fertilization),考察斑马鱼胚胎生长发育指标和线粒体功能的变化,通过代谢组学分析揭示相关分子机制㊂结果表明,环境相关浓度(0.0025㊁0.1和1μg ㊃L -1)TPhP 对斑马鱼胚胎发育无显著影响,但是轻微干扰了斑马鱼的代谢过程㊂100和1000μg ㊃L-1TPhP 暴露引起斑马鱼心跳速率㊁孵化率和线粒体膜电位明显下调,畸形率分别增加6.8倍和12.5倍,死亡率分别增加7.2倍和16.5倍㊂代谢组学分析发现,10㊁100和1000μg ㊃L -1TPhP 显著抑制斑马鱼氨基酸代谢,降低缬氨酸㊁亮氨酸和异亮氨酸水平,抑制氨酰-tRNA 生物合成过程;同时引起葡萄糖糖酵解过程和三羧酸循环发生障碍㊂氨基酸和糖代谢异常可能是TPhP 引起斑马鱼发育畸形的主要原因,线粒体功能紊乱可能是TPhP 诱发三羧酸循环障碍的原因㊂上述研究结果为TPhP 发育毒性机制分析提供了新思路㊂关键词:磷酸三苯酯;斑马鱼;发育毒性;代谢组学文章编号:1673-5897(2019)3-079-11㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AMolecular Mechanisms of Developmental Toxicity of Triphenyl Phosphate on Zebrafish Embryo Revealed by MetabonomicsZhang Xingli 1,Zou Wei 1,Zhou Qixing 2,*1.Key Laboratory for Yellow River and Huaihe River Water Environment and Pollution Control (Ministry of Education),Henan Key Laboratory of Environmental Pollution Control,College of Environment,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China2.Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria (Ministry of Education),Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control,College of Environmental Science and Engineering,Nankai University,Tianjin 300071,ChinaReceived 7January 2019㊀㊀accepted 11March 2019Abstract :Triphenyl phosphate (TPhP),a typical organophosphate flame retardant,is frequently detected in natural environment and organisms.In this study,the zebrafish were employed as model animal to explore the molecular. All Rights Reserved.80㊀生态毒理学报第14卷mechanisms of the developmental toxicity of TPhP on aquatic animal.The zebrafish embryos were exposed to 0.0025,0.1,1,10,100and1000μg㊃L-1TPhP solution from2.5hpf(hours post fertilization)to7dpf(days post fertilization),and the growths and mitochondrial function of zebrafish were investigated.The corresponding molec-ular mechanism was illuminated through metabolomics analysis.The results revealed that environmentally relevant concentrations(0.0025,0.1,and1μg㊃L-1)of TPhP had no significant effects on the development of zebrafish em-bryo,but slightly disturbed the metabolism of zebrafish.By contrast,the heartbeat rates,hatching rates and mito-chondrial membrane potential of zebrafish were decreased obviously when the concentrations of TPhP increased to 100and1000μg㊃L-1.The malformation rates increased by6.8and12.5times,and the mortality rates increased by 7.2and16.5times,respectively.In addition,metabonomics analysis showed that metabolism of zebrafish were prominently affected in10,100and1000μg㊃L-1TPhP-exposed treatments.Specifically,TPhP exposure inhibited amino acids metabolism by decreasing the levels of valine,leucine,isoleucine and inhibiting the aminoacyl-tRNA biosynthesis.The glucose glycolysis and tricarboxylic acid cycle were also inhibited.In conclusion,abnormal ami-no acids and glucose metabolism may be the main reasons for the developmental malformation of zebrafish induced by TPhP,and the disorder of tricarboxylic acid cycle was likely induced due to the mitochondrial dysfunction. These findings will provide new insights to the mechanisms of TPhP s developmental toxicity. Keywords:triphenyl phosphate;zebrafish;developmental toxicity;metabonomics㊀㊀随着各国对溴代阻燃剂环境效应的关注以及欧洲对五溴联苯醚和八溴联苯醚的禁用,有机磷阻燃剂(organophosphate flame retardants,OPFRs)作为理想替代品其使用量快速上升㊂OPFRs除了具有良好的阻燃效果外,兼有增塑和润滑的功效,广泛应用于建材㊁纺织㊁化工㊁塑料及电子等行业[1]㊂大多数OPFRs主要以物理添加方式而非化学键合成方式加入到材料中,在产品生命周期中极易从材料中泄露或者挥发进入周围环境㊂研究表明,OPFRs已广泛分布于各种环境介质,包括水环境㊁大气环境㊁土壤/沉积物及生物体内[2-6]㊂人体样本如尿液㊁血浆㊁头发㊁指甲和母乳中也检测出OPFRs[7-10]㊂我们之前的研究表明,由于污水灌溉,湖北㊁重庆㊁四川和广西地区采集的大米样品中均检测出OPFRs,其中受测的6种OPFRs总含量为0.38~287ng㊃g-1,平均含量为69.9ng㊃g-1[11];另外乳制品㊁饮料㊁肉类和蔬菜中也检测到OPFRs[11-12]㊂OPFRs已经成为一类新型有机污染物在全球范围内普遍存在㊂磷酸三苯酯(triphenyl phosphate,TPhP)是一类生产量和检出频率较高的OPFRs,广泛应用于聚氯乙烯材料㊁印刷电路板以及商业混合阻燃剂如FM550阻燃剂和AC073阻燃剂中㊂在我国华北地区,95%的河流水样中检出TPhP,最高浓度为15.7 ng㊃L-1[13]㊂松花江水体中TPhP浓度为4.5~65ng㊃L-1[14]㊂广州㊁贵屿㊁哈尔滨㊁西安㊁厦门㊁南京㊁成都和北京8个城市饮用水(自来水和瓶装水)中总OP-FRs浓度为85.1~325ng㊃L-1,TPhP是检出率较高的OPFRs[15]㊂TPhP已经被证实具有生殖毒性㊁发育毒性㊁内分泌干扰效应和神经毒性[16-19]㊂例如,Li 等[20]发现TPhP暴露影响了日本青鳉鱼精巢发育进而破坏了其生殖能力㊂Hong等[21]发现TPhP穿过血脑屏障进入中国成年雄性稀有鲦鱼头部引起神经毒性,通过破坏紧密连接复合体损坏血脑屏障的完整性,通过激活炎症反应因子抑制中枢神经区细胞增殖和神经树突的密度,最终破坏鱼的学习和记忆能力㊂Isales等[22]发现TPhP通过与视黄酸受体相互作用影响斑马鱼生长发育㊂TPhP在水环境中存在浓度为几ng㊃L-1到几百ng㊃L-1,目前,仍缺乏环境当量浓度下TPhP的毒理数据资料及详细的致毒机理㊂代谢组学是继基因组学和蛋白组学后新发展起来的一门学科,通过研究生物体内源性代谢物的整体变化,灵敏地指示和确证外来干扰物在组织和器官水平的毒性效应,某种特定代谢物的蓄积可能标志着某通路的缺陷或某信号响应的激活,而代谢物的动态变化可以作为毒性损伤的标志物,因此,代谢组学技术在回答低浓度环境污染物对生物体响应机制中具有不可替代作用[23]㊂我们曾利用代谢组学技术发现,痕量氧化石墨烯通过抑制氨基酸代谢㊁降低非饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值引起斑马鱼胚胎发育畸形[24]㊂然而,有关环境当量浓度TPhP对生物体代谢组学的影响研究尚未见报道㊂. All Rights Reserved.第3期张杏丽等:基于代谢组学技术分析磷酸三苯酯诱导斑马鱼胚胎发育毒性的分子机制81㊀鉴于此,本研究以斑马鱼为模式生物,采用基于气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)的代谢组学技术,探讨环境当量浓度(0.0025~1μg㊃L-1)和高于环境浓度(10㊁100和1000μg㊃L-1)TPhP暴露对斑马鱼整体代谢组学的扰乱程度,筛选对TPhP毒性敏感的目标代谢物,同时将变化的代谢物与斑马鱼胚胎生长发育毒性指标相结合,从代谢物水平阐述TPhP诱发斑马鱼发育毒性的分子机制,为今后详细阐述TPhP 生物毒性机制提供新思路和技术支撑㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀斑马鱼胚胎的获得与培养6个月龄的成年野生型斑马鱼(Danio rerio),购自国家斑马鱼资源中心(China Zebrafish Resource Center,CZRC)㊂斑马鱼养殖于装有控温装置的鱼缸中,养殖水为海盐浓度为60mg㊃L-1的人工海水,温度保持(28.5ʃ1)ħ,光周期为14h光照/10h黑暗,鱼缸中养殖水在循环过程中采用过滤系统进行过滤以保持水体清洁㊂饵料为丰年虾,每日早晚各喂1次㊂挑选个体大小相同雌雄斑马鱼于前一天晚上按照雌雄比例1ʒ1放入产卵盒中,用隔板隔开,将产卵盒放入人工气候培养箱中(中国博讯SPX-300I-C)㊂次日早上8:00将产卵盒中隔板取出,使雌雄斑马鱼自然交配,1h后,收集鱼卵,得到斑马鱼胚胎㊂胚胎用斑马鱼胚胎培养液E3溶液(5mmol㊃L-1 NaCl,0.17mmol㊃L-1KCl,0.33mmol㊃L-1CaCl2,0.33 mmol㊃L-1MgSO4,pH=7.4)清洗干净去除排泄物和死卵㊂然后将健康斑马鱼胚胎转移到E3溶液中,置于人工气候培养箱中培养至2.5hpf(hours post fertilization),用于后续实验研究㊂1.2㊀TPhP暴露实验TPhP标准品(CAS号115-86-6,纯度99.5%)购自上海百灵威科技有限公司,标准品用二甲基亚砜(DMSO,色谱纯,德国Merck)配制成浓度为10mg㊃L-1的储备液,置于4ħ冰箱中避光保存㊂然后用E3溶液将上述TPhP储备液稀释成1000㊁100㊁10㊁1㊁0.1和0.0025μg㊃L-1梯度浓度染毒溶液,染毒体系中DMSO终浓度为0.01%(体积比)㊂将2.5hpf斑马鱼胚胎暴露于E3溶液(空白对照组,CK),0.0025㊁0.1㊁1㊁10㊁100和1000μg㊃L-1TPhP溶液中7d㊂暴露实验在96孔板中进行,每孔一枚受精卵㊂每隔24h更换一次染毒溶液以保证TPhP染毒浓度恒定不变,整个胚胎染毒实验均在人工气候培养箱中进行,培养箱温度为(28ʃ1)ħ,光照周期为光暗比14h/10h㊂1.3㊀斑马鱼心跳㊁孵化㊁死亡和畸形观察每个浓度取120尾2.5hpf斑马鱼胚胎于96孔板中进行7d的暴露实验,设置3个生物重复,即每组包含40尾斑马鱼胚胎㊂体视镜(日本,Olympus ZL61)下观察记录72hpf斑马鱼胚胎的孵化情况,以幼鱼脱离绒毛膜作为成功孵化的标准㊂同时每组随机取出发育至72hpf的斑马鱼胚胎6尾,在倒置显微镜(日本,Olympus X71)下连续观察1min,记录斑马鱼胚胎的心跳次数㊂每天在体视显微镜下(日本,Olympus ZL61)观察40尾斑马鱼幼鱼的畸形和死亡情况,以不运动㊁无心跳和血液不流动作为胚胎死亡的标准,胚胎畸形按照心包/卵黄囊水肿㊁尾/脊椎弯曲和面部畸形等标准进行判断,并对畸形的斑马鱼进行拍照,最终统计各组发育至7dpf(days post fertilization)的斑马鱼幼鱼的死亡率和畸形率㊂1.4㊀斑马鱼幼鱼线粒体膜电位分析JC-1是检测线粒体膜电位的理想荧光探针,JC-1红色荧光到绿色荧光的转变显示线粒体膜电位下降㊂每个浓度取36尾发育至2.5hpf斑马鱼胚胎于96孔板中暴露7d,设置3个生物重复,即每组包含12尾斑马鱼㊂暴露结束后,每组随机取出6尾斑马鱼幼鱼,E3冲洗干净后,在含6μmol㊃L-1JC-1的E3溶液中避光孵育1h㊂染色结束后,用新鲜E3溶液冲洗数次,斑马鱼在0.08%三卡因(质量比)中麻醉后,在倒置荧光显微镜(日本,Olympus X71)下观察拍照,激发波长和发射波长分别为485nm和535nm㊂利用Image J软件对斑马鱼体内荧光强度进行定量分析㊂1.5㊀斑马鱼幼鱼的GC-MS代谢组学分析斑马鱼体内代谢物分析方法参考我们之前文献进行[24]㊂具体步骤如下;每个浓度取144尾2.5hpf 斑马鱼胚胎于96孔板中进行7d的暴露实验,设置3个生物重复,即每组包含48尾斑马鱼胚胎㊂暴露结束,每组随机取30尾斑马鱼幼鱼,迅速放入液氮中冷冻合并为一个样品,之后每个样品均加入2mL 提前保存于-20ħ的甲醇/氯仿/水混合提取液(体积比为2.5ʒ1ʒ1),在研钵中冰浴研磨成匀浆㊂微波萃取20min,萃取温度40ħ㊂萃取液转移到灭菌的1.5mL离心管中,4ħ高速离心10min,转移上清液到10mL离心管中,沉淀中再次加入1mL混合提取液,同等条件下微波萃取,离心,合并2次上清液到10mL离心管中㊂加入500μL灭菌后的高纯水到离心管样品中,离心后得到分层的样品溶液,上层是甲醇/水相提取物,下层是氯仿提取物,先氮. All Rights Reserved.82㊀生态毒理学报第14卷吹,然后冷冻干燥㊂将干燥得到的提取物连同离心管进行封口密封,置于-80ħ低温冰柜中保存㊂代谢物的GC-MS(美国,Agilent6890A/5977A)测定采用两步衍生化法㊂首先加入50μL用吡啶溶解的甲氧氨基盐酸盐,密封,涡旋振荡,30ħ水浴孵育90min,再加入80μL硅烷化试剂N-甲基-N-(三甲基硅烷)-三氟乙酰胺(MSTFA),37ħ水浴孵育30min㊂转移衍生化好的样品到样品瓶中㊂气相色谱参数:MDN-35毛细管色谱柱(30m),升温程序为80ħ,保留2min,然后以15ħ㊃min-1的速率升温到325ħ,保留6min,传输线温度为250ħ㊂气相色谱进样参数:进样量为1μL,进样口温度设置为230ħ,不分流进样模式,载气为氦气,流速2mL㊃min-1,进样模式为自动进样㊂质谱参数:离子源温度为250ħ,质量扫描范围是m/z70~600,采集速率每秒20个scan,溶剂延迟170s,检测器电压1700~1850V,质谱亏损设置为0,灯丝偏置电流为70V,仪器进行自动调谐㊂谱图解卷积参数:力可公司自带的商业软件Chroma TOF,基线消除设置为1(0.5~1),谱图平滑(smoothing)为5数据点(3~ 7),峰宽(peak width)3s(3~4s),信噪比S/N(signal-tonoise ratio)为10(2~15)㊂数据采集以scan模式获得总离子流色谱图(TIC),利用NIST14数据库对代谢物进行定性分析,生成包含样本信息㊁化合物名称㊁保留时间㊁峰面积和定性值等信息的文件㊂根据保留时间和定性值筛选代谢物,以峰面积表示代谢物的相对含量㊂1.6㊀数据处理所有的实验组均设置3个生物重复,结果用平均值ʃ标准偏差表示㊂所得实验数据使用SPSS20.0统计软件进行单因素方差(ANOV A)分析,当P<0.05时,认为在统计学上具有显著性㊂代谢物热图利用软件MeV4.9绘制㊂同时将筛选出的代谢物数据导入SIMCA-P13.0(瑞典,Umetrics AB,Umea)软件包进行多元统计分析,数据先用无监督统计模型主成分分析(principal components analysis,PCA),得出对照组和处理组之间代谢物的离散趋势㊂再进行有监督统计模型的正交最小二乘法判别分析(orthogonal par-tial least squares discriminate analysis,OPLS-DA)[25-26],将差异代谢物与斑马鱼的畸形率建立相关性,选择定义变量权重重要性排序(variable importance in projec-tion,VIP)大于1的变量进行研究㊂最后,用Metabo-Analyst3.0数据库对差异倍数在1.5倍的代谢物进行通路定位,找出显著富集的代谢通路[27]㊂2㊀结果(Results)2.1㊀斑马鱼胚胎发育分析如图1a所示,空白对照组斑马鱼72hpf孵化率达96%,当TPhP浓度为0.0025~10μg㊃L-1时,斑马鱼胚胎孵化率与空白对照组无显著差异,当TPhP 浓度为100和1000μg㊃L-1时,胚胎孵化率分别为73.3%和46.7%,显著低于对照组(P<0.05)㊂当TPhP 浓度为10㊁100和1000μg㊃L-1时,斑马鱼72hpf心率明显低于空白对照组(图1b)㊂TPhP浓度为100和1000μg㊃L-1,斑马鱼幼鱼7d的死亡率分别为18.2%和38.9%,畸形率分别为18.0%和31.1%,显著高于空白对照组(图1c和图1d)㊂畸形类型包括脊柱弯曲㊁尾巴弯曲㊁卵黄囊肿㊁心包囊肿,其中脊柱㊁尾巴弯曲和心包囊肿出现的频率显著大于其他畸形类型,TPhP浓度越大,心包囊肿出现频率越大,表明TPhP显著影响斑马鱼的心脏发育㊂2.2㊀线粒体膜电位分析对暴露7d的斑马鱼幼鱼进行JC-1染色,倒置荧光显微镜下观察发现,空白对照组红色荧光较多(图2a),高浓度TPhP处理组斑马鱼体内绿色荧光较多(图2b)㊂当TPhP浓度为100和1000μg㊃L-1时,红色和绿色相对荧光强度比值明显低于空白对照组(图2c),当TPhP浓度为0.0025~10μg㊃L-1时,差异不显著㊂结果表明,当TPhP浓度ȡ100μg㊃L-1,斑马鱼幼鱼线粒体膜电位下降,TPhP诱导斑马鱼线粒体损伤㊂2.3㊀斑马鱼幼鱼代谢组学分析空白对照组和TPhP处理组斑马鱼幼鱼代谢组学分析结果如表1和图3所示㊂样本经甲醇/氯仿/水混合提取液提取,衍生化后进行GC-MS分析,共得出54种代谢物,主要包括碳水化合物㊁氨基酸㊁脂肪酸㊁其他小分子酸和胆固醇等㊂代谢物的相对水平通过热图展示(图3a),从代谢轮廓可以看出,随着TPhP浓度增高,大部分代谢物相对含量降低㊂层次聚类(HLC)分析发现,7个实验组可以分成3组,分别是空白对照组/0.0025μg㊃L-1处理组/0.1μg㊃L-1处理组,1μg㊃L-1处理组/10μg㊃L-1处理组/100μg㊃L-1和1000μg㊃L-1处理组,表明当TPhP浓度ȡ1μg㊃L-1时,影响斑马鱼幼鱼的代谢过程㊂通过SIMCA-P 13.0对代谢物进行PCA分析发现,空白对照组㊁0.0025与0.1μg㊃L-1处理组聚集在一起,没有明显分开,而1㊁10㊁100和1000μg㊃L-14个处理组与空白. All Rights Reserved.第3期张杏丽等:基于代谢组学技术分析磷酸三苯酯诱导斑马鱼胚胎发育毒性的分子机制83㊀图1㊀磷酸三苯酯(TPhP )暴露对斑马鱼胚胎孵化率(a )㊁心率(b )㊁致死率(c )和畸形率(d )的影响注:*表示处理组斑马鱼胚胎考察指标与对照组相比差异显著(P <0.05)㊂Fig.1㊀Effects of triphenyl phosphate (TPhP)on the hatching (a),heart rate (b),mortality (c)and malformation (d)of zebrafish during embryogenesisNote:*denotes P <0.05,compared to thecontrol.图2㊀TPhP 对斑马鱼幼鱼线粒体膜电位的影响注:a ,空白对照组;b ,1000μg ㊃L -1TPhP 处理组;*表示处理组考察指标与对照组相比差异显著(P <0.05)㊂Fig.2㊀Effects of TPhP on mitochondrial membranepotential in zebrafish larvaeNote:a,zebrafish larvae in control;b,zebrafish larvae in 1000μg ㊃L -1TPhP group;*denotes P <0.05compared to the control.对照组明显分开(图3b),表明这4个处理组中斑马鱼幼鱼代谢状况与空白对照组存在明显的差异,PCA 分析进一步证实TPhP 浓度在ȡ1μg ㊃L -1时干扰了斑马鱼幼鱼的代谢过程㊂通过SPSS 2.0对TPhP 处理组总代谢物㊁碳水化合物㊁氨基酸和脂肪酸含量与空白对照组含量进行显著性分析,结果如图4所示㊂当TPhP 浓度为0.0025μg ㊃L -1时,总代谢物和各单类代谢物与空白对照组的差异水平P 值接近1,表明0.0025μg ㊃L -1TPhP 对斑马鱼代谢过程无显著影响㊂但是随着TPhP 浓度增加,P 值呈降低趋势,TPhP 浓度越高,对斑马鱼幼鱼代谢过程影响越明显㊂当TPhP 浓度为0.1~1000μg ㊃L -1时,P 碳水化合物<P 氨基酸<P 脂肪酸,其中当TPhP 为1000μg ㊃L -1时,P =0.039<0.05,表明碳水化合物代谢对TPhP 最敏感㊂从表1也可以看出,空白对照组㊁0.0025和0.1μg ㊃L -1TPhP 处理组分别检测出11㊁9和8种糖类(糖醇),当TPhP 浓度ȡ10μg ㊃L -1时,斑马鱼体内检测出的糖类代谢物的种类为3~4种㊂其次,受TPhP 暴露影响显著的代谢物是氨基酸,TPhP 对脂肪酸代谢的影响不显著㊂. All Rights Reserved.84㊀生态毒理学报第14卷图3㊀代谢物层次聚类分析(a)和主成分分析(b)Fig.3㊀Hierarchical clustering analysis(a)and principal component analysis(b)of metabolites表1㊀不同处理组斑马鱼幼鱼体内代谢物的相对含量(a.u) Table1㊀Metabolites of zebrafish larvae in different treatment groups(a.u)代谢物Metabolites 空白对照Control0.0025μg㊃L-10.1μg㊃L-11μg㊃L-110μg㊃L-1100μg㊃L-11000μg㊃L-1Alanine89102890558856741231412304014628670Glycine680132529248513157367285349966224287197748L-Proline661539659542507725135055000L-Serine8487670216622444521953481332010L-Threonine88660774507300088970761495167033221Methionine18048109809879889311230332706621Phenylalanine96070903557645386230667217299086220Sarcosine27756201102078019124000Valine610390605725557800112309883404234111132Leucine11751217483510606973694606714223927563Isoleucine1488451762901528506536149680455300Arabinitol907604395400000D-Fructose5938022360169500000 D-Galactopyranoside5214771071099860000 d-Galactose4744314211230856908239972109588632 D-Glucopyranoside044867590289188070000 d-Glucose68413249413320512983133684363344902d-Mannose370940951570000 . All Rights Reserved.第3期张杏丽等:基于代谢组学技术分析磷酸三苯酯诱导斑马鱼胚胎发育毒性的分子机制85㊀续表1代谢物Metabolites 空白对照Control0.0025μg㊃L-10.1μg㊃L-11μg㊃L-110μg㊃L-1100μg㊃L-11000μg㊃L-1D-Ribopyranose4080531390366020000 D-Turanose86605657543497712971413857253818960 D-Xylofuranose351620********* Lyxose10337000000 Maltose30479020563700000 Butanedioic acid2228262615151988951089421008229325977420 Butanoic acid23845999569547051517557920884539787118004 Decanoic acid1305200896187433084479 Docosahexaenoic acid05120012427399668366501 Eicosanoic acid23189000000 Malic acid882290802317792109562250502216402219221180 Hexadecanoic acid662417540728345713737175621659554972402539 Hexanedioic acid4787466521415950000 Linolenic acid64468942296318223764265390 Nonanoic acid1001320116175636673077450n-Pentadecanoic acid1308211890110760667308891 Octadecanoic acid940396444729434155352491372921215646184970 Octanoic acid28196205403001928006283212237822165 Oxalic acid1216501619016104025512193581332096 Propanedioic acid53145662108524601068344458960 Propanoic acid644860345429717482615652469056359303252829 Aconitic acid3163903451853117611222651122008895077562 Tetradecanoic acid5688618621081970590669525113560885493301 Acetic acid23617411465471122846086377913 Carboxylic acid486843389223229553821310929139055665 Glyoxylic acid2037510195382880192132414326942 Gluconic acid761766199987116711120899878890 Galacturonic acid2789027328194371100210456998719980 Lactic acid7972564629523802281620548169649646 Cholesterol2237228043542841585321119545086453146 Creatinine894895706604221078000 Glutamine002851829465000 Glycerol18929428497281239339970000 Monostearin11220818996712171220007827558401063442 Myo-Inositol2058429112471261252552914649807578535 Urea657087026318804792472057783406002.4㊀斑马鱼代谢成分的改变与发育毒性相关性分析为进一步确认与斑马鱼生长发育相关的代谢物的变化,本实验利用OPLS-DA进行差异代谢产物与畸形率相关性分析,Y变量是发育畸形率,X变量是代谢物,分析结果如图5㊂在54种代谢物中,12种代谢物与畸形率呈现正相关关系;其余42种代谢物与畸形率呈负相关关系㊂另外对代谢物进行了变量重要性投影,得到VIP>1的23种代谢物,在图5中用星号标出,OPLS-DA分析表明,TPhP胁迫下,此23种代谢物的变化与斑马鱼畸形相伴发生,代谢物的变化可能是TPhP引起斑马鱼胚胎畸形的分子机制㊂其中,与畸形率正相关且VIP>1的代谢物有. All Rights Reserved.86㊀生态毒理学报第14卷3种,分别是甘油-硬脂酸酯(monostearin)㊁葡萄糖(d -glucose)和草酸(oxalic acid),表示这3种代谢物对畸形发生有显著的促进作用㊂与畸形率呈负相关且VIP>1的代谢物有18种,如胆固醇(cholesterol)㊁甘氨酸(glycine)㊁丝氨酸(L -serine)㊁亮氨酸(leucine)㊁异亮氨酸(isoleucine)㊁苏氨酸(L -threonine)㊁硬脂酸(octade -canoic acid)㊁辛酸(octanoic acid)和乳酸(lactic acid),表示这18种代谢物对畸形发生有显著的抑制作用㊂进一步将差异代谢数据导入MetaboAnalyst 3.0进行代谢路径富集分析,结果如表2所示㊂TPhP 显著影响斑马鱼胚胎发育过程的路径中,4条是与氨基酸相关的代谢通路,2条是与碳水化合物相关的代谢通路,其中对氨酰-tRNA 生物合成通路,缬氨酸㊁亮氨酸和异亮氨酸代谢通路,甘氨酸㊁丝氨酸和苏氨酸代谢通路影响最显著,由表1可知,以上代谢通路中氨基酸水平在TPhP ȡ10μg ㊃L -1处理组均显著降低,表明TPhP 抑制斑马鱼氨基酸代谢㊂3㊀讨论(Discussion )本实验将斑马鱼胚胎暴露于0.0025~1000μg㊃L -1的TPhP 溶液7d ,结果发现,当TPhP 浓度低于10μg ㊃L -1时,斑马鱼胚胎孵化率㊁心率㊁死亡率和畸形率与空白对照组相比无明显差异,表明低浓度TPhP 对斑马鱼胚胎无显著毒性㊂当TPhP ȡ100μg㊃L -1时,明显抑制了斑马鱼心跳速率和孵化率,增大斑马鱼胚胎的畸形率和死亡率㊂TPhP 浓度为1000μg ㊃L -1时,斑马鱼幼鱼死亡率为38.9%,这与之前报道的TPhP 对斑马鱼胚胎的96h 半数致死浓度为1.53mg ㊃L -1大略一致[28]㊂中国科学院水生生物研究所周炳升教授团队研究发现,100μg ㊃L -1TPhP 显著抑制斑马鱼心跳速率和游泳速度,引起斑马鱼胚胎发生明显的畸形[29]㊂图4㊀TPhP 处理组代谢物相对于空白对照组的显著性水平注:P 值通过ANOV A 方差分析中的Tukey s 检验获得㊂Fig.4㊀Significance differences of comparing metabolites fromTPhP exposed groups with the controlNote:The significant level P at vertical axis is obtainedby ANOV A with Tukey stest.图5㊀斑马鱼差异代谢物与畸形率的相关性分布图注:与斑马鱼畸形率成负相关且VIP 值大于1的代谢物用黑色星号标出,与斑马鱼畸形率成正相关且VIP 值大于1的代谢物用红色星号标出㊂Fig.5㊀Relationships between differential metabolites and malformation rate of zebrafishNote:The metabolites labeled with red and black asterisks represent the metabolites with a VIP greaterthan one that positively and negatively contribute to the malformation rate,respectively.. All Rights Reserved.第3期张杏丽等:基于代谢组学技术分析磷酸三苯酯诱导斑马鱼胚胎发育毒性的分子机制87㊀表2㊀TPhP显著干扰的代谢通路Table2㊀The metabolite pathways significantly disordered by TPhP通路编号Pathway No.中文名称Chinese name英文名称English name代谢物MetabolitesP值P valuedre00052半乳糖代谢Galactose metabolism d-Glucose,Glycerol,D-Mannose,Myo-inositol9.7E-3 dre000500淀粉和蔗糖代谢Starch and sucrose metabolism D-Maltose,d-Glucose,Frucose 3.5E-2dre00970氨酰tRNA生物合成Aminoacyl-tRNA biosynthesisPhenylalanine,Glutamine,Glycine,L-Serine,Methionine,Valine,Alanine,Isoleucine,Leucine,L-Threonine,L-Proine5.67E-06dre00290缬氨酸㊁亮氨酸和异亮氨酸生物合成Valine,leucine andisoleucine biosynthesisL-Threonine,Leucine,Valine,Isoleucine6.39E-4dre00260甘氨酸㊁丝氨酸和苏氨酸代谢Glycine,serine andthreonine metabolismL-Serine,Glycine,Sarcosine,L-Threonine,Glyoxylic acid3.0E-3dre00250丙氨酸㊁天冬氨酸和谷氨酸盐代谢Alanine,aspartate andglutamate metabolismAlanine,Glutamine,Succinic acid 4.4E-2㊀㊀代谢组学研究发现,当TPhP浓度为0.1和1μg ㊃L-1时,轻微干扰斑马鱼代谢过程,此浓度对斑马鱼胚胎生长发育无影响,表明代谢物变化是污染物生物毒性研究中更加敏感的指标㊂当TPhP浓度为10㊁100和1000μg㊃L-1时显著干扰斑马鱼代谢过程,主要影响斑马鱼氨基酸代谢和碳水化合物代谢㊂KEGG通路分析表明,TPhP显著干扰斑马鱼氨酰-tRNA生物合成过程,该过程是将氨基酸合成为蛋白质的关键步骤,斑马鱼氨酰-tRNA生物合成过程受到干扰,会出现明显的脊柱弯曲和身体短小畸形[30],这2种畸形类型在TPhPȡ100μg㊃L-1的暴露组中出现频率均显著高于空白对照组㊂支链氨基酸(BCAAs)在生物体的骨骼肌肉发育和合成代谢过程中起关键作用,BCAA代谢受到影响将会对生物体身体产生危害[31-32]㊂本实验中,TPhP暴露组中斑马鱼体内3个重要BCAAs,缬氨酸(valine)㊁亮氨酸(leucine)和异亮氨酸(isoleucine)下调倍数为2~45倍(表1),OPLS-DA分析也表明,大多数下调的氨基酸与畸形发生有关(图5),因此,氨基酸代谢水平下调可能是TPhP引起斑马鱼畸形和死亡率升高的原因㊂葡萄糖是斑马鱼胚胎发育过程中主要能量来源,通过糖酵解生成乳酸来提供能量,本研究中TPhP暴露使斑马鱼体内葡萄糖含量升高和乳酸含量降低,表明TPhP引起斑马鱼体内糖酵解途径的紊乱㊂体内高含量葡萄糖会引起斑马鱼卵黄囊和头部畸形[33],由此可知,心包囊肿和卵黄囊肿畸形发生可能与体内糖代谢紊乱有关㊂同时,三羧酸循环的中间产物苹果酸(malic acid)㊁琥珀酸(butanedioic acid)和乌头酸(aconitic acid)含量在TPhPȡ10μg㊃L-1的3个处理组中均明显降低,表明三羧酸循环代谢通路发生障碍㊂斑马鱼线粒体膜电位分析表明, 100和1000μg㊃L-1TPhP处理组斑马鱼幼鱼线粒体膜电位明显降低(图2),线粒体是斑马鱼进行三羧酸循环产生能量的场所,因此三羧酸循环发生障碍,可能与线粒体功能紊乱有关㊂综上所述,环境当量浓度TPhP(<10μg㊃L-1)对斑马鱼胚胎心跳㊁孵化㊁畸形和死亡无显著影响,但是轻微干扰了斑马鱼代谢过程,浓度大于10μg㊃L-1 TPhP显著引起斑马鱼胚胎心率㊁孵化率和线粒体膜电位的下降,引起胚胎死亡率和畸形率增加,同时显著干扰了斑马鱼的氨基酸代谢和糖代谢,降低支链氨基酸的含量,引起葡萄糖糖酵解过程和三羧酸循环代谢过程紊乱㊂代谢物的变化与生长发育毒性指标表现出很好的相关性,本文从内源代谢物角度阐述了TPhP引起斑马鱼胚胎发育毒性的分子机制,为今后深入开展TPhP水生生物毒性机制的研究提供新思路和技术支撑㊂通讯作者简介:周启星(1963-),男,博士,教授,博士生导师,长江学者特聘教授,国家杰出青年科学基金获得者㊂主要从事污染生态㊁生态地学㊁环境基准和污染环境修复等方面的研究㊂在国内外重要学术刊物上发表论文600余篇㊂参考文献(References):[1]㊀Zhang W W,Wang P,Li Y M,et al.Spatial and temporaldistribution of organophosphate esters in the atmosphereof the Beijing-Tianjin-Hebei Region,China[J].Environ-. All Rights Reserved.。

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第5期2023年10月V ol.18,No.5Oct.2023㊀㊀基金项目:国家自然科学基金面上项目(22176176)㊀㊀第一作者:钱宝留(1998 ),男,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E -mail:*****************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:*****************.cnDOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230515002钱宝留,孙烽铸,吕军生,等.斑马鱼幼鱼尾鳍再生的不同阶段对微塑料毒性响应的差异[J].生态毒理学报,2023,18(5):94-102Qian B L,Sun F Z,Lv J S,et al.Different response to toxicity of microplastics in zebrafish larvae at different stages of caudal fin regeneration [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(5):94-102(in Chinese)斑马鱼幼鱼尾鳍再生的不同阶段对微塑料毒性响应的差异钱宝留,孙烽铸,吕军生,吕林欢,孙立伟*浙江工业大学环境学院,杭州310032收稿日期:2023-05-15㊀㊀录用日期:2023-07-25摘要:微塑料污染已成为全球性的环境问题㊂研究证实,水环境中的微塑料可被水生生物摄取,并在不同生物学水平上产生一系列的毒性效应㊂同时,对于野生生物而言,保持正常的组织修复与再生能力对于个体和种群均极为重要㊂然而,之前的研究已表明微塑料暴露可抑制斑马鱼幼鱼的尾鳍再生㊂但是,再生的不同阶段对于微塑料毒性响应是否存在差异则未见报道㊂本研究以聚苯乙烯微球为微塑料的代表,先通过比较斑马鱼幼鱼在尾鳍再生不同阶段(即断尾前㊁再生前期和再生后期)暴露于微塑料(3mg ㊃L -1)后的尾鳍面积以及游泳行为的变化,从尾鳍结构和功能上确定再生不同阶段对微塑料毒性效应的响应差异;进一步地,通过研究免疫系统和再生信号通路关键基因的转录水平变化,初步揭示其中的相关机制㊂研究发现,微塑料暴露能够导致再生尾鳍面积减少㊂相较于断尾前或再生后期暴露,再生前期暴露的抑制程度更为显著㊂对幼鱼游泳行为的影响而言,不同阶段间也有类似的趋势㊂同时,3个阶段的暴露似乎能下调免疫系统相关基因的转录水平,且再生期2个阶段暴露的影响相较于断尾前暴露更为显著㊂而对于再生信号通路相关基因而言,其转录水平变化虽然较为复杂,但也呈现再生阶段暴露的影响更为显著的趋势㊂总之,本研究表明再生阶段暴露可能是微塑料抑制尾鳍再生的重要窗口期,微塑料颗粒和伤口微界面的相互作用在其影响尾鳍再生时具有重要的意义㊂关键词:微塑料;鱼类;组织修复与再生;基因转录文章编号:1673-5897(2023)5-094-09㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:ADifferent Response to Toxicity of Microplastics in Zebrafish Larvae at Dif-ferent Stages of Caudal Fin RegenerationQian Baoliu,Sun Fengzhu,Lv Junsheng,Lv Linhuan,Sun Liwei *College of Environment,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310032,ChinaReceived 15May 2023㊀㊀accepted 25July 2023Abstract :Microplastic pollution has been considered as a global problem.It has been confirmed that the micro -plastics in the aquatic environment can be ingested by aquatic organisms,and consequently result in toxicological effects at the various level of biological organization.On the other hand,the ability to restore tissue morphology and function of wildlife is critical for individuals and population.However,our previous study has demonstrated that microplastics can inhibit the fin regeneration in zebrafish larvae,but whether the responses will differ or not when following exposure at different stages of regeneration remains unclear.In this study,the polystyrene micro -第5期钱宝留等:斑马鱼幼鱼尾鳍再生的不同阶段对微塑料毒性响应的差异95㊀spheres were adopted as model particles of microplastics,and the zebrafish larvae following caudal fin amputation were exposed to microplastics(3mg㊃L-1)at different stages of regeneration(i.e.,the pre amputation stage,the early or the late stage of regeneration post amputation).Firstly,the area of regenerating fin and the locomotor behaviors of fish were measured,and the effects of microplastic exposure at different stages were compared morphologically or functionally.Moreover,the transcript level of genes involved in the signaling networks regulating fin regenera-tion and the immune response were determined to reveal the underlying mechanisms.It was confirmed that micro-plastic exposure could inhibit the fin regeneration,and the effect was more significant when following exposure at the early stage of regeneration.Similar pattern was observed when the locomotor behaviors of fish exposed at dif-ferent stages of regeneration were compared.It was seemed that exposure to microplastics down-regulated the tran-scription of genes related to immune system,and the effects were more significant for the exposure post amputa-tion.Regarding the genes involved in the signaling networks regulating fin regeneration,although the changing trend of transcriptional response differed among genes,the impacts of exposure post amputation were seemed to be more substantial.In conclusion,this study demonstrated the regenerating stages post amputation were the important window of microplastic exposure,and the interaction between the particles and the tissue around the amputated plane was critical for the inhibitive effects of microplastics on fin regeneration.Keywords:microplastic;fish;tissue repair and regeneration;gene transcription㊀㊀自20世纪初人工合成塑料问世以来,便因其成本低廉㊁可塑性强等优异特性被大量使用㊂近60年来,塑料的产量呈爆炸式增长,目前全球每年生产量已经超过3.6亿t[1]㊂由于塑料耐降解㊁回收利用率低,导致其废弃物大量进入环境,并在其中累积㊁迁移和扩散[1]㊂环境中的塑料废弃物在物理㊁(光)化学以及生物作用下,可以进一步碎裂为更小的固体颗粒[2-3]㊂其中,粒径<5mm的塑料碎片和颗粒被称为微塑料[4]㊂同时,也有部分微塑料是人们特意制造的,比如个人护理品中的塑料微珠[5]㊂近年来,微塑料已被证实广泛存在于自然界中,并被认为是塑料废弃物的主要形态[6]㊂水环境是塑料污染的重要汇㊂据估计,全球的塑料废弃物中约有11%进入水体环境[7],因此,微塑料污染对于水生生态系统的潜在危害受到了广泛关注㊂大量的研究都已表明,微塑料可被水生生物摄取,并可通过食物链传递,在不同生物学水平上产生一系列的毒性效应[6,8]㊂野生生物在环境中不可避免会遭受组织损伤,而影响其在环境中的适应性,因此,正常的组织修复与再生能力对于生物个体和种群均是极为重要的[9]㊂另一方面,组织受损但未能及时修复的生物可能对环境污染物的毒性作用更为敏感㊂然而,目前针对微塑料水生生物毒性的研究基本局限于健康生物体,从而极有可能低估其生态风险㊂相对于哺乳动物,鱼类等低等脊椎动物具有更强大的再生能力㊂其中,斑马鱼尾鳍再生模型由于其组织结构相对简单㊁易于手术操作以及再生过程迅速等诸多优点而被广泛应用于再生科学以及毒理学中[10]㊂研究表明,经切除后,尾鳍的再生过程,即所谓 割处再生(epimorphic regeneration) ,在斑马鱼成鱼中持续2周,而幼鱼则仅需3d即可完成[10-11]㊂在尾鳍被切除后,斑马鱼将会激活各种炎症以及再生相关基因,以促进尾鳍再生的顺利进行㊂整个再生过程可细分为4个阶段,即伤口愈合㊁上皮化㊁芽基形成和外生长[10,12]㊂对于成鱼而言,在尾鳍切除后的0~12h,上皮细胞快速向断尾处迁移,促使伤口闭合,这个过程称为伤口愈合阶段㊂12~24h则为上皮化阶段,此过程中间质细胞向伤口迁移,使伤口表皮化㊂之后的24~48h则为芽基形成阶段,随着表皮细胞的积聚,以及各种细胞的去组织化,伤口处开始形成芽基,以便后续再生过程的进行㊂芽基大致分为近端㊁远端㊁两侧区域㊂有别于正常的生长发育,芽基只存在于组织再生之中㊂而48h直至尾鳍修复完全称之为外生长阶段,该阶段主要是近端的芽基快速生长以促使尾鳍的再生[10,12]㊂笔者研究组之前的研究已证实微塑料可以影响鱼类组织修复与再生能力[13]㊂然而,斑马鱼的尾鳍再生是一个高度组织化的过程,而微塑料作为颗粒物的特性使其对于不同再生阶段的暴露途径以及毒性效应存在差异,尤其是断尾创口愈合前后,颗粒物和创口微界面的相互作用可能在微塑料影响尾鳍再生时具有重要意义㊂通过对斑马鱼尾鳍不同的再生96㊀生态毒理学报第18卷阶段进行微塑料的暴露,对比不同阶段对微塑料的响应差异,可以明确微塑料干扰尾鳍再生的窗口期,从而进一步揭示微塑料影响组织修复与再生的内在作用机制㊂本研究以目前相关文献较多的聚苯乙烯微球为微塑料的代表,先通过比较斑马鱼幼鱼在尾鳍再生不同阶段暴露于微塑料的尾鳍再生面积以及游泳行为的变化,从结构和功能上确定不同阶段对微塑料毒性效应的响应差异;进一步通过研究关键基因的转录水平变化,初步揭示其中的相关机制㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀化学试剂聚苯乙烯微球(CAS:9003-53-6,标称直径为50 nm)购自上海阿拉丁试剂有限公司㊂超声混匀后微塑料用超纯水配制成实验所需浓度㊂1.2㊀实验动物本实验用斑马鱼为购置于中国斑马鱼资源中心的AB系野生型,约为6个月龄,健康状况良好㊂成鱼养殖用水为经曝气和活性炭过滤处理24h以上的自来水㊂雌雄分开饲养,每天早晚按时喂食丰年虫和商品饲料㊂每周定时清理鱼缸以保证水质清洁㊂鱼房温度控制在(28.0ʃ1.0)ħ,光暗周期为14h 光ʒ10h暗㊂按照标准方法配鱼[13],收集斑马鱼鱼卵㊂28ħ下约72h胚胎孵化,挑选发育正常的幼鱼用于后续研究㊂1.3㊀斑马鱼幼鱼尾鳍切除以及微塑料的暴露实验设置4个处理组,包括1个曝气水对照组(记为Cont.)以及3个尾鳍再生不同阶段的微塑料暴露组,具体如图1所示㊂我们之前的研究表明1mg ㊃L-1的50nm聚苯乙烯微球在断尾后持续暴露可以抑制斑马鱼幼鱼尾鳍再生[13]㊂考虑到本研究的实验设计,微塑料暴露浓度均设为3mg㊃L-1㊂其中,3个不同阶段暴露分别为断尾前暴露,即暴露阶段在72 ~108hpf(hour post fertilization,即受精后小时数),记为3mg㊃L-1-1;断尾后再生前期暴露(108~144 hpf),记为3mg㊃L-1-2;以及再生后期暴露(144~180 hpf),记为3mg㊃L-1-3㊂在暴露阶段之外,其他时间幼鱼均在曝气水中培养㊂在108hpf,所有幼鱼均进行断尾手术㊂断尾时,用三卡因(tricaine,CAS:886-86-2,浓度为0.016%)溶液浸泡并麻醉幼鱼,之后将幼鱼平铺于琼脂板上,借助体视显微镜,用刀片紧沿着幼鱼脊柱末端切除尾鳍[13-14]㊂断尾后的幼鱼在曝气水中复苏后,放回之前的处理组内㊂暴露实验在6孔板中进行,每个孔5mL暴露液,放置20条幼鱼㊂每个处理4个平行㊂在180hpf,暴露实验结束㊂1.4㊀斑马鱼幼鱼尾鳍再生面积及游泳行为测定在180hpf暴露实验结束后,每个平行中随机挑选5条幼鱼,在显微镜进行拍照,记录幼鱼尾鳍再生状况,并利用ImageJ软件对尾鳍的再生面积进行量化,并以对照组进行归一[13]㊂同样,在暴露实验结束后,每个平行中随机挑选9条幼鱼并转移到96孔板中,每孔1条幼鱼,并将暴露液更换为100μL曝气水㊂通过Zebralab高通量行为分析仪(Viewpoint,法国)先后对斑马鱼幼鱼自由游泳行为和在光周期下的游泳行为进行测定[13]㊂具体程序为:在连续光照适应20min后,进行20min持续光照下自由游泳行为测定,之后在40 min明暗光周期下(10min暗-10min明-10min暗-10min明)检测幼鱼对明暗转化刺激下的行为响应㊂图1㊀斑马鱼幼鱼断尾和微塑料暴露实验示意图Fig.1㊀Schematic of caudal fin amputation and microplastic exposure for larval zebrafish第5期钱宝留等:斑马鱼幼鱼尾鳍再生的不同阶段对微塑料毒性响应的差异97㊀1.5㊀斑马鱼幼鱼免疫系统及再生信号通路相关基因的转录水平测定㊀㊀幼鱼断尾和暴露均如前所述㊂在暴露实验结束后,将幼鱼取样(4个平行,每个平行约20条鱼合并为一个样品),并整体匀浆,用Trizol (Takara ,日本)按照厂商的说明提取总RNA ㊂测定总RNA 的浓度和纯度,在确认符合要求后,通过反转录试剂盒(Re -verTra Ace qPCR RT kit,Toyobo ,日本)将RNA 合成为cDNA 第一链㊂参考之前的研究[13],选取了再生信号通路相关基因,同时考虑到免疫系统在组织修复与再生中的重要作用,也挑选了免疫系统若干基因,使用SYBR Green 荧光定量PCR 试剂盒(Toyo -bo ,日本)对其转录水平进行测定㊂其中,再生信号通路相关基因包括Wnt/β-catenin 通路中的lef1㊁wnt10a 和wnt5b ,成骨蛋白BMP 通路中的bmp2b 和bmp4,成纤维细胞生长因子FGF 通路中的fgf20a 和fgfr1a ,胰岛素样生长因子IGF 中的igf2b ,Notch 中的gata6和mfap4,视黄酸RA 中的raldh2和cyp26a1,音猬因子Hh 中shha ,Activin 通路中的activin βb ,以及尾鳍中细胞增殖的标志基因pcna ;而免疫系统相关基因则包括促炎性细胞因子tnf -α和il -1β,抗炎性细胞因子il -10,调控因子nf -κb2,趋化因子cxcl18b 和cxcr3.2,其他细胞因子il -12α,以及中性粒细胞和巨噬细胞的特异性标志基因mpx 和mpeg1㊂PCR 反应条件为95ħ变性3min ,之后40个循环设置为95ħ15s ,60ħ退火/延伸1min ㊂相对转录水平以管家基因β-actin 进行校正㊂1.6㊀统计分析使用SPSS 和GraphPad Prism 进行数据处理以及绘图㊂实验数据确认符合正态分布及方差齐性后,通过单因素方差分析(one -way ANOV A)并以Dunnett s 检验进行多重比较㊂除表示基因转录水平变化的热图之外,其他结果均以平均值ʃ标准误(Mean ʃSEM)表示㊂设P <0.05时有统计学差异㊂2㊀结果(Results )2.1不同再生阶段微塑料暴露对斑马鱼幼鱼尾鳍再生面积的影响㊀㊀在180hpf 暴露实验结束,即断尾后72h 对斑马鱼幼鱼尾鳍面积进行测量(图2)㊂与预期一致,此时对照组幼鱼尾鳍已基本完成再生㊂而不论哪个再生阶段暴露微塑料,幼鱼尾鳍面积均有减少,且抑制程度为再生前期暴露(3mg ㊃L -1-2)>再生后期暴露(3mg ㊃L -1-3)>断尾前暴露(3mg ㊃L -1-1),其相对面积分别为对照组的88.2%㊁90.2%和97.0%㊂其中,再生前期暴露(3mg ㊃L -1-2)与对照组相比有显著差异,但不同再生阶段暴露组间未见统计学差异㊂图2㊀尾鳍再生不同阶段微塑料暴露对斑马鱼幼鱼尾鳍面积的影响注:(a)暴露实验结束(180hpf)时各处理组再生尾鳍形态;(b)180hpf 时各处理组尾鳍的相对面积;结果用平均值ʃ标准差表示;不同字母表示组间有显著差异(P <0.05);hpf 即受精后小时数㊂Fig.2㊀Effect of microplastic exposure at different regeneration stages on the fin area in larval zebrafishNote:(a)Representative pictures of regenerating fins at the end of exposure (180hpf);(b)Quantification of the relative fin areaat the end of exposure;the results are presented as the mean ʃSEM;the different letters represent statistically significantdifferences among different groups (P <0.05);hpf means hour post fertilization.98㊀生态毒理学报第18卷2.2㊀不同再生阶段微塑料暴露对斑马鱼幼鱼游泳行为的影响㊀㊀在暴露结束后,测定了不同再生阶段微塑料暴露对斑马鱼幼鱼游泳行为的影响,结果如图3所示㊂在持续光照下(图3(b)),再生前期暴露(3mg ㊃L -1-2)显著增加了斑马鱼幼鱼的游泳速度,而其他2个暴露组则未见影响㊂在明暗光周期下(图3(c)),不同阶段微塑料暴露似乎均能增加幼鱼的游泳速度,且再生前期暴露(3mg ㊃L -1-2)的影响最为明显㊂2.3㊀不同再生阶段微塑料暴露对斑马鱼幼鱼免疫系统相关基因转录水平的影响㊀㊀对于所检测的免疫系统相关基因而言,微塑料暴露能够下调大部分基因的转录水平(图4),且断尾后暴露(即3mg ㊃L -1-2或3mg ㊃L -1-3)的下调程度更为显著,比如il -10㊁cxcr3.2㊁mpx 和mpeg1㊂而对于il -1β,虽然3个暴露阶段的转录水平无统计学差异,但断尾后暴露其mRNA 的相对水平更低㊂基因tnf -α和cxcl18b 则分别仅在断尾前(3mg ㊃L -1-1)或再生前期暴露(3mg ㊃L -1-2)有显著下调㊂调控因子nf -κb2在3个暴露组与对照组相比均无差异,但3mg ㊃L -1-3暴露组与其他2个暴露组间有显著差异㊂2.4㊀不同再生阶段微塑料暴露对斑马鱼幼鱼再生信号通路相关基因转录水平的影响㊀㊀再生过程由一系列复杂的信号通路所调控,在微塑料暴露后相关基因的转录水平表现出上调或下调的不同趋势,如图5所示㊂其中,与对照组相比,断尾前暴露(3mg ㊃L -1-1)下调了wnt5b ㊁fgf20a 和mfap4基因的转录水平;再生前期暴露(3mg ㊃L -1-2)则下调了fgf20a 和mfap4基因,但上调了wnt5b ㊁bmp2b ㊁gata6和activin βb ;而再生后期暴露(3mg ㊃L -1-3)则下调了fgf20a ㊁mfap4㊁cyp26a1和pcna ,但上调了bmp2b 和gata6基因的转录水平㊂对比3个暴露组,断尾后再生期的暴露似乎可以影响更多的基因㊂与断尾前暴露相比较,再生期的暴露不但上调了多个基因,比如bmp2b ㊁gata6等,而且对同样的基因,也可能呈现不同的影响趋势,比如wnt5b ㊂而对比2个再生期阶段(3mg ㊃L -1-2和3mg ㊃L -1-3)的暴露结果,除个别基因之外,虽然变化倍数不同,但基因的转录大致呈现类似的变化趋势㊂3㊀讨论(Discussion )在本研究中,我们首先从再生尾鳍面积评估了图3㊀尾鳍再生不同阶段微塑料暴露对斑马鱼幼鱼游泳行为的影响注:(a)斑马鱼幼鱼在60s 内运动轨迹;黑线表示速度<2.2mm ㊃s -1,绿线表示速度介于2.2~6.6mm ㊃s -1,红线表示速度>6.6mm ㊃s -1;(b)持续光照下的自由游泳相对速率;(c)光周期下的相对游泳速率;结果以平均值ʃ标准误表示;不同字母表示组间有显著差异(P <0.05)㊂Fig.3㊀Effect of microplastic exposure at different regenerating stages on the locomotor behaviorof larval zebrafish following caudal fin amputationNote:(a)Trajectory of zebrafish larvae in 60s;the black line represents the speed less than 2.2mm ㊃s -1,the green represents the speed between 2.2and 6.6mm ㊃s -1,and the red represents the speed greater than 6.6mm ㊃s -1;(b)The relative free -swimming speed of zebrafish during 20min of visible light;(c)The relative swimming speed of zebrafish during the photoperiod stimulation test;the results are presentedas the mean ʃSEM;the different letters represent statistically significant differences among different groups (P <0.05).第5期钱宝留等:斑马鱼幼鱼尾鳍再生的不同阶段对微塑料毒性响应的差异99㊀图4㊀尾鳍再生不同阶段微塑料暴露对斑马鱼幼鱼免疫系统相关基因转录水平的影响注:不同字母表示组间有显著差异(P <0.05)㊂Fig.4㊀Effect of microplastic exposure at different regenerating stages on the transcript level of genes relatedto immune response in larval zebrafishNote:The different letters represent statistically significant differences among different groups (P<0.05).图5㊀尾鳍再生不同阶段微塑料暴露对斑马鱼幼鱼再生信号通路相关基因转录水平的影响注:不同字母表示组间有显著差异(P <0.05)㊂Fig.5㊀Effect of microplastic exposure at different regenerating stages on the transcript level of genes involved in thesignaling networks regulating fin regeneration in larval zebrafishNote:The different letters represent statistically significant differences among different groups (P <0.05).不同阶段暴露于聚苯乙烯微塑料对斑马鱼幼鱼尾鳍再生的影响㊂研究发现,与之前的报道一致[13],不论哪个阶段的暴露,微塑料均能够或多或少抑制尾鳍的再生,而断尾后再生阶段暴露的影响则更为明显㊂我们之前的研究发现,当断尾幼鱼暴露于微塑料颗粒后,除了消化道之外,50nm 粒径的微塑料颗粒在尾鳍伤口处有明显分布,且能够破坏尾鳍处的亚细胞结构[13]㊂由此可知,尾鳍伤口可能作为额外的微100㊀生态毒理学报第18卷塑料暴露途径,从而影响尾鳍再生进程的顺利进行㊂尤其在伤口愈合前后,颗粒物和创口微界面的相互作用对于微塑料影响生物组织修复与再生可能有重要意义㊂尾鳍面积的变化可以反映微塑料对于再生尾鳍结构上的影响,进一步的,我们通过幼鱼游泳行为的变化评价了微塑料对尾鳍功能的影响㊂可以看出,斑马鱼幼鱼不论在持续光照下的自由游泳速度,还是对光周期的响应行为,均有不同程度的增加㊂我们之前的研究发现,幼鱼在断尾之后,可能会因为伤口的持续刺激(疼痛等原因)而使幼鱼游泳速率上升[15]㊂但是,微塑料更长时间的暴露(72h)会导致幼鱼游泳速度下降㊂事实上,污染物导致鱼类游泳行为的变化和许多因素相关,除了尾鳍功能之外,神经㊁视觉㊁肌肉等方面的毒性效应均可能影响游泳速率,游泳行为的变化可能是上述不同因素共同作用的结果[16-17]㊂但是,我们的结果明确表明微塑料暴露会导致幼鱼游泳行为的改变,而这很可能归因于其对尾鳍再生过程的损害㊂对于水生生物而言,游泳是一项基本而关键的生存技能[17],而过度游泳行为可能使得幼鱼更容易被捕食者发现,从而影响其在野外的存活率㊂斑马鱼幼鱼尾鳍切除后,免疫系统被强烈激活,不仅可以清除伤口处的病原微生物,而且在组织修复和再生中有重要的调控作用[18]㊂研究发现,在组织受损并形成伤口之后,凝血级联系统被激活,肥大细胞脱颗粒并释放细胞因子,随之开始炎症反应阶段㊂最初是中性粒细胞,之后是巨噬细胞,先后被招募到伤口处,清除细胞残骸,释放蛋白酶,并分泌一系列的生物活性小分子,从而启动组织重建,以及后续炎症细胞的活化㊁迁移和增殖[19-20]㊂炎症细胞中的中性粒细胞具有免疫调节作用,并影响炎症反应的启动,对再生过程作用显著;而巨噬细胞可调节尾鳍组织的外生长和辐状骨的形成,去除巨噬细胞将严重影响炎症消退和组织再生[19,21-22]㊂而就炎症相关基因而言,研究者通过分析斑马鱼受伤后多个基因的时空表达模式,确证了其在斑马鱼组织修复和再生过程中的重要作用[23]㊂我们之前的研究也表明微塑料能够抑制斑马鱼的免疫应答,从而影响其尾鳍再生[13]㊂与此报道类似,本研究也发现不论在哪个阶段暴露,微塑料抑制了绝大部分炎症相关因子的转录,而炎症细胞的标志基因mpx和mpeg1同样被显著下调㊂同时,对比3个不同阶段,断尾后再生阶段的暴露相较于断尾前暴露,其对上述基因的抑制作用更为显著,这也和微塑料在不同阶段暴露对再生尾鳍面积的抑制程度相一致㊂斑马鱼尾鳍再生涉及到复杂的调控机制,包括Wnt/β-catenin㊁成骨蛋白BMP㊁成纤维细胞生长因子FGF㊁胰岛素样生长因子IGF等信号通路均有重要作用[24]㊂其中,经典的Wnt/β-catenin信号途径,其被认为对于尾鳍再生过程是必要和充分的,扮演着作为调控中心的关键角色[24-25]㊂同时,研究也发现Wnt/β-catenin作为信号通路可调控伤口处的微环境,影响炎症细胞迁移以及细胞表型,可能在组织炎症和再生两者间起联系作用[19]㊂之前的研究表明,微塑料更长时间的暴露(72h)会导致断尾幼鱼体内Wnt/β-catenin信号通路相关基因转录和表达的抑制[13]㊂然而,在本研究中,除了wnt5b基因在断尾前暴露被抑制外,断尾后再生阶段的暴露似乎一定程度可上调相应基因㊂BMP信号通路的主要作用是促进成骨细胞的分化[24]㊂同样的,断尾后暴露能够上调其中bmp2b基因的转录水平㊂类似的上调作用还发生在Activin通路中的activinβb基因㊂这可能表明了在一定程度的干扰下生物体内存在反馈调节作用,从而上调了再生信号相关通路基因的转录水平㊂然而,成纤维细胞生长因子FGF信号通路中的fgf20a,视黄酸RA中的cyp26a1,以及尾鳍中细胞增殖的标志基因pcna等,微塑料的暴露则依然对其转录存在不同程度的下调作用㊂同时,微塑料暴露能够上调Notch中的gata6基因,但下调了mfap4基因的转录水平㊂上述基因转录水平的变化我们也通过RNA-seq在转录组水平上进行了验证(数据未发表),虽然变化倍数有所差异,但其趋势是一致的㊂由此可以看出,尾鳍再生的调控网络相当复杂,阐明其分子和细胞机制还需要更多的生物学证据加以确认㊂但是,与尾鳍面积的结果类似,对比3个不同阶段的暴露,2个断尾后再生阶段的暴露影响了更多的基因,且其转录大致呈现类似的变化趋势㊂研究表明,再生信号涉及的部分通路也和生物体的发育相关[10,26],而实验中所采用的幼鱼也还处于发育过程中㊂其次,鉴于幼鱼中尾鳍再生过程较短,其中各阶段的划分并不明晰㊂同时,考虑到实验可操作性,本研究是通过幼鱼整体匀浆检测基因转录,其他组织和器官中相应基因的mRNA水平很可能干扰了再生尾鳍处的转录变化结果㊂因此,后续研究将通过在成鱼尾鳍再生不同阶段进行暴露,并第5期钱宝留等:斑马鱼幼鱼尾鳍再生的不同阶段对微塑料毒性响应的差异101㊀单独对再生尾鳍进行检测,这可为揭示微塑料干扰尾鳍再生的内在机制提供更为可靠的证据㊂应该注意到,本研究以及之前的毒理学相关报道中,微塑料的暴露浓度可能无法与真实的环境浓度相参照㊂在真实环境中,微塑料浓度在不同地点间有很大的差别㊂比如,就淡水水体而言,在已有的报道中,微塑料的浓度从每立方米水体几个颗粒到几千个颗粒不等[27]㊂同时,限于现有的采样方法和分析手段,目前的环境浓度数据并不准确㊂比如,利用不同孔径的微塑料采集网,其检测结果可能相差数百倍[28]㊂一般认为,目前的数据对于微塑料(尤其是小粒径的微塑料,比如纳米级微塑料)在环境水体中的浓度是严重低估的㊂但无论如何,相关毒理学数据对于评价微塑料的生态风险依然具有重要的参考意义㊂总而言之,本研究表明聚苯乙烯微塑料暴露能够抑制斑马鱼尾鳍的再生,并在不同阶段表现出不同的毒性效应㊂综合再生尾鳍面积㊁游泳行为,以及免疫系统和再生信号通路相关基因的转录水平来看,相较于断尾前暴露,断尾后再生期(尤其是前期)微塑料对于尾鳍再生的影响更为显著,可能是微塑料抑制尾鳍再生的重要窗口期,也证实了微塑料颗粒和伤口微界面的相互作用在其影响尾鳍再生时具有重要的意义㊂通信作者简介:孙立伟(1980 ),男,博士,教授,博士生导师,主要研究方向为生态毒理学㊂参考文献(References):[1]㊀Geyer R,Jambeck J R,Law K L.Production,use,andfate of all plastics ever made[J].Science Advances,2017,3(7):e1700782[2]㊀Granby K,Rainieri S,Rasmussen R R,et al.The influ-ence of microplastics and halogenated contaminants infeed on toxicokinetics and gene expression in Europeanseabass(Dicentrarchus labrax)[J].Environmental Re-search,2018,164:430-443[3]㊀Koelmans A A,Redondo-Hasselerharm P E,Nor N H M,et al.Risk assessment of microplastic particles[J].NatureReviews Materials,2022,7(2):138-152[4]㊀Arthur C,Baker J,Bamford H.Proceedings of the inter-national research workshop on the occurrence,effects andfate of microplastic marine debris[R].Washington DC:National Oceanic and Atmospheric Administration,2009 [5]㊀Rochman C M,Kross S M,Armstrong J B,et al.Scientif-ic evidence supports a ban on microbeads[J].Environ-mental Science&Technology,2015,49(18):10759-10761[6]㊀Ma H,Pu S Y,Liu S B,et al.Microplastics in aquatic en-vironments:Toxicity to 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微塑料与磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯联合暴露对子代斑马鱼甲状腺功能的影响任新;袁思怡;冯宇;田野;赵雪松【期刊名称】《吉林师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2024(45)2【摘要】鉴于微塑料与其他污染物共存会改变共存物的生物利用性及毒性,大量应用的阻燃剂磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)与聚苯乙烯纳米塑料(PS-NPs)在水环境中共存性极高,共存物可能对人类健康带来不可预知的风险.本文以毒理学的模式生物斑马鱼为受试生物,采用全生命周期暴露的方式,将受精2 h的胚胎暴露于4、20、100μg/L TDCIPP暴露组、20 mg/L PS-NPs暴露组以及4μg/L TDCIPP+20 mg/L PS-NPs、20μg/L TDCIPP+20 mg/L PS-NPs以及100μg/L TDCIPP+20 mg/L PS-NPs复合暴露组中,暴露时间持续150 d.暴露结束后,分析母代与子代的甲状腺激素以及与下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPT轴)功能基因的表达.结果显示,NPs能够增强TDCIPP在生物体内的积累,并诱发子代形态学异常.同时,PS-NPs共存能显著加剧TDICPP对子代甲状腺激素的干扰,显著加剧TDCIPP甲状腺干扰的母体传递效应且F1代14 d是甲状腺激素作用的敏感时间节点.【总页数】6页(P101-106)【作者】任新;袁思怡;冯宇;田野;赵雪松【作者单位】吉林师范大学工程学院【正文语种】中文【中图分类】X171.5【相关文献】1.全生命周期暴露磷酸三(1,3-二溴丙基)酯对斑马鱼子代甲状腺功能的干扰2.磷酸三(1,3-二氯二丙基)酯(TDCPP)对斑马鱼胚胎急性毒性研究3.磷酸三(2,3-二氯丙基)酯(TDCIPP)和纳米二氧化钛(nano-TiO2)联合暴露对斑马鱼胚胎的氧化应激影响4.环境剂量磷酸三(1,3-二氯异丙基)酯多代暴露对斑马鱼子代仔鱼的神经发育毒性5.磷酸三(2,3-二氯丙基)酯和纳米二氧化钛联合暴露诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。