高产林可霉素链霉菌的筛选及发酵条件的优化

林可霉素高产菌种的选育朱立元　刘瑞华(安徽省皖北药业股份有限公司,宿州　234000)摘要　以林可霉素产生菌8227#为出发菌株,采用氯化锂、紫外线(uV)、甲基磺酸乙酯(EMS)三重复合诱变处理、筛选耐自身产物的高产菌种,从中获得65212#菌株。

其摇瓶效价较出发菌株提高25%,发酵培养基优化组合后,其摇瓶效价提高28%,应用于30吨发酵罐生产,其发酵指数较出发菌株提高1618%。

关键词　林可霉素;复合诱变处理;优化组合Selection for the high and stable lincomycin2producing strainZHU Li2Yuan,L IU Rui2Hua(W an Bei Pharm aceutical com pany L t d.S uz hou A nhui　234000)ABSTRACT　As an original strain,Lincomycin2producing8227#was multiple mutated through LiCl,EMS and ultraviolet in pres2 ence of lincomycin.The high and stable lincomycin2producing strain named as64212#was obtained.It is demonstrated that lin2 comycin2producing activity of this strain in the shaking flask increases by25%.With the optimal culture solution,it’s activity raises by28%.Trial2production by30tons fermentor indicates that the lincomycin2producing activity of the strain increase1618%than that of the original one.KEY WORDS　lincmycin;multiple mutated;optimal association 林可霉素又名洁霉素,是我公司生产的一种抗革兰阳性菌抗生素,主要是由林可霉素产生菌(一种放线菌)好氧发酵生产。

链霉菌JD211发酵条件优化作者：黄国强李红吴姚平李庆蒙韩顺魏赛金来源：《湖北农业科学》2015年第10期摘要：以戊二酰亚胺类抗生素菌株链霉菌（Streptomyces）JD211为研究对象，研究其发酵培养基和发酵条件，得出最佳培养基组成是甘油30 g/L、酵母膏10 g/L、硫酸铵5 g/L、NaCl 5 g/L、CaCO3 3.5 g/L。

优化后的发酵条件为装液量50 mL/250 mL，初始pH 7.0，接种量7.5%，培养温度30 ℃，培养时间为144 h。

培养基优化后菌丝体干重较优化前提高了166.61%，抑菌圈提高了30.77%。

关键词：链霉菌（Streptomyces）JD211；发酵培养基；发酵条件；优化中图分类号：S476+.11 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2470-03DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.10.044链霉菌（Streptomyces）JD211菌株是江西农业大学生物科学与工程学院从江西庐山珙桐树中分离筛选得到。

研究发现，该菌株的粗提代谢物对水稻纹枯病菌、西瓜枯萎病菌等多種植物病原真菌具有显著的抑制效果[1]。

其次生代谢物主要为戊二酰亚胺类抗生素，具有研发成新型友好生物农药的潜力和价值。

本研究对链霉菌JD211培养基和培养条件进行初步研究，以此了解该菌适宜的发酵环境，提高抑菌活性物质的产量。

1 材料与方法1.1 材料链霉菌JD211、意大利青霉由江西农业大学生物工程实训基地提供。

蔗糖马铃薯培养基（PDA）：蔗糖20 g，去皮马铃薯200 g，琼脂20.0 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0。

种子培养基：葡萄糖10.0 g，甘油20.0 g，酵母膏10.0 g，碳酸钙5.0 g，硫酸铵5.0 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

PDB培养基：去皮土豆200 g，蔗糖20 g，去离子水1 000 mL，pH自然。

林可霉素生物合成技术分析【中图分类号】tq46 【文献标识码】 a【文章编号】1672-3873（2011）03-0346-01【摘要】在合成培养基中利用林可链霉菌发酵生产林可霉素。

当向培养基中加入生物素和氨基酸时，林可霉素的产量受到很大影响。

【关键词】林可霉素生物合成林可霉素是一种高效广谱抗生素，临床用于由抗革兰阳性菌引起疾病的治疗。

林可霉素a的分子式为c18h34n2o6s，分子量为406.56，它与林可霉素b在结构上的区别为：林可霉素a 4位上为正丙基，而林可霉素b4位上是乙基，两者在药理上存在着很大的区别，林可霉素b的抑菌活性比林可霉素a低，但对人的毒副作用较大。

我国药典要求成品中b含量小于5%。

本文采用合成培养基进行摇瓶发酵实验，选择玉米浆中含量较丰富的d l l15个因子首先进行两水平因子设计实验，以筛选出显著影响因子，然后进行响应面设计实验，通过软件分析得到优化的发酵培养基配方。

一、材料与方法1、菌种林可链霉菌(streptomyces lincolnensis)l427，由江西国药有限公司提供。

2 、培养条件与培养方法种子培养种子摇瓶于30℃，220r/min培养48h。

摇瓶发酵培养按30%的接种量将种子液接入发酵培养基，30℃，220r/min，培养168h。

3、生物效价的测定采用管碟法。

鉴定菌为藤黄八叠球菌［sarcina lutea，cmcc(b)28001］，由江西国药有限责任公司提供。

林可霉素(lincomycin)标准品购自sigma公司。

二、结果与讨论1 、实验设计通过两水平因子设计(2 level factorial design)实验可迅速找出生物素和氨基酸中对林可霉素的发酵生产有显著影响的因子，进一步对显著影响因子进行响应面设计(response surface design，rsd)实验，对结果进行优化分析可得到优化配方。

所采用的实验设计、数据分析软件为design expert 7.0。

林可霉素高产菌株HBP-46号的筛选
付晖
【期刊名称】《华夏医学》
【年(卷),期】2002(015)006
【摘要】目的:筛选高产林可霉素的菌株.方法:用紫外线/氯化锂复合诱变剂对林可霉素产生菌SF-9号进行处理,并用高效的琼脂块培养法对菌株进行筛选.结果:筛选出的菌株在摇瓶中的发酵单位比对照菌株提高了21.73%,在50m3发酵罐中比对照罐提高了22.86%.结论:成功筛选出高产林可霉素的菌株HBP-46号.
【总页数】3页(P744-746)
【作者】付晖
【作者单位】桂林集琦药业股份有限公司,广西,桂林,541004
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1
【相关文献】
1.林可霉素高产菌株的选育 [J], 李静仁
2.林可霉素高产菌株的定向选育 [J], 孟娜;吴丁柱;李婉珍;魏胜华
3.三重复合诱变选育林可霉素高产菌株 [J], 毕国东;牛春;黄文福;张萍
4.脉冲强光技术选育林可霉素高产菌株 [J], 于荣; 张缘; 郭佳; 沈毅
5.热诱变筛选林可霉素高产菌株的探索 [J], 李正群
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林可霉素生产工艺林可霉素是一种广谱抗生素，具有较好的细菌靶向性和相对较低的耐药性。

其生产工艺主要分为以下几个步骤。

首先，选择合适的菌株进行培养。

林可霉素主要由林纳霉素产生菌株Streptomyces lincolnensis发酵产生。

这些菌株通常采用毛细菌分离培养，并根据菌株的生长条件设计合适的培养基成分和培养工艺。

其次，将合适的培养基转移到大规模发酵罐中进行培养。

发酵罐内的培养基通常包含多种有机物和无机盐，以提供菌株所需的营养物质。

同时，发酵罐内应控制好温度、氧气供应和搅拌速度等发酵参数，以促进菌株的生长和代谢产物的积累。

接下来，进行林可霉素的提取。

发酵液经过一系列的分离和纯化步骤，如压滤、离心、浓缩和溶剂提取等，以获取含有林可霉素的提取液。

提取液中通常还含有其他杂质和目标产物的类似物，需要进一步的纯化和分离。

然后，进行林可霉素的纯化。

提取液通常通过色谱技术，如凝胶过滤层析、离子交换层析和逆流色谱等，以分离纯化目标产物，并去除杂质和类似物。

通过这些纯化步骤，可以获得高纯度的林可霉素。

最后，进行林可霉素的结晶和干燥。

通过调节溶剂体系和温度等条件，使得林可霉素从溶液中结晶出来，并通过离心和干燥等步骤，获得成品的林可霉素。

在整个生产工艺中，需要严格控制每个步骤的条件和工艺参数，以提高产量和产品质量。

同时，为了确保生产的可持续性和经济性，还需要考虑废物处理和工艺优化等方面的问题。

总之，林可霉素的生产工艺是一个复杂的过程，需要在菌株培养、发酵、提取、纯化和干燥等多个环节中进行控制和优化。

这些步骤的顺利进行将有助于获得高纯度和高产量的林可霉素产品，以满足医疗和农业领域对抗生素的需求。

林可霉素高产菌株的定向选育孟娜12。

吴丁柱1，李婉珍他，魏胜华1’2(1．安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000；2．微生物发酵安徽省工程技术研究中心。

安徽芜湖241000)摘要：基于生物合成的原理，对林可霉素高产菌株进行了定向选育。

采用硫酸二乙酯和紫外复合诱变处理，以林可霉素及其水解液作为筛选的抗性标记，获得了抗前体及产物的突变株。

该茵遗传性能良好，其效价为4082u／m L，较出发菌株提高了107％。

为代谢途径不清的定向选育提供了一种新的方法。

关键词：林可霉素；定向选育；林肯链霉菌R at i onal s cr ee ni ng hi gh-pr oduci ng l i ncom yci n s t r ai nM E N G N al2，W U D i ng—z hul，LI W A N—zhen坨，W EI Sheng．hual’2(1．C ol l ea ge of B i ol ogi cal and C hem i ca l E ngi neer i ng，A nhui Pol yt echni c U ni ver s i t y，W uhu241000，C hi na；2．A nhui E ngi ne er i ng T e chnol ogy R e sear c h C ent er ofM i cr obi al Fe r m e nt a t i on，W uhu241000，Chi na)A bs t r ac t：B a se d o n t he pr i nci pl e of bi osyn t hesi s，t he paper st udi ed R a t i ona l sc r e eni ng hi gh-pr o—duc i ng l i nc om yci n st r ai n．A m ut at i on s t r ai n obt ai ne d us i ng l i nc om yci n and i t s hydr ol ysat e as a r es i s t ance m ar ker by D E S and U V com pl ex m ut at i on t r eat m ent．T he m ut at i on s t r ai n has t he cha r—act er i st i c of ant i pr ecur sor and pr oduct．T he genet i c per f or m a nc e i s good，t he t i t er w as4082u／m L，107％hi gher t han t hat of par e nt st r ai n．T he paper pr ovi de s a ne w m et hod f or t he di r ect i onal br ee di ng m e t a bol i c pat hw ay i s no t cl e ar．K ey w or ds：l i nc om yc i n；r at i onal sc r eeni ng；St r ept om yces l i ncol nens i s在抗生素发酵的过程中，前体起着重要的作用，其可以由细胞内生成，或者由培养基提供，能被代谢形成某种终产物的物质。

产恩拉霉素链霉菌的诱变及其发酵条件的优化丁志雯;胡永红;杨文革;吴刚;顾鹏飞;王春晓【摘要】为满足恩拉霉素工业化生产对高产菌株的需求,采用N+注入技术和单因素及正交试验方法对产恩拉霉素链霉菌(Streptomyces sp.)NJWGY3665进行诱变,并对目的菌株的最佳发酵条件进行优化.结果表明:随N+注入剂量的增加,菌株的存活率呈典型的马鞍型剂量-效应曲线.在最佳注射剂量120×1013 ions/cm2条件下筛选到1株具有遗传稳定性的高产链霉菌突变菌株LD1;该菌株发酵最适培养基条件为蔗糖50 g/L,酵母粉20 g/L,NaC1 1.5 g/L,FeSO40.5 g/L;最佳发酵条件为转速190 r/min,温度28℃,pH 7,接种量8％.在此条件下,发酵液恩拉霉素浓度达11 860μg/mL.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2016(044)007【总页数】5页(P72-76)【关键词】链霉菌;N+诱变;恩拉霉素;发酵条件优化【作者】丁志雯;胡永红;杨文革;吴刚;顾鹏飞;王春晓【作者单位】南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京211816【正文语种】中文【中图分类】S154.39;Q935恩拉霉素（Enramycin）又名恩来霉素、安来霉素、持久霉素，商品名为恩拉鼎，是广谱、高效、安全的多肽类抗生素。

作为饲料添加剂，恩拉霉素具有稳定性好、杀菌作用强、无交叉耐药性和不会引起动物性食品药物残留等优点［1－6］。

20世纪60年代恩拉霉素在日本首次发现后，人们对其理化性质、抗菌活性、分析检测和药理等已进行了研究，同时，人们还就恩拉霉素产生菌以及不同C、N源对其产生菌的影响进行探索［7－9］。

微生物发酵即是指利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程,微生物发酵生产水平主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件林可霉素（Lincomycin）是一类具有重要临床意义的高效抗生素，是美国普强公司的Manson等人于1962年首先从美国内布拉斯加州林肯市附近土壤中分离得到的一种由林可链霉菌所产生的抗生素，主要对革兰氏阳性菌有效，特别是对金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌等有良好抑菌作用，对革兰氏阴性菌亦有一定的抑制作用。

林可霉素的作用机制是通过与核糖体50S亚基23S rRNA的中心环相结合而抑制蛋白质生物合成过程中的转移定位，因此通过影响蛋白质的合成抑制细菌生长。

抗生素抗菌物质的含量称效价。

抗生素效价测定有化学法或生物法。

生物法就是将抗生素溶液，在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。

抑菌圈的直径与抗生素总量、抗生素的扩散系数、扩散时间、培养基的厚度和最低抑菌浓度等因素有关。

抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。

因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量.将已知效价的林可霉素标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶液的抑菌圈的大小，算出样品中林可霉素的效价。

菌种：林可链霉菌（林可霉素产生菌）藤黄八叠球菌（林可霉素指示菌）培养基：种子培养基TSBY（30ml）、发酵培养基YMG （30ml）、指示菌培养皿YMG 器皿：三角瓶、容量瓶、恒温摇床、离心机、恒温培养箱、灭菌锅等主要试剂：5 mol/L NaOH等1. 发酵前工作：培养基、试剂的配制；包培养皿、枪头等。

灭菌工作。

2. 发酵培养(1) 将菌种接至固体培养基，30℃培养7天放冰箱0℃-8℃保存备用(2) 从固体培养基上挖1cm×1cm正方块，接入装有已灭菌发酵培养的摇瓶内，放入摇床（30℃，220r/min）摇瓶2天观察菌丝形态，测菌丝浓度和培养液pH(3) 接摇瓶菌丝体3ml于已灭菌的带有30ml发酵培养基的250ml摇瓶中，发酵5-6天，在发酵过程中定时测菌丝浓度，观察菌丝形态3. 生物效价的测定(1) 藤黄八叠球菌液的制备取每周接种一次，用普通琼脂斜面保存的藤黄八叠球菌，在实验前一日，将细菌接种于盛有种子培养基的试管斜面上，于28℃培养24小时后，用无菌水5ml将菌洗下(2) 标准曲线的绘制取2 ml EP管5只编号，并向各瓶分别加入不同量的100 μg/ml的标准品溶液，用水稀释至刻度，使成每ml含林可霉素2、12、22、32、42 μg 5种浓度的标准品稀释液。

专利名称：一种通过林可链霉菌调控基因组合改造提高林可霉素产量的方法
专利类型：发明专利
发明人：吴杭,蔡新露,张部昌
申请号：CN202011140715.9
申请日：20201022
公开号：CN112251456B
公开日：
20220503
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种通过林可链霉菌调控基因组合改造提高林可霉素产量的方法，在林可链霉菌中组合敲除Lrp家族转录调节基因SLCG_4846和TetR家族转录调节基因SLCG_2919获得的。

同时，本发明还公布了一种通过林可链霉菌调控基因组合改造提高林可霉素产量的方法。

该方法通过同源重组技术依次对多个基因进行无痕敲除，此过程不引入抗性基因，既降低了发酵成本，也保证了遗传的稳定性。

同时，该过程并不影响菌体生长，最重要的是，可在同一菌株中连续进行多次敲除实验。

本发明可大幅度提高林可霉素产量，为工业生产提高林可霉素产量提供新的技术支持。

申请人：安徽大学
地址：230601 安徽省合肥市经济技术开发区九龙路111号
国籍：CN
代理机构：安徽合肥华信知识产权代理有限公司
代理人：余成俊
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