HRP底物分类

ELISA检测中常见的纳米酶及底物；过氧化物酶HRP，ELISA检测过氧化氢纳米酶底物检测ODP、TMB、ABTS显色反应步骤苏州健雄职业技术学院周帅康HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(0PD)、2, 2 -吖嗪-(3-乙酰苯基噻唑磺酸-6), ABTS](杂环吖嚷)、四甲基联苯胺(TMB)和4-氨基安替比林：苯酚耦联底物对等。

上述色原底物受HRP作用主要有两种形式的反应：①氧化还原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联，如4-氨基安替比林：苯酚等。

(一)氧化还原色原底物0PD被以为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202)氧化而聚合成2, 2 -二氨基偶氮苯(DAB)。

在pH5. 0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收，当pH值降为1. 0时，最大吸收波长移动至492nm,同时摩尔消光系数变大，显色加深(图4-2)。

因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。

实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化0PD而产生非酶催化的DAB的结果。

有人在强酸反应终止液中加进还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了oro的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。

oro的缺点是其对机体具有致突变作用。

由于OPD的不稳定性，现在的商品试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供给，临用时再溶解于相应的缓冲液。

在ELISA测定时，OPD色原底物的具体配方为①显色底物溶液：在0. lmol/L 枸橼酸盐缓冲液(pH5. 0)中含20mmol/L0P D和12 mmol /L H202,或10 mmol/L 0PD和5. 5mmol/L H202;②终止液：2 mol/L硫酸(含0.1 mol/L亚硫酸钠）；③测定波长：492nm。

TMB是一种优于0PD的新型HRP色原底物。

hrp结构
HRP 结构是指人类重组胰岛素前体(Human Recombinant Proinsulin) 的结构。

在胰岛素的生物合成过程中，胰岛素原先经过蛋白酶裂解后，形成由A 链和B 链组成的成熟胰岛素。

而在重组DNA 技术的发展下，科学家们可以通过基因工程技术将胰岛素原基因重组到大肠杆菌中，使其在大肠杆菌中表达合成，最终得到重组的胰岛素前体。

HRP 结构由三个部分组成：A 链、B 链和C 链。

其中，A 链和B 链分别为成熟胰岛素中的两个多肽链，而C 链则是由胰岛素原分子中的连接肽 (connecting peptide) 部分构成。

HRP 结构中的 C 链在合成后会被内切酶裂解掉，从而得到成熟的胰岛素分子。

HRP 结构的研究对于胰岛素生产和药物研发具有重要的意义。

通过对 HRP 结构的深入了解，科学家们可以更好地理解胰岛素的生物合成过程，并且可以通过对 HRP 结构的改良来优化胰岛素的生产效率和质量。

此外，HRP 结构还可以为药物研发提供重要的参考，例如在胰岛素治疗方面，研究人员可以通过对 HRP 结构的研究来设计更加有效和稳定的胰岛素类似物 (insulin analogs)。

HRP 结构是一种重要的蛋白质结构，对于胰岛素生产和药物研发具有重要的意义。

通过对 HRP 结构的深入研究，我们可以更好地理解胰岛素的生物合成过程，并且可以为胰岛素的生产和药物研发提供
更加精准和有效的参考。

HRP标记抗体原理及方法（戊二醛二步法和过碘酸钠法）酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA 等。

酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。

酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。

酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。

目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。

高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。

在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

(一) 酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。

但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。

目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。

由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。

HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。

HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。

酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。

HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的纯度。

高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。

RZ值越小，非酶蛋白就越多。

值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。

HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。

供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。

substrate | ECL substrate成分：本品为辣根过氧化物酶（HRP）发光底物，分A液和B液两瓶，A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。

特征/优点：分A液和B液，使用时1:1混合；皮克级灵敏度：高度灵敏性可快速检测较宽水平范围内的蛋白质；发光信号早：加入底物后2分钟即可检测；发光信号强；发光持续时间长：平台期持续半小时以上，持续发光24h；经济：比任何其它进口化学发光底物产品花费更少；方便：全国范围内2日左右到货，大小包装均可提供；技术服务到位：专门从事化学发光试剂盒开发的技术人员为您解决各种问题；优良的稳定性：4℃存放可达18个月以上。

贮存：4℃（2－8℃）。

有效期：18个月使用方法：使用时将A液与B液取出，平衡至室温，1:1混合后立即使用，也可每孔先加A液50uL，再加B液50uL，置室温反应。

可在加入底物后2～30分钟读取发光信号。

注意事项：1、HRP的发光底物分A液和B液，A、B液应该使用时现用现配，如果A、B液混合时间过长，将造成发光本底过高，阳性值发光信号过低。

2、使用前室温平衡20min，低温可能会影响产品的发光强度。

3、避光保存，防止暴晒，防止污染。

4、84消毒液（次氯酸钠）等强氧化剂对HRP发光底物有严重的影响，84消毒液有很大的挥发性，在空气中极低的浓度即可引起发光本底升高（1万～十多万），有时候一次使用完84消毒液可以影响到后面几天的试验，所以建议在试验时勿使用84消毒液，可采用其它消毒液代替（如酒精、二氧化氯消毒剂等），若不得已使用完后应保证实验室通风。

5、本底高 a.建议用一个未包被的空白板（什么都不加）直接测，然后再加几孔发光底物直接测，进行对比，以排除应发光板对发光值的影响 b.BSA的影响有些BSA中可能含有杂质，导致本底高，建议更换BSA或采用我公司BSA替代蛋白；c.采用不同厂家发光液在同样的系统中做对比。

介绍ELISA试剂盒中常见的三种HRP底物ELISA试剂盒中HRP底物范围较广，主要包括二氨基联苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。

一、二氨基联苯胺／金属盐DAB是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。

它产生剧烈的棕色产物，在水和醇中不溶解。

多数状况下，推举在DAB中加入不同的金属离子。

当加入金属盐如钴、镍至底物液中，辣根过氧化物酶可以更加敏感。

此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色，且在水及醇中稳定。

DAB／金属盐染色应用的组织染色范围较广。

1. 需要的溶液和特别设备DAB，0.05 mol／LTris缓冲液(pH7.6),0.3％ (W/V) 氯化镍/水贮存液,30％过氧化氢,DPX,光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果).2. 操作步骤(1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris缓冲液(pH7.6)溶解6 mg DAB；(2) 加 l mL 0.3％(W/V)氯化镍/水贮存液(也可以用等量的氯化钴替代)；(3) 加0.1 mL 3％过氧化氢。

过氧化氢一般以30％的溶液供应，贮存在4 ℃，此条件可以持续1个月；(4) 假如消失沉淀，用滤纸过滤；(5) 加此溶液至标本，并孵育1~20 min水洗终止反应；(6) 优化：假如需要可复染；(7) 用DPX封片。

二、氯萘酚氯萘酚可以形成一种蓝黑色产物。

敏感性低于DAB，且产物可溶于醇中。

它适用于当DAB反应形成较高背景或要求转变产物的颜色。

1. 需要的溶液和特别设备0.03％氯萘酚，用无水乙醇溶解(贮存在-20℃)，0.05 mol／LTris(pH7.6)，过氧化氢，Gelvatol或者Mowiol，光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。

2. 操作步骤(1) 氯萘酚贮存液的预备：用10 mL无水乙醇溶解0.3 g氯萘酚，贮存于-20℃；(2) 加100μL 氯萘酚贮存液至10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6)；(3) 加0.1 mL 3％过氧化氢于水中。

酶标记物是免疫酶技术中的关键试剂。

由于具备易于提取、价格实惠、性质稳定等优点, HRP已成为elisa实验屮应用最广泛的标记酶。

由于HRP在辣根屮含暈很高，因为又称为辣根过氧化物酶。

HRP是一种分了蜃达44 000的糖蛋门，由无色的酶蛋片和深棕色的铁吓咻结合而成，中性糖和氨基糖约占18%,主耍有U•露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。

每一个HRP分子中含一个氯化血红索IX作辅基，该辅基在403nm波长处有最大吸收峰，而去辅基的酶蛋白在275nm波氏处冇故大吸收。

HRP在403nm的OD值与275nm的OD值之比，也就是所谓的RZ(Reinheits Zahl) 值。

RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量,并非表示HRP制剂的真正纯度,而且RZ 值鬲的HRP制剂，并不意味着酶活性也高。

但町以一纯酶溶液在10mm光径403nm波长下的吸光度来计算酶浓度[1%(W/V)酶溶液吸光度为22.5,浓度为227umol/L]0纯HRP干燥贮存于-20oC可保持稳定，使用1.36 mol/L甘汕、10mmol/L磷酸钠、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L细胞色素C(pH 7.4)溶液作为基质冷冻保存，可使齣结合物稳定数年。

HRP对热及有机溶剂的作用比较稳定，用甲苯与石蜡切片处理或用纯乙醇或10%甲醛水溶液固定做冷冻切片，均不能使其活性改变。

貳化物或硫化物在10-5〜10-6mol/L浓度时具有可逆性地抑制HRP的作用触化物、叠氮化合物或轻胺仅在高于10-3mol/L浓度时抑制HRP;HRP还町被轻甲基过氧化@不可逆地抑制。

强酸也是HRP的强烈的抑制剂。

因此，在酶免疫测定常选川上述的某些化合物如氟化钠、叠氮钠和强酸等作为酶反应的终止剂。

此外，在配制酶免疫测定的稀释缓冲液时，为防止酶失活，应避免使用叠氮钠作防腐剂。

HRP的同工酚主要可分为三种类型：①禽糊最高的酸性同工酶。

②等电点接近于屮性(或微碱)的含糖量相对较低的同工酶。

酶标记物是免疫酶技术中的关键试剂。

由于具备易于提取、价格实惠、性质稳定等优点，HRP已成为elisa实验中应用最广泛的标记酶。

由于HRP在辣根中含量很高，因为又称为辣根过氧化物酶。

HRP是一种分子量达44 000的糖蛋白，由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合而成，中性糖和氨基糖约占18%，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。

每一个HRP分子中含一个氯化血红素IX作辅基，该辅基在403nm波长处有最大吸收峰，而去辅基的酶蛋白在275nm波长处有最大吸收。

HRP在403nm的OD值与275nm的OD值之比，也就是所谓的RZ(Reinheits Zahl)值。

RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ 值高的HRP制剂，并不意味着酶活性也高。

但可以一纯酶溶液在10mm光径403nm波长下的吸光度来计算酶浓度[1%(W/V)酶溶液吸光度为22.5，浓度为227umol/L]。

纯HRP干燥贮存于–20oC可保持稳定，使用1.36 mol/L甘油、10mmol/L磷酸钠、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L细胞色素C(pH 7.4)溶液作为基质冷冻保存，可使酶结合物稳定数年。

HRP对热及有机溶剂的作用比较稳定，用甲苯与石蜡切片处理或用纯乙醇或l0%甲醛水溶液固定做冷冻切片，均不能使其活性改变。

氰化物或硫化物在10–5～10–6mol/L浓度时具有可逆性地抑制HRP的作用;氟化物、叠氮化合物或羟胺仅在高于10-3mol/L浓度时抑制HRP;HRP还可被羟甲基过氧化氢不可逆地抑制。

强酸也是HRP的强烈的抑制剂。

因此，在酶免疫测定常选用上述的某些化合物如氟化钠、叠氮钠和强酸等作为酶反应的终止剂。

此外，在配制酶免疫测定的稀释缓冲液时，为防止酶失活，应避免使用叠氮钠作防腐剂。

HRP的同工酶主要可分为三种类型：①含糖量高的酸性同工酶。

②等电点接近于中性(或微碱)的含糖量相对较低的同工酶。

HRP标记抗体原理及方法（戊二醛二步法和过碘酸钠法）酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。

酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。

酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。

酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。

目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。

高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。

在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

(一)酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。

但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。

目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。

由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。

HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。

HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。

酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。

HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。

高纯度的酶RZ 值应在3.0左右(最高可达3.4)。

RZ值越小，非酶蛋白就越多。

值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。

HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。

供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。

酶联免疫反应常用底物辣根过氧化物酶HRP底物辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）具有分子量小，标记方法简单，性质稳定等优点，是临床检验试剂中常用的酶。

该产品广泛用于各类生化检测项目及免疫类（ELISA）试剂盒。

中华试剂网辣根过氧化物酶的底物种类丰富，可满足不同的实验需求。

■ HRP的发色底物辣根过氧化物酶发色底物为过氧化物和供氢体（DH2），其真正底物是H2O2，但人们习惯把供氢体称为底物或统称供氢体底物。

在ELISA中常用的供氢体有以下几种：1、OPD是ELISA技术中应用较多的供氢体，酶作用后显黄色（最大吸收波长为492 nm），其灵敏度高，测定方便。

2、TMB是近年来常用的一种供氢底物，经酶作用后显天蓝色，目测对比度鲜明，加酸终止酶反应后变黄色（最大吸收波长为450 nm），易比色定量测定。

3、DBA供氢底物，其反应产物为不能溶解的棕色吩嗪衍生物，可用不同光镜观察。

此种多聚物能被还原和唑-6-磺酸)铵盐3-氨基-9-乙基咔唑3-Amino-9-ethylcarbazole, AEC红色、可溶性132-32-15 g25g4-氯-1萘酚Chloro-1-naphthol 蓝色、可溶性604-44-425g※小贴士：氧化物、硫化物、氟化物及叠氮化物等可抑制HRP的活性，故勿用这类试剂作为防腐剂。

■ HRP的发光底物鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼，Luminol）或其衍生物如异鲁米诺（4-氨基邻苯二甲酰肼，Isoluminol），是一类重要的发光试剂。

用HRP标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在HRP和起动发光试剂(NaOH+H2O2)作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。

反应过程如下图所示：产品编号中文名称英文名称CAS纯度包装328061 鲁米诺Luminol 521-31-398%1 g5 g25 g分子式：C8H7N3O2分子量：433.63熔点：194-195℃储存条件： 2-8°C产品编号中文名称英文名称CAS号纯度包装A5300 异鲁米诺Isoluminol 3682-14-298%1 g 10 g分子式：C8H7N3O2分子量：177.16熔点：194-195℃储存条件： 2-8°C■配套产品中文名称英文名称CAS号纯度包装4-碘苯酚4-Iodophenol 540-38-5 99%5 g 25 g 100 g四苯基硼酸钠Sodium tetraphenylborate 143-66-8 99.5%(ACS)25 g 100 g 500 g牛血清白蛋白Bovine serum albumin [ FractionV], BSA9048-46-8 ——5 g25 g100 g十二烷基硫酸钠Dodecyl sulfate sodium salt, SDS 151-21-3 99% 100 g 500 g脱氧胆酸钠Sodium deoxycholate 302-95-4 98%25 g 100 g 500 g苯甲基磺酰氟化物Phenylmethylsulfonylfluoride, PMSF329-98-6 99%25 g100 g亮抑酶肽Leupeptin 103476-89-7 96.5% 10 mg 50 mg三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐Tris(hydroxymethyl)aminomethanehydrochloride, Tris-HCl1185-53-1 99%25 g100 g500 g吐温80 Polysorbate 80 9005-65-6 ——250 mL1 L碱性磷酸酶底物碱性磷酸酶(Alkaline phospharase, AP)是一种能够在碱性情况下将对应底物去磷酸化的酶，广泛分布于人体的各脏器器官中，以肝脏、骨骼、小肠中存在的量最多。

hrp反应底物HRP反应底物HRP（辣根过氧化物酶）是一种常用的酶标记物，广泛应用于免疫学、生物化学和分子生物学等领域。

HRP反应底物是HRP酶标法中的关键组成部分，它能够与HRP酶发生特异性反应产生可观测的信号，从而实现对目标分子的定量或定性分析。

一、HRP反应底物的种类HRP反应底物常见的有TMB（3,3',5,5'-四甲基苯胺）、ABTS（2,2'-联氨基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）和OPD（o-苯二胺）等。

它们在HRP酶催化下发生氧化还原反应，生成有色产物，进而产生可观测的信号。

1. TMB（3,3',5,5'-四甲基苯胺）TMB是HRP反应底物中应用最广泛的一种，其化学结构中含有两个甲基基团和两个氨基基团。

TMB与HRP酶催化下的过氧化氢反应，生成褐色产物。

这种产物具有较高的吸光度，在450 nm波长下可测量其吸光值。

TMB在HRP酶标法中常用于检测抗体水平、酶活性和蛋白质含量等。

2. ABTS（2,2'-联氨基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）ABTS是另一种常用的HRP反应底物，其化学结构中含有苯并噻唑啉环和苯环。

ABTS与HRP酶催化下的过氧化氢反应，生成绿色产物。

这种产物在415 nm波长下具有较高的吸光度，可用于光度法测量。

ABTS在HRP酶标法中常用于检测抗体、酶活性和DNA浓度等。

3. OPD（o-苯二胺）OPD是一种常用的HRP反应底物，其化学结构中含有两个苯环和两个氨基基团。

OPD与HRP酶催化下的过氧化氢反应，产生黄色产物。

这种产物在450 nm波长下具有较高的吸光度，可用于光度法测量。

OPD在HRP酶标法中常用于检测抗体水平、酶活性和蛋白质含量等。

二、HRP反应底物的优缺点1. TMB的优点在于其产物呈蓝色或黄色，吸光度高，易于测量。

缺点是其反应过程中产生的高浓度过氧化氢有毒性，需要注意安全操作。

2. ABTS的优点在于其产物呈绿色，吸光度高，测量方便。

酶联免疫反应常用底物辣根过氧化物酶HRP底物辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）具有分子量小，标记方法简单，性质稳定等优点，是临床检验试剂中常用的酶。

该产品广泛用于各类生化检测项目及免疫类（ELISA）试剂盒。

中华试剂网辣根过氧化物酶的底物种类丰富，可满足不同的实验需求。

■ HRP的发色底物辣根过氧化物酶发色底物为过氧化物和供氢体（DH2），其真正底物是H2O2，但人们习惯把供氢体称为底物或统称供氢体底物。

在ELISA中常用的供氢体有以下几种：1、OPD是ELISA技术中应用较多的供氢体，酶作用后显黄色（最大吸收波长为492 nm），其灵敏度高，测定方便。

2、TMB是近年来常用的一种供氢底物，经酶作用后显天蓝色，目测对比度鲜明，加酸终止酶反应后变黄色（最大吸收波长为450 nm），易比色定量测定。

3、DBA供氢底物，其反应产物为不能溶解的棕色吩嗪衍生物，可用不同光镜观察。

此种多聚物能被还原和盐3-氨基-9-乙基咔唑3-Amino-9-ethylcarbazole, AEC红色、可溶性132-32-15 g25g4-氯-1萘酚Chloro-1-naphthol 蓝色、可溶性604-44-425g※小贴士：氧化物、硫化物、氟化物及叠氮化物等可抑制HRP的活性，故勿用这类试剂作为防腐剂。

■ HRP的发光底物鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼，Luminol）或其衍生物如异鲁米诺（4-氨基邻苯二甲酰肼，Isoluminol），是一类重要的发光试剂。

用HRP标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在HRP和起动发光试剂(NaOH+H2O2)作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。

反应过程如下图所示：产品编号中文名称英文名称CAS纯度包装328061 鲁米诺Luminol 521-31-398%1 g 5 g 25 g分子式：C8H7N3O2分子量：433.63熔点：194-195℃储存条件： 2-8°C产品编号中文名称英文名称CAS号纯度包装A5300 异鲁米诺Isoluminol 3682-14-298%1 g 10 g分子量：177.16熔点：194-195℃储存条件： 2-8°C■配套产品中文名称英文名称CAS号纯度包装4-碘苯酚4-Iodophenol 540-38-5 99%5 g 25 g 100 g四苯基硼酸钠Sodium tetraphenylborate 143-66-8 99.5%(ACS)25 g 100 g 500 g牛血清白蛋白Bovine serum albumin [ FractionV], BSA9048-46-8 ——5 g25 g100 g十二烷基硫酸钠Dodecyl sulfate sodium salt, SDS 151-21-3 99% 100 g 500 g脱氧胆酸钠Sodium deoxycholate 302-95-4 98%25 g 100 g 500 g苯甲基磺酰氟化物Phenylmethylsulfonylfluoride, PMSF329-98-6 99%25 g100 g亮抑酶肽Leupeptin 103476-89-7 96.5% 10 mg 50 mg三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐Tris(hydroxymethyl)aminomethanehydrochloride, Tris-HCl1185-53-1 99%25 g100 g500 g吐温80 Polysorbate 80 9005-65-6 ——250 mL1 L碱性磷酸酶底物碱性磷酸酶(Alkaline phospharase, AP)是一种能够在碱性情况下将对应底物去磷酸化的酶，广泛分布于人体的各脏器器官中，以肝脏、骨骼、小肠中存在的量最多。

抗体的标记修饰抗体可以通过不同的化学试剂交联到酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶）、荧光染料（FITC、PE、APC等）、生物素（Biotin）、胶体金等。

一、抗体/蛋白的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体标记HRP最为经典的方法为NaIO4氧化法，先将HRP糖基氧化成醛基，醛基与抗体的-NH2反应生成希夫氏碱反应，抗体分子与HRP分子形成稳定结构。

标记的时候一般按照抗体分子与HRP分子摩尔比1:4的比例进行标记，此时,两者的质量约为1:1。

1. 抗体/蛋白的HRP标记（NaIO4氧化法）标记以2mg抗体为例。

1.1 抗体/蛋白的处理待标记抗体/蛋白在50mM碳酸盐缓冲液(0.015M Na2CO3，0.035M NaHCO3，pH9.6) 中透析，其间换液2次，抗体/蛋白浓度调整为2mg/ml；或者将高浓度的抗体用0.5M碳酸盐缓冲液(0.15M Na2CO3,0.35M NaHCO3 ,pH9.6)稀释到2mg/ml，如果原抗体/蛋白溶液中含有Tris、NH4+等游离氨基的试剂，必须透析除去。

1.2 HRP酶的氧化1.2.1 称取2mg HRP干粉(Frdbio)溶于100 μL ddH2O 中。

1.2.2 称取NaIO4 21mg，溶于1 mL的ddH2O中，吸取100μL NaIO4溶液与100μL的HRP溶液缓慢混合，4℃下静置30min，此时溶液为绿色。

（注意：此后的操作均在避光条件下进行。

）1.2.3 吸取２µL乙二醇缓慢加入氧化后的HRP溶液，室温避光静置30min，此时溶液为褐色。

1.3 抗体的标记1.3.1 将氧化好的HRP溶液直接加入到已处理好的抗体/蛋白溶液中，室温反应２h。

1.3.2 称取0.4mg的NaBH4，溶解于20µL的ddH2O中，全部加入上步反应液中，4℃静置2h，每30min摇动一次。

1.3.3 PBS(pH7.2)透析过夜，标记液中加入体积比30%～50%的甘油，混匀后置于-20℃保存。

常用免疫组化试剂介绍完整版免疫组化试剂是一类用于检测细胞和组织中特定分子的试剂。

它们能够与目标分子发生特异性的结合反应，通过显色、荧光等方式实现目标分子的定位和检测。

常用的免疫组化试剂有抗体、底物、荧光染料等。

下面将详细介绍常用的免疫组化试剂。

一、抗体单克隆抗体：单克隆抗体是由单个克隆的B细胞分泌的抗体组成。

它们具有更高的特异性和一致性，适用于特定的免疫组化实验。

单克隆抗体一般通过酶联免疫吸附试验或杂交瘤技术获得。

二、底物底物是一种被特定酶催化后能够产生染色或荧光信号的化学物质。

在免疫组化实验中，常用的底物有DAB、VIP、AP、HRP等。

DAB：DAB（3,3'-二氨基联吡啶）是一种常用的免疫组化染色底物。

当DAB与过氧化物酶结合后，在特定条件下会产生棕色沉淀物，用于检测目标分子的位置。

VIP：VIP（维珍纳胶体阳离子）是一种特殊的底物，其在经过过氧化物酶催化后，形成带有阳离子电荷的胶体颗粒。

VIP用于染色后，可以形成黑色沉淀物。

AP：AP（碱性磷酸酶）是一种常用的底物，可以和特定基质反应生成可见或荧光信号。

AP基质有两种常用的类型，一种是快速红色溶液（Fast Red），另一种是紫色溶液。

HRP：HRP（过氧化物酶）是一种广泛使用的底物，在过氧化物酶的作用下可以产生明亮的荧光或染色信号。

HRP染色通常呈现为褐色或黑色。

三、荧光染料荧光染料是一种通过吸收特定波长的光线并在另一个波长下发射荧光的化合物。

免疫组化实验中常用的荧光染料有FITC、TRITC、Cy3、Cy5等。

FITC：FITC（荧光异硫氰酸酯或荧光同硫氰酸酯）是一种常用的绿色荧光染料，其在激发波长为488nm的波长下产生绿色荧光。

TRITC：TRITC（荧光异硫氰酸酯）是一种常用的红色荧光染料，其在激发波长为568nm的波长下产生红色荧光。

Cy3：Cy3是一种荧光发色团，其在激发波长为550nm的波长下产生黄绿色荧光。

Cy5：Cy5是一种荧光发色团，其在激发波长为650nm的波长下产生红色荧光。

辣根过氧化物酶的色原底物 HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(OPD)、2，2’—吖嗪—(3—乙酰苯基噻唑磺酸—6)[2，2’—azino-di(3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6)，ABTS](杂环吖嗪)、四甲基联苯胺(TMB)和4—氨基安替比林：苯酚耦联底物对等。

上述色原底物受HRP作用主要有两种形式的反应：①氧化还原底物的氧化作用，如OPD、ABTS 等；②一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联，如4—氨基安替比林：苯酚等。

(一)氧化还原色原底物 OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯(DAB)。

在pH5．0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收，当pH值降为1．0时，最大吸收波长移动至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深(图4—2)。

因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。

实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化OPD而产生非酶催化的DAB的结果。

有人在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了OPD的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。

OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。

由于OPD的不稳定性，现在的商品试剂盒中，OPD 均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液。

在ELISA测定时，OPD色原底物的具体配方为①显色底物溶液：在0．1mol／L枸橼酸盐缓冲液(pH5．0)中含20 mmol／L OPD和12 mmol／L H202，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H202；②终止液：2 mol／L硫酸(含0．1 mol／L亚硫酸钠)；③测定波长：492nm。

TMB是一种优于OPD 的新型HRP色原底物。

酶的底物3.3.1 HRP的底物HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。

在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。

常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。

OPD本身难溶于水，OPD•2HCL为水溶性。

曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。

OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。

在试剂盒中，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。

过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。

先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液。

TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。

TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。

另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。

酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。

ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。

另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，经HRP 作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量。

HRP氧化TMB后吸收波长1. 介绍HRP（horse radish peroxidase）是一种常用的酶标记物，在生物医学研究和临床诊断中广泛应用。

TMB（3,3’,5,5’-四甲基联苯胺）是一种常用的底物，可以通过HRP催化氧化反应生成蓝色产物。

本文将探讨HRP氧化TMB后的吸收波长。

2. HRP氧化TMB反应原理HRP氧化TMB反应是一种经典的酶标记反应。

在这个反应中，HRP作为催化剂，利用氢过氧化物（H2O2）将TMB氧化为蓝色产物。

该反应的化学方程式如下：TMB + H2O2 + HRP → 蓝色产物 + H2O蓝色产物是由氧化后的TMB形成的，其吸收波长与产物的结构有关。

3. TMB的吸收波长TMB在HRP催化下氧化生成的蓝色产物具有一个特定的吸收波长。

根据文献报道，TMB氧化后的产物在650 nm左右具有最大吸收波长。

这个吸收波长的确定是通过分光光度计测量得到的。

在实验中，将反应体系中的蓝色产物溶液转移到光量管中，然后使用分光光度计测量光量管中的吸光度。

通过扫描不同波长下的吸光度，可以确定TMB氧化产物的最大吸收波长。

4. 影响TMB吸收波长的因素TMB氧化产物的吸收波长可以受到多种因素的影响。

其中一些重要的因素包括：4.1 pH值pH值对TMB氧化产物的吸收波长有一定影响。

根据研究，较低的pH值（酸性条件）下，TMB氧化产物的吸收波长会向红移，即波长增加。

而较高的pH值（碱性条件）下，吸收波长会向蓝移，即波长减小。

因此，在实验中，需要根据具体的研究目的和条件来选择合适的pH值。

4.2 反应时间TMB氧化反应的时间也会对吸收波长产生影响。

一般来说，随着反应时间的延长，TMB氧化产物的吸收波长会逐渐稳定在一个特定的值。

因此，在实验中，需要确定适当的反应时间，以确保吸收波长的准确测量。

4.3 底物和催化剂浓度底物和催化剂的浓度也会对TMB氧化产物的吸收波长产生影响。

一般来说，较高的底物和催化剂浓度会导致吸收波长的增加。

酶和底物酶和底物：主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，还有β-半乳糖苷酶、尿酶等。

1. 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) 应用最广泛。

是从辣根菜中提取的酶类，由糖蛋白和辅基（含铁血红素）构成，辅基为酶活性中心所在，在403nm波长处有最大吸收峰，糖蛋白在275nm波长有最大吸收峰，故用A403nm与A275nm比值代表纯度（reinheir zahl,RZ）。

用于酶免疫技术的HRP，其RZ值应大于3.0。

但注意酶纯度不代表酶活力，酶变性后，RZ不变但活力下降。

HRP的底物有可溶性和不溶性两种。

不溶性底物用于酶免疫组化技术：可溶性底物用于酶免疫测定技术：2. 碱性磷酸酶（alkaline phospharase,AP）可从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，敏感性高，空白值低。

AP不溶性底物：AP可溶性底物一般采用对硝基苯磷酸酯（P-nitrophenyl phosphate,P-NPP），产物呈黄色，测定波长为405nm。

酶标记物的制备酶标记物的制备：抗原由于化学结构的不同，可用不同的方法与酶结合，如为蛋白质，可参照抗体酶标记的方法，酶标记抗体的制备一般用戊二醛法和过碘酸盐法。

1. 戊二醛法：戊二醛是一种双功能团的交联剂，分别与酶分子和免疫球蛋白分子上的氨基结合。

戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。

⑴一步法：将2～5mg纯抗体与5mgA P混合于0.1mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液1ml中，4℃下用同上缓冲液透析平衡。

磁力搅拌下加入1%戊二醛0.05ml，在室温下放置2h，在4℃下用0.05mol/L pH 8.0 Tris缓冲液透析平衡，即可。

⑵二步法：第一步将过量的戊二醛与酶反应，使酶仅与戊二醛结合；第二步是除去多余的戊二醛分子，加入免疫球蛋白，使球蛋白上的氨基与已结合酶的戊二醛分子上的另一活性基团结合，形成一分子酶和一分子免疫球蛋白结合物。

hrp辣根过氧化物酶结构式引言hrp辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，简称hrp）是一种广泛应用于生物技术领域的酶。

它能催化多种底物的氧化反应，因此在生物传感器、生物染色和生物催化等方面具有重要应用价值。

本文将详细介绍hrp辣根过氧化物酶的结构式及其相关特性。

hrp辣根过氧化物酶的结构式hrp辣根过氧化物酶的结构式如下所示：H2O2 + 2HRP（Fe3+）→ 2H2O + 2HRP（Fe4+）HRP（Fe4+）+ 2H2O → 2HRP（Fe3+） + O2hrp辣根过氧化物酶的特性1. 催化反应hrp辣根过氧化物酶能够催化多种底物的氧化反应。

它以氢过氧化物（H2O2）为底物，通过将底物氧化，产生水和氧气。

这种催化反应广泛应用于生物传感器和生物染色等领域。

2. 应用价值hrp辣根过氧化物酶由于其催化反应的特性，在生物技术领域具有重要的应用价值。

它可以用于生物传感器中的底物检测，通过测量产生的氧气来确定底物的浓度。

此外，hrp还可以用于生物染色，如免疫染色和组织染色等。

3. 结构与功能hrp辣根过氧化物酶是一种铁血红素酶，其结构与功能密切相关。

它包含一个辅因子——血红素，能够催化氧化反应。

hrp的结构中还含有一些氨基酸残基，它们与底物结合并催化反应的进行。

4. 反应机制hrp辣根过氧化物酶的反应机制包括两个阶段：氧化阶段和还原阶段。

在氧化阶段，hrp将底物氧化，生成氧气和水。

在还原阶段，hrp通过还原剂将氧气再次还原为水，以便继续催化反应。

hrp辣根过氧化物酶的应用领域hrp辣根过氧化物酶的应用领域非常广泛，下面列举了一些主要的应用领域：1.生物传感器：hrp可以用于底物检测，通过测量产生的氧气来确定底物的浓度。

2.生物染色：hrp可以用于免疫染色和组织染色等，用于检测和观察生物样品中的特定分子。

3.生物催化：hrp可以催化多种底物的氧化反应，用于生物催化反应的加速和控制。