部分中国鲤科(鲃亚科及野鲮亚科)的DNA条形码分析

２０１８年㊀第１３卷第５期ꎬ７６￣８６生态毒理学报Asian Journal of EcotoxicologyV ol.13,2018No.576￣86㊀㊀基金项目:国家重大 水专项 课题(2017ZX07602￣002,2018ZX07208￣002)㊀㊀作者简介:孙晶莹(1992￣)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为分子生态学ꎬE ￣mail:sunjingying2015@ ꎻ㊀㊀*通讯作者(Corresponding author )ꎬE ￣mail:zhangxw@DOI :10.7524/AJE.1673￣5897.20180108001孙晶莹,杨江华,张效伟.环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究[J].生态毒理学报ꎬ2018,13(5):76￣86Sun J Y ,Yang J H,Zhang X W.Identification and biomass monitoring of zooplankton Cladocera species with eDNA Metabarcoding Technology [J].Asi ￣an Journal of Ecotoxicology,2018,13(5):76￣86(in Chinese)环境ＤＮＡ(ｅＤＮＡ)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究孙晶莹ꎬ杨江华ꎬ张效伟*污染控制与资源化研究国家重点实验室ꎬ南京大学环境学院ꎬ南京210023收稿日期:2018￣01￣08㊀㊀录用日期:2018￣02￣28摘要:环境DNA(eDNA)宏条形码(Metabarcoding)技术越来越多地被应用于环境中物种定性识别ꎬ但如何定量监测物种在环境中的丰度尚未得到解决ꎮ本研究以太湖流域常见的5种浮游动物拟同形溞㊁大型溞㊁蚤状溞㊁多刺裸腹溞㊁老年低额溞为研究对象ꎬ建立了一种基于eDNA 宏条形码技术的物种定量方法ꎬ并与实时荧光定量PCR(qPCR)相比较ꎬ研究了eDNA 宏条形码技术多物种定量的准确性ꎮ结果表明ꎬPCR 引物对eDNA 宏条形码的物种检测和定量影响显著ꎮ313bp COI 313引物对浮游动物物种覆盖度高ꎬ但是物种间DNA 扩增的偏好性大ꎬ不适用于eDNA 宏条形码定量检测ꎮ基于COI 序列重新设计的短COI 116引物能够同时检测出所有5个物种ꎮ荧光定量PCR(qPCR)物种拷贝数与物种相对占比呈正相关ꎮeDNA 宏条形码所检出每个物种的序列数与qPCR 定量拷贝数高度一致ꎮ综上ꎬeDNA 宏条形码技术可实现对浮游动物物种的半定量检测ꎬ在生物多样性监测和生物完整性评价有显著的应用价值ꎮ关键词:eDNA 宏条形码ꎻ生物多样性ꎻqPCR ꎻ引物偏好ꎻ生物完整性ꎻ物种丰度ꎻ相对丰度文章编号:1673￣5897(2018)5￣076￣11㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｍａｓｓＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆＺｏｏｐｌａｎｋｔｏｎＣｌａｄｏｃｅｒａＳｐｅｃｉｅｓｗｉｔｈｅＤＮＡＭｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙSun Jingying,Yang Jianghua,Zhang Xiaowei *State Key Laboratory of Pollution Control &Resource Reuse,School of the Environment,Nanjing University,Nanjing 210023,ChinaＲｅｃｅｉｖｅｄ8January 2018㊀㊀ａｃｃｅｐｔｅｄ28February 2018Ａｂｓｔｒａｃｔ:Environmental DNA (eDNA)metabarcoding technology has been increasingly applied to qualitative i ￣dentification of species.However,how to quantitatively monitor different species in the environment has not yet been solved.Here 5common zooplankton species in the Lake Tai basin,including Daphnia magna,Daphniasimiloides,Daphnia pulex,Moina macrocopa,Simocephalus vetulus,were used to develop a quantitative monito ￣ring protocol.The accuracy of multi ￣species eDNA quantification of eDNA metabarcoding of two primer sets were validated by Real ￣time quantitative PCR (qPCR)methods.PCR primers significantly affected the species detection and quantification by eDNA metabarcoding.Although the COI 313primer has high coverage of zooplankton species,it is not suitable for eDNA metabarcoding due to the bias of DNA amplification among species.The COI 116primer第5期孙晶莹等:环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究７７㊀designed in this research was able to detect all5species simultaneously.The DNA copy numbers and count num￣bers of each species were positively correlated in the qPCR quantification.In eDNA metabarcoding,the reads num￣ber of each species increased with its relative proportion of morphological abundance,which was consistent with the results of qPCR.Therefore,eDNA metabarcoding provides a semi￣quantitative detection of zooplankton with suitable primers,which is valuable in the monitoring of zooplankton biodiversity and biological assessment.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:eDNA metabarcoding;biodiversity;qPCR;primer bias;biological integrity;species abundance;relative abundance㊀㊀随着高通量测序技术的发展ꎬ基于环境DNA (eDNA)序列解析混合样本或环境介质物种组成的eDNA宏条形码(eDNA Metabarcoding)技术[1]被逐渐应用于生物学的各个领域ꎬ如微生物多样性分析㊁罕见种和入侵物种监测㊁浮游植物[2]㊁水生动植物生物多样性分析㊁食物网结构重建等[3￣5]研究ꎮ目前ꎬeD￣NA宏条形码研究多集中在物种识别和物种多样性分析ꎬ关于其对物种定量关系的研究相对较少ꎬ这也为该技术在实际环境监测中的应用带来困难ꎮ浮游动物是水生生态系统重要的组成部分ꎬ作为生物标志物能很好地指示水环境质量[6￣7]ꎬ如龟甲轮虫(Keratella sp.)㊁臂尾轮虫(Brachionus sp.)㊁秀体溞(Diaphanosoma sp.)㊁拟裸腹溞(Moinodaphnia sp.)等可以作为水体富营养化的指示生物[7]ꎮ2017年ꎬ有研究首次建立了太湖流域浮游动物条形码数据库[8]ꎬ并开发了基于eDNA的物种识别和高通量生物监测技术用于太湖流域浮游动物多样性研究ꎬ而且发现eDNA宏条形码技术能够显著提高浮游动物物种识别能力和简化浮游动物多样性分析[4,9￣14]ꎮ尽管这上述研究发现浮游动物生物量与序列数之间存在一定线性关系ꎬ并提出可用物种序列数评估物种丰度ꎬ但在eDNA宏条形码技术对物种定量的准确性方面并未做深入探讨ꎬ浮游动物eDNA宏条形码技术的定量体系仍然不够完善ꎮ表１㊀物种定量方法比较Table1㊀Comparison of species quantitative methods定量方法Quantitative methods 定量PCRqPCR传统形态学Traditional morphologyeDNA宏条形码eDNA metabarcoding单位Units DNA拷贝数DNA copies丰度㊁密度㊁生物量Abundance,Density,BiomassDNA量㊁近似生物量DNA concentration,Inferred biomass时间成本Time costs低Low高High低Low人工成本Labor costs中Medium高High低Low应用Application用于定量评估特定目标物种DNA浓度的变化ꎬ常用于不同样品间相同物种的比较Used for quantitatively evaluating the change ofDNA concentration of specific target species,commonly used in the comparison of the samespecies among different samples传统的生态调查ꎬ同一样品中不同物种的比较Traditional ecological surveys,comparison of different speciesin the same sample基于eDNA的生态调查ꎬ同时进行不同样品中相同物种的比较和同一样品中不同物种的比较研究Based on the ecological investigationof eDNA,the comparison of thesame species in different samples andthe comparison of different species inthe same sample优点Advantage 可以进行基因拷贝数的绝对定量Absolute quantitation of genecopy number can be performed金钱成本低ꎬ相关设备简单Low costs,simple equipment required高通量ꎬ信息丰富High throughput,imformative不足Disadvantage 通量较低ꎬ需要依赖标准曲线Low throughput,relying onthe standard curve定量过程未考虑个体差异ꎬ需要丰富的物种鉴定经验ꎬ耗时耗力Quantitative process does notconsider individual differences,needrich experience in species identification,time￣consuming and labor￣intensive定量体系尚不完善Quantitative systemis not perfect７８㊀生态毒理学报第13卷㊀㊀传统水生生物学研究中ꎬ大多通过人工鉴别物种多样性和生物量来反映物种丰度ꎮ尽管传统定量方法简单ꎬ但其未考虑物种个体差异ꎬ并且需要专业的物种鉴定人员㊁耗时耗力[9￣10]ꎮeDNA宏条形码是对eDNA的特定区域进行扩增ꎬ通过高通量测序进行序列识别[15]ꎬ其基本检测单位为eDNA[16]ꎬ这与传统以生物个体数为直接观测单位进行定量分析差异巨大ꎬ如何采用eDNA定量监测不同物种的丰度问题尚未得到彻底解决ꎮ虽然eDNA宏条形码和荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR)[17￣18]均通过检测物种DNA浓度反映物种多度ꎬ充分考虑了物种个体差异(尤其是幼体和成体的区别)ꎬ理论上提供了更加准确的物种定量结果ꎬ但是eDNA宏条形码多采用通用引物扩增环境中的多个物种ꎬ并在PCR 循环结束后进行集中测序ꎬ没有对PCR过程进行连续检测ꎬ其定量结果的可靠性还有待研究(表1)ꎮeDNA宏条形码技术定量研究的缺乏ꎬ也极大的限制了该技术在实际环境监测中的应用ꎮ本研究以太湖流域常见浮游动物拟同形溞(Daphnia similoides)㊁大型溞(Daphnia magna)㊁蚤状溞(Daphnia pulex)㊁多刺裸腹溞(Moina macrocopa)㊁老年低额溞(Simocephalus vetulus)为研究对象ꎬ通过浮游动物不同个体数混合和研究qPCR和eDNA宏条形码技术对浮游动物定量准确性ꎬ提出基于eD￣NA宏条形码技术的浮游动物物种定量体系ꎮ主要分以下四方面进行研究:(1)eDNA宏条形码通用引物和qPCR物种特异性引物设计和选择ꎻ(2)qPCR 物种定量标准方法构建ꎻ(3)用eDNA宏条形码方法定量物种相对丰度验证ꎻ(4)eDNA宏条形码物种相对丰度定量与qPCR物种定量结果的比较ꎮ１㊀材料与方法(Ｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓ)１.１㊀实验对象实验采用的5种浮游动物ꎬ大型溞(D.mag￣na)㊁拟同形溞(D.similoides)㊁蚤状溞(D.pulex)㊁多刺裸腹溞(M.macrocopa)㊁老年低额溞(S.vetulus)分离自太湖流域ꎬ并在实验室驯化培养超过1年ꎬ培养于pH为7.8~8.3的曝气水中ꎬ每周换水3次ꎬ投喂密度为6ˑ106~8ˑ106cells mL￣1的斜生栅藻ꎮ食物培养方法:在灭菌的BG11培养液中接入斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)ꎬ曝气培养3~4dꎬ离心浓缩ꎮ表２㊀ｑＰＣＲ引物设计Table2㊀The primer for qPCR序号No.引物名称Primer name序列(5'￣3')Sequence(5 ￣3 )长度/bpLength/bpTm/ħ1COI.DM.F GGGCCTCCGTTGACTTAAGCATTTCOI.DM.R AGTAAGAGTGCGGTGATTCCAACC166602COI.DP.F AGCAGTGGGTATCACCGCCTTACOI.DP.R CCACCAGCGGGATCAAAGAAAGAT11759.63COI.DS.F CCCAGATATGGCTTTCCCTCGTTCOI.DS.R CAGCATGAGCAATTCCAGCAGAT15258.34COI.M.F TGGAATCACTGCGCTTCTCCTTCOI.M.R CCTCCGGCTGGGTCAAAGAAAG111595COI.SV.F CGGAACTTGGTCAATCAGGGAGTCOI.SV.R GCTCCTCTTTCTACTGCTCCTCCT250596COI116.F TTAGGRGCHCCWGAYATRGCTTCOI116.R GCRTGRGCRATHCCHGCWGA116527Folmer.F GGTCAACAAATCATAAAGAYATYGGFolmer.R TAAACTTCAGGGTGACCAAARAAYCA658508COI313.F GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCCCOI313.R TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA313469M13.F GTAAAACGACGGCCAGTM13.R CAGGAAACAGCTATGAC22255注:物种特异性引物名称对应物种ꎬ即大型溞ꎬCOI.DMꎻ蚤状溞ꎬCOI.DPꎻ拟同形溞ꎬCOI.DSꎻ多刺裸腹溞ꎬCOI.Mꎻ老年低额溞ꎬCOI.SVꎮTm表示引物退火温度ꎮNote:species￣specific primers correspond to species names.Daphnia magna,COI.DM;Daphnia pulex,COI.DP;Daphnia similoides,COI.DS;Moina macrocopa,COI.M;Simocephalus vetulus,COI.SV.Tm stands for melting temperature.第5期孙晶莹等:环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究７９㊀图１㊀ｅＤＮＡ宏条形码技术对浮游动物物种定量检测Fig.1㊀Quantitative monitoring of zooplankton species with eDNA metabarcoding technology１.２㊀研究方法利用通用Folmer 引物[19]扩增出大型溞㊁蚤状溞㊁多刺裸腹溞㊁老年低额溞㊁拟同形溞COI 片段ꎬ并将PCR 产物克隆到pEASY ®￣T3(TransGen Bio ￣tech)中ꎬ构建qPCR 标准质粒ꎮ同时利用COI 片段设计qPCR 特异性引物和eDNA 宏条形码通用引物(表2)ꎮ5种枝角类分别按照固定个体数量混合ꎬ然后分别用qPCR 和eDNA 宏条形码技术进行物种定量分析(图1)ꎮ１.２.１㊀单物种DNA 提取使用E.A.N.A.®Tissue DNA Kit(OMEGA)试剂盒提取单物种DNA ꎬ具体操作如下:用无菌无酶吸管挑取10只生物个体ꎬ将水吸干ꎬ加入200μL TL Buffer ㊁25μL OB Protease Solution 涡旋混匀ꎬ55ħ水浴裂解约3h ꎬ每20~30min 拿出涡旋ꎻ13000ˑg离心5min 取上清ꎻ加220μL BL Buffer 涡旋混匀ꎬ70ħ孵育10min ꎻ加220μL 无水乙醇后过HiBind ®DNA Mini 柱富集DNA ꎻ分别加500μL HBC Buffer 和700μL DNA Wash Buffer 清洗DNA ꎬ重复2次后用100μL Elution Buffer 洗脱ꎻ用Qubit 2.0测定DNA 浓度ꎮ１.２.２㊀混合物种DNA 提取5种枝角类按照表3进行混合ꎬ共7个处理组ꎬ大型溞㊁蚤状溞㊁多刺裸腹溞㊁老年低额溞在每个处理组间生物个体数不变ꎬ均为5只ꎬ拟同形溞在7个处理组间不断增加1~320只ꎬ每个处理组设置3个重复ꎮ混合浮游动物使用MO BIO PowerWater ®DNA Isolation Kit (QIGEN)进行DNA 提取ꎮ具体操作如下:将滤膜放入5mL PowerWater ®Bead 离心管中加８０㊀生态毒理学报第13卷1mL55ħ预热的裂解液ꎬ用MO BIO V otex Adapter 13000￣V1￣15混匀裂解10minꎬ离心取上清ꎮ后续提取步骤与单物种提DNA方法相似:去杂质ꎬ清洗DNAꎬ洗脱ꎮ用Qubit2.0(Thermo Fisher Scientific, USA)进行DNA浓度测定ꎮ１.２.３㊀引物设计用Folmer引物[19￣20](表2)分别对5个不同枝角类物种的DNA进行线粒体COI区域扩增ꎬPCR扩增体系:总体积50μLꎬ包含Transtaq SuperMix(TransGen Biotech)25μLꎬddH2O21μLꎬ上下游引物各1μLꎬDNA模板2μLꎻ扩增条件:94ħ预变性2minꎬ94ħ变性30sꎬ50ħ退火30sꎬ72ħ延伸60 sꎮ用1.5%的琼脂糖凝胶进行条带检测ꎬ用MicroE￣lute DNA Clean Up Kit(OMEGA)纯化ꎬ纯化产物进行Sanger测序(南京金斯瑞)ꎬ获得5个物种的标准COI片段ꎮ用Primer premier6设计物种qPCR特异性引物(表2)ꎬ每对引物均获得单一清晰的特异性条带ꎮ使用VECTOR NTI软件进行序列比对ꎬ根据兼并引物设计原则进行通用引物设计(表2)ꎮ１.２.４㊀浮游动物实时荧光qPCR定量将Folmer引物扩增的5个物种标准COI片段的特异性序列导入pEASY®￣T3载体ꎬ构建5个物种标准质粒ꎮ操作步骤:将准备好的PCR产物和T3克隆载体轻轻混匀后置于冰上进行载体连接约5~10minꎻ然后将插入标准COI片段的T3载体导入Trans￣T1感受态细胞ꎬ轻弹混匀冰浴进行转化ꎻ均匀涂布在LB培养基板上ꎬ过夜培养ꎮ挑选阳性克隆到50mL无菌LB培养基中摇菌6hꎬEasyPure Plasmid MiniPrep Kit(TransGen Biotech)提取质粒DNAꎬ分别用物种特异性引物和M13引物(表2)扩增检测ꎮ用Qubit2.0进行质粒DNA定量ꎬ每个物种的标准质粒按10倍间隔向下稀释5个数量级ꎮqPCR(三步法)实验反应体系20μL:TranStart Top Green qPCR Supermix(TransGen Biotech)10μLꎬddH2O7.8μLꎬCOI特异性引物0.4μLꎬDNA模板1μLꎬPassive Reference Dye0.4μLꎻ反应条件:94ħ预变性30sꎬ40个循环(94ħ变性5sꎬ60ħ退火15sꎬ72ħ延伸10s)ꎬ信号采集设置在退火步骤ꎬ采集时间31sꎮ根据DNA浓度及计算公式计算标准质粒DNA 拷贝数(见1.4)ꎮ将稀释的5个质粒DNA样品所得CT值与标准质粒转化后拷贝数(log10转化)构建标准曲线ꎬ计算每个样品拷贝数ꎬ每个样品3个重复ꎮ１.２.５㊀eDNA宏条形码分析在通用引物前加上8个碱基短序列来区分不同处理组(表4)ꎮPCR反应体系共50μLꎬ包括Phu￣sion酶0.5μLꎬddH2O31.5μLꎬHF Buffer10μLꎬ10 mmol L￣1dNTP1μLꎬ上游引物1μLꎬ下游引物1μLꎬDNA模板2μLꎮ扩增条件:98ħ预变性30sꎬ35个循环反应ꎬ98ħ变性10sꎬ55ħ退火30sꎬ72ħ延伸10sꎮ使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测条带ꎬE.Z.N.A.TM E￣Z96ˑ5Cycle￣Pure Kit(OMEGA)试剂盒纯化样品ꎬQubit2.0进行DNA浓度检测ꎬ各样品按50ng等量混合构建DNA文库ꎮ取混合DNA 100μL再一次纯化(Agencourt AMPure XP kit,Bec￣man Coulter)ꎬ用Ion Plus Fragment Library Kit(Life Technoloiges)试剂盒构建DNA文库ꎬAgilent2100检测DNA文库质量ꎬ稀释DNA文库至100pmol L￣1用Ion torrent OT2200Kit(Life Technoloiges)试剂盒将测序文库连接到Ion Sphere Particles(ISPs)表面ꎬ用Ion torrent PGM(Life Technoloiges,USA)测序仪进行测序ꎮ表３㊀混合样品中物种个体数和拟同形溞占比Table3㊀The number of species in multi￣species samples and the proportion of Daphnia similoides处理组Treatment大型溞D.magna蚤状溞D.pulex多刺裸腹溞M.macrocopa老年低额溞S.vetulus拟同形溞D.similoides拟同形溞/%D.similoides/%DR155551 4.76 DR25555520.00 DR355551033.33 DR455552050.00 DR555554066.67 DR655558080.00 DR7555532094.12第5期孙晶莹等:环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究８１㊀１.３㊀数据处理标准质粒拷贝数计算公式:Copies=[(6.02ˑ1023)ˑC/(Lˑ660)]ˑV(1) Copies为拷贝数ꎻC为标准质粒DNA浓度ꎬ单位ng μL￣1ꎻL为标准质粒DNA长度ꎬ单位bpꎻV为实时荧光qPCR体系中标准质粒DNA体积ꎮ测序数据处理方法:利用Fastx toolkits将FASTQ文件转换成FASTA格式文件和相应的质控文件ꎻ在QIIME(Quantitative Insights into Microbial Ecology)综合计算平台下去除Q<20的低质量序列ꎬ包括引物错配和长度小于110bp大于120bp的序列ꎬ在COI313引物组去除长度小于250bp的序列和引物错配序列ꎮ使用UCHIME程序识别并去除嵌合子ꎻ利用基于UPARSE算法的USEARCH计算OTUs(Operational Taxonomic Units)ꎬ并用SAP(Sta￣tistical Assignment Package)进行基于NCBI核酸数据库的OTUs序列注释ꎮ以上测序数据处理均在Linux系统下操作完成ꎮ形成注释的OTUs文件后用R语言进行后续数据处理ꎮ数据标准化方法:qPCR和eDNA宏条形码2种定量方法的计量单位不同ꎬ结果比较需标准化ꎮ用 Hellinger 转化方法将qPCR物种拷贝数与eD￣NA宏条形码物种序列数标准化ꎮSPSS22.0进行线性回归分析ꎬ相关回归图形在Tableau和Graph￣Pad Prism5软件中绘制ꎮ２㊀结果(Ｒｅｓｕｌｔｓ)２.１㊀qPCR物种特异性引物与eDNA宏条形码引物短COI116较符合eDNA宏条形码通用引物筛选图２㊀４对通用引物琼脂糖凝胶电泳测试图ꎬ５个物种简称见表２附注ꎬＬａｄｄｅｒ为１００ｂｐꎮFig.2㊀The chart of4pairs of universal primer agarose gel electrophoresis test.The short names of5species referred to table3note,ladder is100bp.表４㊀Ｂａｒｃｏｄｅ序列Table4㊀Barcode sequence图３㊀ｅＤＮＡ宏条形码通用引物ＣＯＩ１１６和ＣＯＩ３１３在物种识别上结果对比注:左COI.116(COI116)引物可以将5个物种同时检测出ꎬ而右COI.313(COI313)引物不能检测出蚤状溞ꎮFig.3㊀The differences in species identification of universal primer COI116and COI313for eDNA metabarcoding technology Note:the left primer COI.116(COI116)identify5species at the same time;the right one can not identify D.pulex.８２㊀生态毒理学报第13卷图４㊀物种拷贝数与个体数占比间的关系注:A 图表示拟同形溞在DR1~DR7组中个体数占比与其拷贝数相关性ꎬ包括拟合曲线和95%置信区间ꎻB 图表示其他4个物种在DR1~DR7组间拷贝数的变化ꎮFig.4㊀The relationship between species copies and the proportion of species individualsNote:(A)the correlation of Daphnia similoides copies and proportion of individuals among DR1￣DR7treatment,including fitting curve and 95%confidence interval;(B)The change of the other 4species copies among DR1￣DR7treatment.标准ꎮ5个物种特异性引物PCR 产物长度分别为大型溞166bp ꎬ蚤状溞117bp ꎬ拟同形溞152bp ꎬ多刺裸腹溞111bp ꎬ老年低额溞250bp ꎮ共设计出4对通用引物ꎬ分别对5个物种DNA 进行PCR 测试ꎬ引物3即COI 116(表2)可以同时扩增出5个物种ꎬ且PCR 产物长度㊁凝胶电泳条带清晰单一ꎬ为最符合条件的引物对(图2)ꎮ因此选用COI 116引物进行eD ￣NA 宏条形码定量后续引物测试ꎮ通用引物COI 116和COI 313[4,8,11]在5个物种检测结果中存在明显差异(图3)ꎮ随机将5个物种DNA 与南大校内池塘eDNA 混合在一起作为引物测试标准样品ꎬ结果表明ꎬCOI 116引物扩增目的条带长116bp ꎬ能同时检测出5个物种ꎬ且扩增产物中不包含这5个物种外的其他物种序列ꎻCOI 313引物扩增目的条带长313bp ꎬ能同时检测出4个物种ꎬ无法检测出蚤状溞ꎬ而且对裸腹溞的检测率差ꎬ但能够检测出样品中包含的其他物种ꎮCOI 116更加适合进行eDNA 宏条形码定量研究ꎮ２.２㊀qPCR 方法对多物种混合样品中单物种的定量分析构建的5个物种标准质粒长度和浓度分别为:大型溞质粒长度3205bp ꎬ质粒DNA 浓度13.9ng μL ￣1ꎻ拟同形溞质粒长度3191bp ꎬ质粒DNA 浓度22ng μL ￣1ꎻ蚤状溞质粒长度3156bp ꎬ质粒DNA 浓度17.5ng μL ￣1ꎻ多刺裸腹溞质粒长度3150bp ꎬ质粒DNA 浓度13.5ng μL ￣1ꎻ老年低额溞质粒长度3289bp ꎬ质粒DNA 浓度16.6ng μL ￣1ꎮqPCR 物种拷贝数与个体数相对比例变化呈显著正相关ꎮ相对比例变化的拟同形溞在不同处理组间标准化拷贝数变化与其个体数占比线性回归(图4A)ꎬ拟同形溞标准化拷贝数随着其在DR1￣DR7处理组个体数占比增加而明显增加ꎮ占比由0.27增加至0.98ꎬ增加了0.71ꎬ拷贝数与物种占比间存在显著相关性(R 2=0.929,P<0.0001)ꎻ而大型溞㊁蚤状溞㊁多刺裸腹溞和老年低额溞虽然在7个处理组间个体数目未发生变化ꎬ但相对占比不断减小ꎬ4个物种标准化拷贝数值总和随着个体占比的减小而显著减少ꎬ由1.69降至0.30ꎬ降低了1.39(图4B)ꎮ5个物种拷贝数均与个体数相对比例变化呈相同趋势变化ꎮ２.３㊀eDNA 宏条形码对混合物种的定量分析结果eDNA 宏条形码定量分析的序列数与物种个体数相对占比呈一致性变化趋势ꎮCOI 116引物高通量测序结果按错配碱基数小于3个ꎬ最低相似度为95.69%ꎬ共筛选出DNA 序列27069条(110~120bp)ꎬ聚类23个OTUs ꎬ其中大型溞OTUs 6个ꎬ蚤状溞1个ꎬ拟同形溞4个ꎬ老年低额溞3个ꎬ多刺裸腹溞9个ꎮ在DR1￣DR7处理组间ꎬeDNA 宏条形码所获得的拟同形溞标准化序列数由0.17增加至0.69ꎬ增加了0.52ꎬ标准化序列数与相对比例呈显著正相第5期孙晶莹等:环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究８３㊀图５㊀物种序列数与个体数占比间的关系注:A 图表示拟同形溞在DR1~DR7组中个体数占比与其序列数相关性ꎬ包括拟合曲线和95%置信区间ꎻB 图表示其他4个物种在DR1~DR7组间序列数的变化ꎮFig.5㊀The relationship between species sequences and the proportion of species individualsNote:(A)the correlation of Daphnia similoides sequences and proportion of individuals among treatment DR1￣DR7,including fitting curve and 95%confidence interval;(B)The change of the other 4species sequences among treatment DR1￣DR7.图６㊀ＤＲ１~ＤＲ７处理组间拟同形溞拷贝数与序列数相关性Fig.6㊀The correlation between Daphnia similoides copies andsequences among treatment DR1￣DR7关(R 2=0.885,P<0.0001)(图5A)ꎻ大型溞㊁蚤状溞㊁多刺裸腹溞㊁老年低额溞4个物种标准化后序列数由1.74降为1.30ꎬ下降了0.44ꎬ标准化后序列数随DR1￣DR7组间物种相对比例减少而减少(图5B)ꎮ高通量分析序列数与物种相对比例间的关系和qPCR 物种拷贝数与物种相对占比的关系呈现一致性变化趋势ꎮ２.４㊀qPCR &eDNA 宏条形码单物种定量比较分析拟同形溞拷贝数与物种序列数变化呈显著正相关ꎬ且均随物种相对占比增加而增加ꎮ其个体数占比由4.76%增加至94.12%ꎬ标准化后物种拷贝数值随个体占比约增加了0.71ꎻ标准化序列数值随其个体数所占比例约增加了0.52ꎮ将标准化拷贝数值与标准化后的序列数进行线性回归(图6)ꎬ拟同形溞从DR1组到DR7组ꎬ序列数与拟同形溞拷贝数变化趋势一致ꎬ呈显著正相关(R 2=0.767ꎬP<0.0001)ꎮ大型溞㊁蚤状溞㊁多刺裸腹溞㊁老年低额溞4个物种标准化拷贝数值由DR1到DR7处理组降低了1.39ꎬ4个物种标准化序列数值由DR1到DR7处理组降低了0.44ꎬ拷贝数与序列数下降幅度不同ꎬ但是均呈现均匀下降趋势ꎮ物种序列数变化与物种拷贝数趋势一致ꎬ能够反映物种拷贝数变化ꎮ３㊀讨论(Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ)３.１㊀引物偏好性对eDNA 宏条形码物种监测㊁定量的影响eDNA 宏条形码技术的定量检测受PCR 引物的偏好性影响ꎮ目前应用于浮游动物监测的通用引物有基于线粒体的16S rDNA [21]㊁COI ㊁12S rDNA 标志基因[22￣23]ꎬ基于细胞核的18S rDNA [24]㊁rRNA [25]和28S rDNA [26]的标志基因ꎮ通用引物在设计时为了能同时扩增出尽可能多的物种ꎬ简并度较高ꎬ也导致引物对物种的扩增能力存在较大差异ꎮCOI 313引物是目前浮游动物宏条形码研究最常用的引物之一[4]ꎬ具有较好的物种覆盖度和辨识度ꎮ利用通用引物进行混合物种DNA 扩增ꎬ通常会导致较大的物种扩增效率差异[27]ꎬ有研究建议在物种监测中不８４㊀生态毒理学报第13卷同生物类群使用不同引物[28]ꎮ其他研究也发现样品重复间的引物偏差较小ꎬ而不同COI引物组间物种序列数差异较大[3]ꎮ在本研究中ꎬCOI313引物能够在单物种测试中成功扩增出5种枝角类的COI序列ꎬ但是ꎬ当将5种枝角类的DNA混合在一起时ꎬCOI313引物仅能扩增出4种浮游动物ꎬ无法扩增出蚤状溞ꎬ而我们根据5个物种的COI序列设计的COI116引物能够同时扩增出5个物种ꎮ这说明COI313引物存在明显物种偏好性ꎬ尽管其被广泛应用于生物多样性评价研究中ꎬ但是无法对多物种进行定量检测ꎮ为验证宏条形码定量检测能力而设计的COI116引物虽然可以同时扩增出5种枝角类ꎬ能够用于枝角类多样性监测和定量分析ꎬ但是其在其他群落中普适性有待进一步研究ꎮ综上ꎬeDNA宏条形码引物在监测㊁定量过程中存在较大偏好性ꎬ需根据研究目的筛选合适的引物ꎮ３.２㊀qPCR与eDNA宏条形码对浮游动物多物种定量的比较eDNA宏条形码定量结果与qPCR定量结果一致ꎬeDNA宏条形码技术可实现浮游动物群落半定量监测ꎮqPCR技术广泛应用于基因定量ꎬ也能根据标记基因对物种定量[17,29]ꎬ其优势在于可以进行DNA拷贝数的绝对定量[30￣31]ꎬ已成为DNA定量的金标准ꎮ常用的eDNA宏条形码物种定量研究是基于有机体的生物量与DNA的正比关系ꎬ研究发现物种序列与物种生物量㊁DNA浓度呈正比关系[3,32￣33]ꎬ而以生物丰度为单位的eDNA宏条形码研究很少且定量体系不够成熟ꎮeDNA宏条形码定量监测能用于研究浮游动物物种相对丰度的变化ꎮ本研究通过对混合样品中各物种丰度同时进行qPCR定量和eDNA宏条形码定量ꎬ比较qPCR拷贝数和eDNA宏条形码序列数的关系ꎬ验证eDNA宏条形码定量的准确性ꎬ从而构建基于eDNA宏条形码技术的浮游动物物种定量体系ꎮ结果发现5个浮游动物物种拷贝数与个体数占比呈现一致性趋势变化(R2=0.929,P<0.0001)ꎬ这表明qPCR拷贝数能够反映物种相对丰度变化趋势ꎬ可作为衡量eDNA宏条形码定量准确性的标准ꎮeDNA宏条形码序列数与混合物种个体占比呈明显正相关(R2=0.885,P<0.0001)ꎬ表明eDNA 宏条形码序列数变化能够反映浮游动物类群中物种的丰度变化ꎮ将eDNA宏条形码定量获得的序列数与同处理组qPCR定量拷贝数进行比较ꎬ发现物种序列数与拷贝数随物种个体数所占比例变化呈现显著的一致性变化(R2=0.767,P<0.0001)ꎮ物种拷贝数与序列数下降幅度有显著差异ꎬ主要原因可能是2种方法的定量单位不同而导致的通量不同ꎬ对研究结果无明显影响ꎮ综上所述ꎬeD￣NA宏条形码可用来研究浮游动物物种相对丰度的变化ꎮ３.３㊀eDNA宏条形码技术的半定量监测eDNA宏条形码技术能够实现浮游动物物种半定量监测ꎮqPCR通过连续检测PCR过程中PCR 产物的含量ꎬ进而准确计算模板DNA浓度ꎮ而eD￣NA宏条形码技术仅仅在PCR结束后进行测序ꎬ最终获得的是DNA产物的序列数ꎬ并没有连续检测PCR扩增过程ꎬ因此仅能对模板DNA进行半定量检测ꎬ进而实现对物种生物量的半定量监测ꎮ综上ꎬ在选择适合的引物基础上ꎬeDNA宏条形码技术能够实现浮游动物的半定量检测ꎮ本研究通过对5种浮游动物混合样品中各物种丰度进行qPCR和eDNA宏条形码的定量分析ꎬ评估了eDNA 宏条形码定量的准确性ꎬ结果表明ꎬeDNA宏条形码引物通常存在较大的偏好性ꎬ选择适合的引物可识别生态群落中不同的物种ꎮ同时ꎬeDNA宏条形码与qPCR定量检测均与物种个体数相对比例变化存在较强的一致性ꎬ能够反映物种丰度变化ꎮ该研究为eDNA宏条形码技术在浮游动物多样性监测和生物完整性评价中的应用提供依据ꎮ通讯作者简介:张效伟(1978￣)ꎬ男ꎬ动物学和环境毒理学博士ꎬ教授ꎬ主要从事生态毒理学和健康风险评估方面的研究ꎮ参考文献(Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ):[1]㊀Taberlet P,Coissac E,Pompanon F,et al.Towards next￣generation biodiversity assessment using DNA metabar￣coding[J].Molecular Ecology,2012,21(8):2045￣2050 [2]㊀张宛宛,谢玉为,杨江华,等.DNA宏条形码(metabar￣coding)技术在浮游植物群落监测研究中的应用[J].生态毒理学报,2017,12(1):15￣24Zhang W W,Xie Y W,Yang J H,et al.Applications andprospects of metabarcoding in environmental monitoringof phytoplankton community[J].Asian Journal of Eco￣toxicology,2017,12(1):15￣24(in Chinese)[3]㊀Elbrecht V,Leese F.Can DNA￣based ecosystem assess￣ments quantify species abundance?Testing primer biasand biomass Sequence relationships with an innovativemetabarcoding protocol[J].PLoS One,2015,10(7):第5期孙晶莹等:环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究８５㊀e0130324[4]㊀Yang J H,Zhang X W,Xie Y W,et al.Zooplanktoncom￣munity profiling in a eutrophic freshwater ecosystem￣Lake Tai Basin by DNA metabarcoding[J].Scientific Re￣ports,2017,7(1):1773[5]㊀Leray M,Boehm J T,Mills S C,et al.Moorea BIOCODEbarcode library as a tool for understanding predator￣preyinteractions:Insights into the diet of common predatorycoral reef fishes[J].Coral Reefs,2012,31(2):383￣388 [6]㊀Contreras J J,Sarma S S,Merino￣Ibarra M,et al.Season￣al changes in the rotifer(Rotifera)diversity from a tropi￣cal high altitude reservoir(Valle de Bravo,Mexico)[J].Journal of Environmental Biology,2009,30(2):191￣195 [7]㊀Rajagopal T,Thangamani A,Sevarkodiyone S P,et al.Zooplankton diversity and physico￣chemical conditions inthree perennial ponds of Virudhunagar District,Tamilnadu[J].Journal of Environmental Biology,2010,31(3):265￣272[8]㊀Yang J H,Zhang X W,Zhang W W,et al.Indigenousspecies barcode database improves the identification ofzooplankton[J].Plos One,2017,12(10):e0185697 [9]㊀Lindeque P K,Parry H E,Harmer R A,et al.Nextgenera￣tion sequencing reveals the hidden diversity of zooplank￣ton assemblages[J].Plos One,2013,8(11):e81327 [10]㊀Machida R J,Hashiguchi Y,Nishida M,et al.Zooplank￣ton diversity analysis through single￣gene sequencing of acommunity sample[J].BMC Genomics,2009,10(1):438 [11]㊀Leray M,Yang J Y,Meyer C P,et al.A new versatileprimer set targeting a short fragment of the mitochondrialCOI region for metabarcoding metazoan diversity:Appli￣cation for characterizing coral reef fish gut contents[J].Frontiers in Zoology,2013,10(1):34[12]㊀Bucklin A,Lindeque P K,Rodriguez￣Ezpeleta N,et al.Metabarcoding of marine zooplankton:Prospects,pro￣gress and pitfalls[J].Journal of Plankton Research,2016,38(3):393￣400[13]㊀Chain F J J,Brown E A,MacIsaac H J,et al.Metabar￣coding reveals strong spatial structure and temporal turn￣over of zooplankton communities among marine andfreshwater ports[J].Diversity and Distributions,2016,22(5):493￣504[14]㊀Yang J H,Zhang X W,Xie Y W,et al.Ecogenomics ofzooplankton community reveals ecological threshold ofammonia nitrogen[J].Environmental Science&Technol￣ogy,2017,51(5):3057￣3064[15]㊀Cristescu M E.From barcoding single individuals to me￣tabarcoding biological communities:Towards an integra￣tive approach to the study of global biodiversity[J].Trends in Ecology&Evolution,2014,29(10):566￣571 [16]㊀Yoccoz N G.The future of environmental DNA in ecolo￣gy[J].Molecular Ecology,2012,21(8):2031￣2038 [17]㊀VanGuilder H D,Vrana K E,Freeman W M.Twenty￣fiveyears of quantitative PCR for gene expression analysis[J].BioTechniques,2008,44(5):619￣626[18]㊀Huggett J,Dheda K,Bustin S,et al.Real￣time RT￣PCRnormalisation;strategies and considerations[J].Genes andImmunity,2005,6(4):279￣284[19]㊀Folmer O,Black M,Hoeh W,et al.DNA primers for am￣plification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunitI from diverse metazoan invertebrates[J].Molecular Ma￣rine Biology and Biotechnology,1994,3(5):294￣299 [20]㊀Deiner K,Fronhofer E A,Machler E,et al.EnvironmentalDNA reveals that rivers are conveyer belts of biodiversityinformation[J].Nature Communications,2016,7:1￣9 [21]㊀Clarke L J,Soubrier J,Weyrich L S,et al.Environmentalmetabarcodes for insects:In silico PCR reveals potentialfor taxonomic bias[J].Molecular Ecology Resources,2014,14(6):1160￣1170[22]㊀Tang C Q,Leasi F,Obertegger U,et al.The widely usedsmall subunit18S rDNA molecule greatly underestimatestrue diversity in biodiversity surveys of the meiofauna[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,2012,109(40):16208￣16212 [23]㊀Leray M,Knowlton N.DNA barcoding and metabarcod￣ing of standardized samples reveal patterns of marine ben￣thic diversity[J].Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2015,112(7):2076￣2081[24]㊀Brown E A,Chain F J J,Zhan A,et al.Early detection ofaquatic invaders using metabarcoding reveals a high num￣ber of non￣indigenous species in Canadian ports[J].Di￣versity and Distributions,2016,22(10):1045￣1059 [25]㊀Pearman J K,Irigoien X.Assessment of zooplanktoncommunity composition along a depth profile in the Cen￣tral Red Sea[J].Plos One,2015,10(7):e0133487 [26]㊀Hirai J,Kuriyama M,Ichikawa T,et al.A metagenetic ap￣proach for revealing community structure of marineplanktonic copepods[J].Molecular Ecology Resources,2015,15(1):68￣80[27]㊀Pinol J,Mir G,Gomez￣Polo P,et al.Universal and bloc￣king primer mismatches limit the use of high￣throughputDNA sequencing for the quantitative metabarcoding of ar￣。

鲤科鱼类八亚科检索表（新）1（14）鳃的上方无螺形的咽上器官2（13）臀鳍无硬刺3（10）臀鳍分支鳍条在7根以上4（9）下颌前缘无锋利的角质5（8）无腹棱，背鳍无硬刺6（7）第5眶下骨与眶上骨接触…………………………………鱼丹亚科（宽鳍鱲、马口鱼）鳍膜边缘有缺刻（马口鱼）鳍膜边缘无缺刻（宽鳍鱲）7（6）第5眶下骨不与眶上骨相连……………………………………………雅罗鱼亚科（青鱼、草鱼、东北雅罗鱼、赤眼鳟、鱤）青鱼：咽齿1行草鱼：咽齿2行，无须东北雅罗鱼：咽齿2行，细长，末端呈钩状赤眼鳟：咽齿3行，顶端稍呈钩状；有2对极小的须；口裂倾斜；眼上缘各具一块红斑鱤：咽齿3行；吻长超过吻宽，口裂伸至眼中部下方；尾鳍分叉很深8（5）有腹棱，背鳍具硬刺…………………………………………………鲌亚科（鳊、团头鲂、三角鲂、翘嘴红鲌、蒙古红鲌、青梢红鲌、红鳍鲌）鳊：口端位，口裂斜，上颌比下颌稍长；腹棱完全；无须；眼侧位；咽齿3行，顶端略呈钩状；鳔3室团头鲂：口端位，上下颌等长；腹棱不完全；下咽齿3行；鳔3室；三角鲂：上颌与下颌等长；腹棱不完全；翘嘴红鲌：口上位，口垂裂，下颌急剧向上翘，突出于上颌前缘；咽齿3行，齿端呈钩状蒙古红鲌：口斜裂，下颌比上颌长；腹棱不完全青梢红鲌：口上位，斜裂，下颌突出于上颌的前方；腹棱不完全；腹鳍有硬棘红鳍鲌：口上位，口裂几乎与体纵轴垂直；有腹棱；咽齿3行；鳔3室19（4）下颌前缘具锋利的角质………………………………………………鲴亚科（银鲴、细鳞斜颌鲴、圆吻鲴、黄尾鲴、似鳊）银鲴：口小，下位，横裂；无腹棱或腹棱不明显；上下颌具角质边缘；尾鳍暗黄色，深叉形细鳞斜颌鲴：口小，下位，横裂呈弧形；腹棱明显；下颌有较发达的角质边缘；尾鳍橘黄而后缘黑色，深叉形圆吻鲴：口极宽，横裂；无腹棱；下颌具锐利而发达的角质边缘；尾鳍呈新月牙形黄尾鲴：口小，下位，横裂；腹棱不明显；下颌具角质边缘；尾鳍艳黄色似鳊：口下位，横裂，唇较薄；具腹棱；颌角质边缘不发达；尾鳍浅灰色10（3）臀鳍分支鳍条在6根以下11（12）鳞片基部无放射肋………………………………………………鮈亚科（唇䱻、花䱻、铜鱼、圆口铜鱼、长蛇鮈、蛇鮈）唇䱻：头长大于体高；吻长大于眼后头长；须1对；成鱼体侧一般无斑点；花䱻：头长小于体高；吻长小于或等于眼后头长；须1对；体侧有7-11块大黑斑铜鱼：口呈马蹄状；具须；口狭；咽齿末端呈钩状；体呈肉红状或金黄色圆口铜鱼：须1对；口宽长蛇鮈：唇厚，具乳突；胸部具鳞蛇鮈：唇厚，具小乳突；胸部无鳞12（11）鳞片基部具放射肋…………………………………………鲃亚科（刺鲃、中国倒刺鲃）刺鲃：须2对；背鳍无硬刺中国倒刺鲃：须2对；背鳍具硬刺13（2）臀鳍具硬刺………………………………………………………鲤亚科（鲤、鲫、银鲫）鲤：须2对；下咽齿3行；体察，略侧扁鲫：无须；下咽齿1行；体侧扁而高银鲫：体显著高而宽214（1）鳃的上方具螺形的鳃上器官……………………………………………鲢亚科（鲢、鳙）鲢：腹棱完全鳙：腹棱不完全3。

广西淡水鱼类研究Ⅰ.鲤科：(鱼丹)亚科、雅罗鱼亚科、鲌亚
科
陈旻
【期刊名称】《柳州职业技术学院学报》
【年(卷),期】2001(001)002
【摘要】本文记载了广西鲤科鱼类三个亚科的鱼类34种(3种为新记录),其中(鱼丹)亚科5种、雅罗鱼亚科7种、鲌亚科22种.对与<广西水鱼志>记载有出入的物种作了说明;对某些物种的资源状况作了分析.
【总页数】6页(P64-69)
【作者】陈旻
【作者单位】柳州职业技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q959.46+8
【相关文献】
1.几种雅罗鱼亚科鱼类基于mtDNA序列的亲缘关系 [J], 窦新杰;常玉梅;唐然;陶然;梁利群
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3.广西鲤科鱼类研究Ⅱ.鲴亚科、鲢亚科和鮈亚科 [J], 陈旻
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5.中国鲤科鱼类染色体组型的研究Ⅺ．裂腹鱼亚科二种鱼和鳅鮀亚科三种鱼的染色体组型 [J], 李渝成;李康;桂建芳;周暾
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我国鲤科鱼类分类总结汪海西南大学生命科学学院北碚重庆400715摘要：鲤科（Cyprinidae)，是鲤形目下种类最多的一个科，包括210属2010种。

其特征是口部有须，有咽齿没脂鳍。

最后一对鳃弧腹面部分特别粗壮，成为下咽骨，上有1～3行咽齿。

具角质咽磨、体常被覆瓦状圆鳞，无脂鳍；背鳍只有1个，前部有2～4根不分支鳍条；腹鳍腹位；尾鳍多呈叉形，绝少平截或微凹。

最大是巨暹罗鲤（Catlocarpio siamensis），可以长到3米。

我国共有132属532种和亚种。

关键词：中国鲤科分类1. 简介鲤科鱼类是鲤形目中分布最广、种类也最多的一群。

台湾共有八十余种初级淡水鱼，其中鲤科即占了将近一半。

它们的形态与生态习性富于变化，多数种类只有一个背鳍，腹鳍在腹位，且和臀鳍明显分开，尾鳍分叉；身体被覆圆鳞；口器则分化为各种不同的类型，以便摄取各类的食物。

本科为鱼类中最大的一科，约有200多属，2000多种，都是淡水鱼类，分布很广。

我国有鲢鱼、鲤鱼、裂腹鱼、鳅鮀、鳊、雅罗鱼、鲴、鳑鲏、鲃、鮈共10个亚科。

我国鲤科鱼类中的主要经济鱼类有“四大家鱼”（青鱼Mylopharyngodon piceus、草鱼Ctenopharyngodon idellus、链Hypophthalmichthys molitrix、鳙Aristichthys nobilis）、鲤Cyprinus carpio、鲫Carassius auratus、鳊Megalobrama terminalis、团头鲂Parabramis pekinensis等，是池塘养鱼的主要对象。

鲤科鱼类的观赏鱼也是种类繁多，大、中、小型鱼都有，约有1600多种（我国约产370种），属于热带观赏鱼的种类主要分布在东南亚和非洲。

2. 形态特征鲤科鱼类颌骨无齿。

最后一对鳃弧腹面部分特别粗壮，成为下咽骨，上有1～3行咽齿。

具角质咽磨、体常被覆瓦状圆鳞，无脂鳍；背鳍只有1个，前部有2～4根不分支鳍条；腹鳍腹位；尾鳍多呈叉形，绝少平截或微凹。

2008年 第53卷 第13期: 1560~1569《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS 论文贝叶斯联合模型与中国洞穴鱼类分化时间的估算(鲤科: 金线鲃属)李志强①②, 郭宝成①②, 李俊兵①②, 何舜平①*, 陈宜瑜①①中国科学院水生生物研究所, 武汉 430072;②中国科学院研究生院, 北京 100049*联系人, E-mail: mailto:clad@2008-01-07收稿, 2008-05-04接受国家自然科学基金重点项目(批准号: 30530120)和国家重点基础研究发展计划(批准号: 2007CB411600)资助摘要金线鲃属分布于中国云贵高原及周边地区, 包括10多种适应于洞穴生活、具有不同程度眼睛和色素退化的典型洞穴鱼类. 迄今为止, 金线鲃属的系统发育关系还存在很大争议. 我们获得了34种金线鲃属鱼类及外类群的细胞色素b和ND4基因序列, 用贝叶斯联合模型分析数据, 重建了金线鲃属的系统发育关系; 并用松散分子钟估算了本属及内部分支的起源时间. 金线鲃属的单系性得到强烈的支持, 本属可分为6个分支. 此外, 本研究结果还支持洞穴物种的多系起源假说以及季氏金线鲃(Sinocyclocheilus jii)的基部位置. 松散分子钟估算表明, 金线鲃属起源于晚中新世, 在11百万年前(million years ago, Ma)左右, 比以前设想的要古老. 关键词金线鲃属系统发育松散分子钟洞穴生物由于其奇特的特征, 如有些感觉器官和附肢的加强、眼睛和色素的退化或消失, 引起了人们极大关注[1,2]. 洞穴生物可作为研究自然选择及适应性进化的模式系统[1]. 目前, 已有研究利用墨西哥脂鲤(Astyanax mexicanus)作为模式生物来研究洞穴生物及其洞穴特征的演化[3~5]. 在硬骨鱼类中, 除了墨西哥脂鲤外, 鲃金线属(Sinocyclocheilus)也可作为另外一个模型, 因为此属包含了众多洞穴物种, 并且这些物种具有不同程度的适应洞穴生活的特征, 包括眼睛和色素不同程度的退化及向前突出的角状结构(称为头角或顶骨突, 通常由顶骨后部或上枕骨共同参与形成). 鲃金线属是中国特有鱼类, 隶属于鲤鲃科亚科, 俗名金线鱼, 分布局限于云贵高原喀斯特岩溶地貌发育地区的溶洞及地表河流和湖泊, 包括云南省东部、贵州省南部及广西壮族自治区北部. 至2004年, 本属已描述的有效种共为51种(53个指名种)[6].鲃如果用金线属作为模型来研究洞穴生物的自然选择及适应性进化, 首先要明确其属内物种的系统发育关系. 鲃虽然对金线属的系统发育做了很多工作, 但其属内关系仍存在较大的争议[7~9], 尤其是属内的洞穴物种. 单乡红和乐佩琦[7]的形态学结果显示, 洞穴物种是二分支的; 但是王大忠等人基于28个形态及骨骼性状认为洞穴物种是一单系群[8]. 金线鲃属洞穴物种的一些形态或骨骼性状是与洞穴环境相适应的特化或退化特征, 不具有完全的系统学意义. 鲃因此金线属的系统发育关系及洞穴物种的起源需要用其他类型的数据来研究. 分子数据可能会更好地解决有争议类群的系统发育关系, 因为许多分子数据相对于形态数据而言受适应性进化的影响小, 如中性位点. Xiao等人[9]首次利用线粒体细胞色素b和ND4鲃基因研究了金线属的系统发育关系, 得出了与形态学工作[7,8]迥异的结果: 鲃金线属的洞穴物种并不是一个单系群, 而是分散在5个分支中. Xiao鲃等人的工作极大地增进了我们对金线属系统发育的了解. 但是他们选择的唯一外类群是不合适的, 鲃因为四须属不是一个单系群[10,11]; 同时他们认为由于快速的物种形成而导致这5个分支之间的相1560 论 文互关系没有解决[9]. 由于没有标定点进行分子钟校正, 他们简单采用了其他鱼类线粒体蛋白质编码基因的替代速率, 因而其分化时间的估算可能不准确.鲃本研究利用贝叶斯联合模型分析重建金线属的系统发育关系. 贝叶斯联合模型具有诸多优点: 它可以对联合数据分区; 对每个分区分别赋予一个最适合的模型; 同时也允许每个模型的参数有极大的变动. 贝叶斯联合模型对联合数据的分析提供了极大的便利, 应会降低系统误差, 得到更准确的后验概率[12,13]. 本研究测定了5鲃种金线属鱼类的细胞色素b 和ND4基因序列, 主要目的是: (ⅰ) 利用更多的外鲃类群重建金线属的系统发育关系; (ⅱ) 利用非参数速率平滑法(nonparametric rate smoothing, NPRS)、罚分似然法(penalized likelihood, PL)及贝叶斯法3种松散分子钟方法来估算所得到的分支起源时间.1 材料和方法(ⅰ) 样品来源及外类群的选择. 本研究所用5鲃种金线属鱼类共9个个体采自于广西和云南. 由于GenBank 没有花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni )的ND4基因序列, 因此我们也测定了其ND4序列. 赵亚辉在详尽的形态学工作基础上, 给出了一个新的分类检索系统[14], 鲃因此金线属鱼类标本的鉴定按其分类系统. 所有肌肉样品用95%乙醇固定, 标本保存于中国科学院水生生物研究所淡水鱼类博物馆. 根据鲤科鱼类的分子系统发育结果[15], 我们选择鲤科中处于基部位置的斑马鱼(Danio rerio )作为远缘外类群, 还选择了广义鲤亚科的一些物种作为外类群: 即鲤族(Cyprinini)的鲤鱼(Cyprinus carpio )、黑鲫(Carassius carassius ), 青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii )、花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni )鲃、(Barbus barbus )、宽鲃头四须(Barbodes laticeps )鲃和异斑小(Puntius ticto ); 野鲮族(Labeonini)的贝氏野鲮(Labeo bate-sii )[15].(ⅱ) PCR 扩增和DNA 测序. 采用标准的苯酚/氯仿抽提法[16]从95%乙醇保存的肌肉样品中提取基因组DNA. 通过PCR 扩增来获得细胞色素b 和ND4基因的目的片段. 细胞色素b 基因PCR 扩增引物为Glu-F 和Thr-R [17]; ND4基因的引物序列为: ND4F (5′-AAC AAG ACC TCT GAT TTC GGC TCA-3′) 和ND4R (5′-TAG CTT CCA CTT GGA TTT GCA CC-3′). PCR 反应总体积为50 μL, 其中含100 ng 基因组DNA, 10×缓冲液5 μL, 引物(10 μmol/L)各1 μL, dNTP (每种浓度为2.5 μmol/L) 2 μL, Taq 聚合酶2.0 U, 最后补足双蒸水至终体积. PCR 反应条件为: 94℃预变性3 min; 94℃变性30 s, 54℃退火30 s (ND4基因为51℃), 72℃延伸1 min (ND4基因为90 s), 共35个循环; 72℃终延伸8 min. 每次反应设立不含DNA 模板的空白对照组. 扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳后, 用OMEGA 凝胶回收试剂盒(OMEGA Bio-Tek)回收目的片段. ND4全基因序列的测定采用纯化的PCR 产物, 测序引物采用与PCR 反应相同的引物及一条中间引物(5′-GAT GAG TAG GCA ATT AGT GA-3′). 为了得到细胞色素b 基因全序列, 以pMD18-T (TaKaRa)为连接载体, 以Top 10作为宿主菌, 对目的片段进行克隆. 对筛选到的阳性克隆进行测序, 引物采用M13通用测序引物. 内类群及外类群其他物种的细胞色素b 和ND4基因序列均从GenBank 下载. 所有序列信息见表1.(ⅲ) 系统发育分析. 采用Clustal X [18]软件对DNA 序列进行排序, 参数值为默认值, 并对排序结果进行手工校正. 在MEGA3.1[19]中把DNA 序列翻译成蛋白质序列, 检查是否存在无义突变. 利用 PAUP *4.0b10[20]计算序列碱基组成及对序列碱基组成的异质性进行卡方检验(chi-square test, χ2).贝叶斯联合模型分析采用MrBayes 3.1.1[21]软件, 用MODELTEST 3.7[22]选择联合数据中每个分区的最适模型, 选择标准用相对于广泛使用的等级似然率检验(hierarchical likelihood-ratio tests, hLRTs)具有一些优势的贝叶斯信息准则(Bayes information criterion, BIC). 等级似然率检验的一些缺陷有: (1) 需要对参数的增加或删除做任意选择; (2) 需要确定增加或移除参数的顺序; (3) 不能考虑模型选择的不确定性[23], 因此本研究所有模型选择的标准都基于BIC. 由于不同基因和相同基因的不同密码子位点可能具有很不相同的进化模式, 按照Brandley 等人[13]的方法, 我们采用了8种不同的分区策略, 用贝叶斯因子来选择最优的分区策略(表2). 所有的分区策略均用大写字母P 表示, 数字下标表示分区的数目, 具有同一数字下标但有不同字母下标表示具有同样的分区数目但分区策略不同. 两个不同假设H 0和H 1的贝叶斯因子(Bayes factor) B 01等于H 0和H 1边际似然值之比值, 但边际似然值很难直接计算, 可用调和平均数来代替[24]. 我们用MrBayes 中的sump 命令得到调和平均数. 因此, 贝叶斯因子可表示为两种不同分区策略之15612008年7月第53卷第13期表1 本研究所用标本及序列的详细信息GenBank登录号b)类元和标本采集地a)细胞色素b ND4Sinocyclocheilus macrocephalusAY854684 AY854741Sinocyclocheilus oxycephalus AY854685 AY854742Sinocyclocheilus lunanensis AY854686 AY854743Sinocyclocheilus maitianheensis AY854710 AY854767Sinocyclocheilus anophthalmus AY854715 AY854772Sinocyclocheilus malacopterus AY854697, AY854699, AY854700 AY854754, AY854756, AY854757 Sinocyclocheilus guishanensis AY854722 AY854779Sinocyclocheilus yangzongensis AY854725, AY854726 AY854782, AY854783Sinocyclocheilus qujingensis AY854719 AY854776Sinocyclocheilus rhinocerous AY854720 AY854777Sinocyclocheilus angustiporus AY854702 AY854759Sinocyclocheilus hyalinus AY854721 AY854778 Sinocyclocheilus huaningensis AY854718 AY854775Sinocyclocheilus lateristriatus AY854703, AY854704 AY854706 AY854760, AY854761, AY854763 Sinocyclocheilus tingi AY854701 AY854758 Sinocyclocheilus grahami AY854694, AY854695, AY854696 AY854751, AY854752, AY854753 Sinocyclocheilus microphthalmus AY854687, AY854689 AY854744, AY854746Sinocyclocheilus lingyunensis AY854691, AY854693 AY854748, AY854750Sinocyclocheilus anatirostris AY854708 AY854765Sinocyclocheilus tianeensis AY854717 AY854774Sinocyclocheilus furcodorsalis AY854709 AY854766Sinocyclocheilus halfibindus AY854723 AY854780Sinocyclocheilus altishoulderus AY854724 AY854781Sinocyclocheilus jii AY854727, AY854728 AY854784, AY854785Sinocyclocheilus macrolepis AY854729 AY854786Sinocyclocheilus macrophthalmus AY854733 AY854790Sinocyclocheilus jiuxuensis AY854736 AY854793Sinocyclocheilus bicornutus AY854730, AY854731 AY854787, AY854788Sinocyclocheilus cyphotergous AY854711 AY854768Sinocyclocheilus multipunctatus AY854712, AY854713 AY854769, AY854770Sinocyclocheilus longibarbatus AY854714 AY854771Sinocyclocheilus xunlensis 广西环江EU366187, EU366190 EU366184, EU366185Sinocyclocheilus yimenensis 云南易门EU366191, EU366192 EU366179, EU366180Sinocyclocheilus purpureus 云南罗平EU366189, EU366194 EU366177, EU366178Sinocyclocheilus maculates云南宜良EU366193 EU366183 Sinocyclocheilus qiubeinsis 云南嵩明EU366188, EU366195 EU366181, EU366182外类群Cyprinus carpio X61010 X61010 Carassius carassius NC_006291 NC_006291 Barbus barbus NC_008654 NC_008654 Puntius ticto NC_008658 NC_008658 Labeo batesii AB238967 AB238967 Gymnocypris przewalskii AB239595 AB239595 Gymnocypris eckloni AY463522 EU366186Barbodes laticeps AY854738 AY854795 Danio rerio AC024175 AC024175 a) 鲃没有采集地信息的金线属物种, 请参照文献[9]; b) 新测基因序列的GenBank 登录号以黑体显示间调和平均数之比值. 本研究中, 如果2lnBayes factor≥10, 则认为备择假说得到很强烈的支持[25]. 初步分析发现Temp = 0.2 (MrBayes的默认值)时, 相邻链之间交换不充分或者完全没有交换; 因此我们把参数Temp的值设为0.04, 发现相邻链之间交换的频率在10%~70% (MrBayes的推荐值)之间, 此值被1562论文用在所有的贝叶斯分析中. 所有的贝叶斯分析均以随机树作为起始树, 4条链(3条热链1条冷链)同时运行5×106代, 每1000代对系统树抽样一次, 其他参数的先验值设定为默认值. 除了支长和拓扑结构外, 同一分析中不同分区其他参数都使用unlink命令来区别对待; 同时我们也使用“prset ratepr = variable”选项来允许分区内速率变异的存在. 我们把似然值对代数作图来检验贝叶斯分析的收敛性, 用在线软件AWTY[26]的cumulative命令把模型中所有的参数对运行代数作图来检测贝叶斯分析的收敛性. 不同分区策略的贝叶斯分析均从不同起点独立运行两次. 比较两次运行似然值的平均值, 同时也用AWTY[26]的compare命令来比较两次运行每个分支的后验概率值. 如果两次运行中上述参数很相似, 则用两次运行“burn-in”之后的树来生成一致树.表2 本研究所采用的分区策略分区策略分区方法1一个分区P2A联合数据密码子第一和第二位点; 联合数据密码子第三位点P2B细胞色素b; ND4P3对联合数据按三个密码子位点分区P4A细胞色素b作为一个分区, ND4按三个密码子位点分区P4B细胞色素b按三个密码子位点分区; ND4作为一个分区P4C细胞色素b密码子第一和第二位点; 细胞色素b密码子第三位点; ND4密码子第一和第二位点; ND4密码子第三位点P6对细胞色素b和ND4分别按三个密码子位点分区(ⅳ) 分子钟检验及分化时间的估算. 为了估算分化时间, 我们首先用PAUP*4.0b10[20]进行似然率检验, 即替代速率恒定假设是否适合细胞色素b和ND4 基因序列. 将基于相同替代模型的具有分子钟约束的ML树与不受分子钟约束的ML树的似然对数值相比较; 如果二者差异不显著, 则分子钟假设不被拒绝. 我们也用BEAST v1.4.5[27]来研究替代速率在系统树中的行为,采用不相关松散对数正态分子钟(uncorrelated relaxed lognormal clock)模型, 总共运行3×106代, 每1000代进行抽样, 核苷酸替代模型选择GTR + I + Γ. 用Tracer v1.3[28]分析BEAST抽样产生的数据, burn-in值为1.5×106.迄今为止, 鲃还没有金线属鱼类化石或相关地质事件的报道, 因此系统发育树不能在内类群中标定. 我们采用在外类群的两个标定点: C1标定点是黄河上游和青海湖隔离的地质时间0.15 Ma[29], 作为下限; C2标定点是计算的鲤族和野鲮族的分歧时间[15]15.96 Ma, 因为鲤族的结鱼属(Tor)未包括在本研究中,此标定点作为上限. 根据贝叶斯因子选择的最优分区策略所建系统树作为进行分子钟标定的树. 我们用非参数速率平滑法[30]及罚分似然法[31]进行分子钟的估算, 这两种方法均在r8s中执行[32]. 我们也用Multidivtime[33,34](可从/thorne/获得)进行贝叶斯松散分子钟的计算. 这两个软件基于不同的原理: r8s根据树的枝长来计算, Multidiv-time中执行的贝叶斯方法依据导入树的拓扑结构和相应的序列数据来计算. 对NPRS和PL法, 分别选择Powell和TN方法来进行优化, PL方法中的最佳平滑值由交叉验证法(cross-validation)获得. 对贝叶斯分子钟估算而言, 我们对最优的拓扑结构进行修剪,使每个物种只有一个单倍型. 贝叶斯方法可整合不同谱系和不同基因之间进化速率的差异. 把联合数据按基因分为两个分区. 按照Rutschmann[34], Yang和Yoder[35]的方法, 分为3步: (1) 用PAML v3.14[36]软件包中的Baseml程序估算F84 + Γ 模型中的相关参数: 碱基频率、转换/颠换比值κ, Γ 分布的形状参数α; (2) 用Multidivtime软件包中的Estbranches程序估算系统树的支长及其支长的方差-协方差矩阵, 以Baseml的输出结果作为Estbranches的输入; (3) 把作为所有物种外类群的斑马鱼从系统树中去掉, Est-branches的输出结果作为Multidivtime的输入, 马尔科夫链的蒙特卡洛方法(Markov chain Monte Carloprocess, MCMC)设置为2×106代, 每100代抽样一次,burn-in设定为2×105代. 为确保MCMC算法的收敛性, MCMC从不同起点独立运行两次, 得到节点分化时间的标准偏差(standard deviations, SD)及95%置信区间(credibility intervals, CI). 在运行MCMC之前,我们先对root age, root rate和rate autocorrelation的平均值及标准偏差等参数设定如下: 以18 Ma (SD =1.8 Ma)作为tree root到tip分化时间的期望值(鲤亚科的出现时间[15]); 每位点每百万年0.007的替换速率(SD = 0.0007)作为tree root节点的进化速率; 分支自主相关程度的参数(ν)设置为0.08 (SD = 0.08). 我们按照Thorne和Kishino[33]的建议调整了ν的值, 使ν与root age之积在1与2之间.15632008年7月第53卷第13期2 结果2.1 细胞色素b和ND4基因的序列特征我们测定了9个个体的细胞色素b全基因序列, 共得到8个单倍型. 与其他从GenBank下载的细胞色素b全基因序列比对后得到1140个位点, 包含537个可变位点, 其中434个位点为简约信息位点, 比例分别为47.1% 和38.1%. A, T, C, G的平均含量分别为29.5%, 27.9%, 27.9%, 14.7%, 呈反G偏倚. 异质性检验表明密码子第1和2位点是同质的, 但第3位点具有异质性: 第1位点, χ2=34.036, d f = 180, P=1.000; 第2位点, χ2 = 3.756, d f = 180, P = 1.000; 第3位点, χ2 = 316.585, d f = 180, P < 0.001. 但所有位点的组成是同质的: χ2 = 130.112, d f = 180, P = 0.998.鲃测定了金线属9个个体及花斑裸鲤1个个体的ND4全基因序列(1381 bp), 得到10个单倍型, 以T作为不完全终止密码子. 与下载的ND4基因序列比对后得到1032个位点, 包含484个可变位点, 其中397个位点为简约信息位点, 比例分别为46.9%和38.5%. A, T, C, G的平均含量分别为31.0%, 27.3%, 27.1%, 14.6%, 呈反G偏倚. 异质性检验表明密码子3个位点的组成均是同质的: 第1位点,χ2 = 25.028, d f = 180, P = 1.000; 第2位点, χ2 = 3.979, d f = 180, P = 1.000; 第3位点, χ2 = 167.505, d f = 180, P = 0.739. 细胞色素b及ND4的同质性表明我们所用的数据不会对系统树的构建产生负面影响.2.2 联合数据的分区及金线鲃属的系统发育联合数据共包含2172个碱基. 不同分区的最适模型见表3. 由于MrBayes中没有TrN和TrNef模型, 因此我们用更通用的GTR模型来代替.所有的贝叶斯联合模型分析的似然值在2×105代就达到了平衡; 但用AWTY[26]的cumulative命令把模型中的所有参数对运行代数作图表明MCMC在2.5×106代才达到平衡(未显示). 每个分区策略两次运行的似然值都很相似, 其他参数也没有显著性差异. 因此丢弃每次运行的初始2500棵树, 用剩余的5002棵树生成一致树.各个分区策略两两比较之贝叶斯因子及似然值平均数见表4. 从表中可以看出, 对联合数据按3个密码子位点分区的策略(P3)是最好的. 由于每个贝叶斯联合模型分析所得到的系统树拓扑结构几乎完全一致, 因此我们以P3生成的贝叶斯树(图1)来讨论金表3 不同分区及其最适进化模型和所包含位点数分区进化模型分区所包含位点数ND4 TrN + I + G 1032ND4第1位点TrNef + G 344ND4第2位点HKY + I + G 344ND4第3位点TrN + I + G 344ND4第1和第2位点HKY + I + G 688cyt b TrN + I + G 1140cyt b第1位点K80 + G 380cyt b第2位点HKY + I 380cyt b第3位点GTR + I + G 380cyt b第1和第2位点HKY + I + G 760联合数据TrN + I + G 2172联合数据第1位点K80 + I + G 724联合数据第2位点HKY + I + G 724联合数据第3位点GTR + I + G 724联合数据第1和第2位点HKY + I + G 1448鲃线属的系统发育关系. 鲃金线属的单系性得到强烈的支持, 其后验概率为PP = 0.96; 鲃金线属可分为6个分支. 鲃季氏金线(S. jii)鲃在金线属中处于基部位置; 鲃其他金线属鱼类形成一强烈支持的单系群(PP = 1.00), 为S. jii的姐妹群. 除S. jii外的其他金线鲃属鱼类可分为5个分支: 分支A, C, D和E均得到强烈的支持, 后验概率均为PP = 1.00; 分支B的后验概率不高, 为0.74. 分支D和E的所有物种均为典型洞穴鱼类, 后者形成分支A, B, C和D的姐妹群(PP =1.00). 分支A所包含的物种是最多的.2.3 分子钟的估算对数似然比检验表明, 细胞色素b (χ2 = 152.33558, d f = 59, P<<0.001)和ND4(χ2 = 102.00113, d f = 59, P < 0.001)的替代速率恒定假设均不成立. 通过Tracer v1.3分析得到参数ucld的标准偏差为0.519, 速率变异系数为0.512, 均小于1, 表明联合数据具有中等的速率异质性. PL法中, 通过交叉验证法得到的最优平滑值为0.0001. 贝叶斯联合模型P3生成的系统树作为进行分子钟标定的树. 用Multidivtime得到的超量树见图2, 表5列出了主要节点的分化时间, 3种方法所计算的结果很一致. 鲃金线属的起源时间为11 Ma左右(95% CI为13.23~8.00 Ma), 节点2~5随后快速出现, 表示在这一段时间有快速的物种形成事件. 除了分支C从中上新世到晚上新世开始辐射, 其他分支都从晚中新世开始辐射.1564论文图1 通过贝叶斯联合模型(P3)构建的50%一致树节点处的数字代表后验概率(小于50%的未显示)15652008年7月第53卷第13期表4 各个分区策略之贝叶斯因子及似然值平均数分区策略P1P2A P2B P3P4A P4B P4C P6−ln L20445.47 19555.93 20437.85 19458.26 20024.37 19898.88 19542.06 19477.12 P1−P2A1761.96 −P2B−12.62 −1774.58 −P31966.94 204.98 1979.56 −P4A822.28 −939.68 834.9 −1144.66 −P4B1080.22 −681.74 1092.84 −886.72 257.94 −P4C1788.18 26.22 1800.8 −178.76 965.9 707.96 −P61891.90 129.94 1904.52 −75.04 1069.62 811.68 103.72 −a) 左下角数字为贝叶斯因子3 讨论3.1 贝叶斯联合模型分析的性能及分区的选择从表4可以看出, 贝叶斯联合模型分析的确极大地提高了似然值. 但随着分区数目的增加, 似然值并不一定得到提高; 每个分区如何划分更重要, 这支持了Brandley等人[13]、Guo和Wang[37]的结论. 例如, Xiao等人[9]对联合数据采用的按基因分区的P2B, 并不优于P1; P4A, P4B, P4C和P6虽然分区数目比P3多, 但P3的似然值是最高的. 就基因而言, 对细胞色素b按密码子位点分区(P4B)比对ND4按相应位点分区(P4A)对似然值提高的贡献大一些, 前者与后者相比提高了125.49个对数似然单位. 对联合数据按密码子位点分区的P2A, P3, P4C和P6, 比按照基因分区的策略P2B, P4A和P4B对似然值提高的贡献大得多, 表明线粒体同一条链上不同蛋白质基因相同密码子位点具有相似的进化模式. 贝叶斯因子表明, P3比其他任何一种分区策略提高的似然值都大. 在2lnBayes factor≥10的标准下, 所有的分区策略都是互不相同的, 但是拓扑结构都很相似, 只在某些节点的后验概率上有差异, 尤其是一些深部节点. 例如, P2B的深部节点的后验概率0.85, 0.96, 0.51和0.51分别被P3相应节点的后验概率0.91, 0.94, 0.81和0.64代替. 正如Brandley等人[13]、Guo和Wang[37]指出的那样, 我们也认为现行的2lnBayes factor≥10标准是否对额外的分区给予了足够的罚分.3.2 金线鲃属的系统发育我们的系统发育结果与基于形态工作的系统发育假设不相同[7,8], 但与Xiao等人[9]的结果部分一致: 洞穴物种是一个多系群, 散布在5个分支中, 不支持王大忠等人[8]提出的洞穴物种是单系群的假设; 也不支持单乡红和乐佩琦提出的洞穴物种是二分支的假设[7], 这说明有些形态性状不具有完全的系统学意义.鲃由于鲤鱼和黑鲫与金线属的关系更近, 因此宽头鲃四须并不是一个最合适的外类群. 我们得到的分支D和E分别与Xiao等人[9]得到的分支Ⅲ和Ⅳ相同; 分支C由S. xunlensis与Xiao等人[9]得到的分支Ⅱ形成; 本研究新增另外4个物种与Xiao等人[9]得到的分支Ⅴ形成分支A. 分支B是本研究与Xiao等人的一个主要不同之处: Xiao等人的分支Ⅰ包括S. multipunctatus和S. cyphotergous, 在本研究中, 分支B包括这两个物种和S. macrolepis. 虽然分支B的后验概率不高; 但在我们的MP树和ML树中, 分支B的支持率均大于50% (未发表数据), 说明分支B是可靠的. Xiao等人没有解决S. macrolepis的位置, 可能是因为他们选择了不合适的外类群.Xiao等人与本研究的另一个不同之处在于这6个分支之间的相互关系. 在MP树中, 其相互关系为(((((A,C),B),D),E),F), 并且根据AU, KH和SH检验, MP树与贝叶斯树(((((A,B),C),D),E),F)并没有显著差别(未发表数据). 因此, 只有分支A, B和C的相互关系没有解决. 相比之下, Xiao等人[9]的5个分支之间的相互关系都没有解决. 因此, 我们认为Xiao等人没有解决分支Ⅲ和Ⅳ在系统树中的位置不能归咎于金鲃线属的快速分化[9].S. lunanensis和S. halfibindus的物种有效性还具有争议[7,9,14]. 本研究中, S. halfibindus与S. mi-crophthalmus两个单倍型之间的细胞色素b基因p距离分别为0.526%和0.702%, ND4基因的p距离分别为0.388%和0.484%; S. lunanensis和S. oxycephalus细胞色素b和ND4基因p距离分别为0.175%和0.097%. 由于它们的遗传距离非常小, 形态上又非常相似, 因此我们支持S. halfibindus是S. microphthalmus的同物异名; S. lunanensis是S. oxycephalus的同物异名[7,14].1566论 文图2 从Multidivtime 得到的超量树支长代表时间, C1和C2代表标定点3.3 金线鲃属鱼类的起源及分化与Xiao 等人的研究结果相比, 本研究估算的金鲃线属起源时间及其内部分支起源时间均比其估算的要久远. 例如, 分支D 和E 估算的分歧时间其平均15672008年7月 第53卷 第13期表5 3种方法计算的主要节点的分化时间r8s Multidivtime 节点NPRS PL 均值(SD) 95% CI1 11.51 11.41 10.61(1.35) (8.00, 13.23)2 9.36 9.16 8.99(1.34) (6.42, 11.64)3 8.79 8.58 8.73(1.33) (6.19, 11.37)4 8.09 7.87 8.20(1.32) (5.68, 10.80)5 7.68 7.45 7.88(1.32) (5.37, 10.51)6 5.63 5.27 5.71(1.20) (3.50, 8.12)7 7.12 6.90 7.38(1.31) (4.89, 10.01)8 2.97 2.85 3.49(1.08) (1.69, 5.88)9 6.29 6.10 6.80(1.36) (4.26, 9.54)10 6.44 5.89 6.54(1.30) (4.15, 9.22)值分别为 6.80和 6.54 Ma, 95%置信区间分别为4.26~9.54, 4.15~9.22 Ma; 而Xiao 等人得到的分支Ⅲ和Ⅳ其分歧时间95% HPD (highest posterior density)分别为2.254~8.177和1.94~6.299 Ma . 我们估算的分化时间与王大忠和陈宜瑜[38]的假设部分一致, 鲃即金线属鱼类的原始祖先在第三纪晚期已存在于云贵高原一带, 在第三纪结束时已发生了一定程度的物种分化. 但同时我们的研究结果也表明本属鱼类的起源及分化时间比王大忠和陈宜瑜估计的要久远得多.鲃金线属的最近共同祖先(most recent common ancestor, MRCA)出现在11 Ma 左右, 随后在9~8 Ma 发生了4次快速的分支形成事件(图2, 节点2, 3, 4和5). 我们估算的分歧时间可为青藏高原隆起过程的假说提供佐证, 鲃因为金线属鱼类扩散能力弱, 分布局限, 云贵高原的隆升与青藏高原的隆升密切相关. 青藏高原隆起的假说有两种: 一种认为在20 Ma 左右青藏高原开始了快速的隆起及夷平, 直到10~8 Ma 才开始显著的隆起从而达到有意义的高度[39]; 另一种观点则认为青藏高原在8 Ma 前就已经达到了最大高度, 随后由于张裂(extensional faulting)而降低, 在3.6 Ma 左右开始了近期的快速隆升[40]. 按照前一种假说, 东亚季风肇始于9~8 Ma, 夏季风会给东亚地区带来丰沛的降水[41]. 因此, 本研究支持前一种假说.众所周知, 大气中二氧化碳含量的变化对全球气温具有巨大而可以预测的变化. 有趣的是, 我们发现这一时期全球二氧化碳含量的变化与金线鲃属鱼类的分化具有很大的一致性. 自从早中新世以来(大约24 Ma 左右), 大气中二氧化碳的含量比以前地质时期二氧化碳的含量要低—— 保持在500 μL/L 以下, 并且相对而言也比以前更加稳定[42]; 但是二氧化碳含量的波动仍是相当可观的. 研究表明, 从14 Ma 到9 Ma, 大气中二氧化碳含量处于稳步升高的过程, 随后一直保持工业化前的水平[42,43], 均大于210 μL/L [42]. 这10个节点的估算的分化时间与大气中二氧化碳含量的波动是大体相关的. 在北半球的大冰期来临之前, 亚洲大陆温暖而湿润, 加上高浓度的二氧化碳, 岩石的风化作用可能因此而加强了. 因此, 鲃金线属的分化与这一时期的环境变化可能紧密关联, 但是这需要收集更多的证据.致谢 李再云、陈自明、陶进能在采样过程中予以帮助; 李维贤提供部分标本; 郭宪光和Brandley 在贝叶斯联合模型分析中给予热心帮助; 王绪祯博士对论文写作提出了宝贵意见, 在此一并表示感谢.参考文献1 Culver D C, Kane T C, Fong D W. Adaptation and Natural Selection in Caves. Cambridge: Harvard University Press, 19952 Romero A. The Biology of Hypogean Fishes. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 20013 Protas M E, Hersey C, Kochanek D, et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet, 2006, 38(1): 107—111[DOI]4 Jeffery W R. Adaptive evolution of eye degeneration in the Mexican blind cavefish. J Hered, 2005, 96(3): 185—196[DOI]5 Dowling T E, Martasian D P, Jeffery W R. Evidence for multiple genetic forms with similar eyeless phenotypes in the blind cavefish, Astyanax mexicanus . Mol Biol Evol, 2002, 19(4): 446—4556 Zhao Y H, Watanabe K, Zhang C G. Sinocyclocheilus donglanensis , a new cavefish (Teleostei: Cypriniformes) from Guangxi, China. Ichthyol Res, 2006, 53: 121—128[DOI]7 单乡红, 乐佩琦. 金线鲃属鱼类系统发育研究(鲤形目: 鲤科: 鲃亚科). 动物学研究, 1994, 15(增刊): 36—44 8 王大忠, 陈宜瑜, 李学英. 金线鲃属的系统发育分析(鲤形目: 鲤科: 鲃亚科). 遵义医学院学报, 1999, 22: 1—69Xiao H, Chen S Y, Liu Z M, et al. Molecular phylogeny of Sinocyclocheilus (Cypriniformes: Cyprinidae) inferred from mitochondrial DNA sequences. Mol Phylogenet Evol, 2005, 36(1): 67—77[DOI]1568。

基于线粒体co1基因序列的dna条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用DNA条形码技术是一种新兴的物种鉴定方法，通过对生物样品中特定基因片段的序列进行分析，可以快速、精确地鉴定生物物种。

在鱼类物种中，线粒体CO1基因序列被广泛用于DNA条形码分析。

本文将探讨基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用。

一、线粒体CO1基因的特点线粒体CO1基因是线粒体DNA中编码蛋白质的基因之一。

该基因在不同鱼类物种中的序列变异性非常高，但同种鱼类物种中的序列差异很小。

这一特点使得线粒体CO1基因序列成为一种很好的DNA条形码。

此外，线粒体CO1基因的序列长度大约在650个碱基对左右，长度适中，易于测序和分析。

二、鲤科鲌属鱼类物种的特点鲌属（Carassius）是鲤科（Cyprinidae）中的一个属，包括了很多鲫鱼的近缘种。

该属鱼类物种的形态结构、生态习性和分布范围等方面存在着很大的差异。

因此，传统的形态学鉴定方法仅仅基于形态的特征来判断鱼类物种的真实身份往往存在着一定的误差。

三、基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码在鲌属鱼类物种鉴定中的应用由于鲌属鱼类物种的形态和基因序列存在一定的差异，因此可以利用线粒体CO1基因序列作为DNA条形码来鉴定不同鲌属鱼类物种之间的差异。

研究表明，基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码可以成功地鉴定不同鑫龙鱼种群之间的态差异，且比传统的形态鉴定方法更为准确和高效。

此外，基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码技术还可以用于鱼类物种的遗传连锁图谱构建、种群遗传学研究、鱼类物种起源和演化研究等领域。

研究还表明，DNA条形码技术的开发和应用对于保护和管理鱼类物种资源具有积极的意义。

四、DNA条形码技术在鱼类物种鉴定中的优点相比传统的形态学鉴定方法，DNA条形码技术具有如下优点：1.高效： DNA条形码技术可以快速准确地鉴定大量的鱼类物种，比传统的形态学鉴定方法更为高效。

DNA条形码技术在主要观赏鱼物种鉴定中的应用分析陈信忠;郭书林;龚艳清【摘要】通过检索BOLD SYSTEMS数据库和Gen Bank中锦鲤、金鱼、慈鲷、神仙鱼、七彩神仙鱼、血鹦鹉、花罗汉、龙鱼、孔雀鱼、鼠鱼、魟鱼等主要观赏鱼的DNA条形码和基因序列,应用MEGA软件计算种间遗传距离,在BOLD SYSTEMS数据库中检索相似序列,以分析DNA条形码在主要观赏鱼物种鉴定中的应用效果。

结果表明该技术可以有效鉴别大多数种以上阶元的观赏鱼类,但对亲缘关系较近、种类繁多的多种慈鲷、孔雀鱼等观赏鱼物种难以获得准确的鉴定结果,对金龙、红龙等亚洲龙鱼的亚种以及人工繁育的不同品系的锦鲤、金鱼、神仙鱼、七彩神仙鱼、血鹦鹉、花罗汉等鱼类,无法通过COI基因条形码进行鉴别,需要研究其他分子生物学方法。

【期刊名称】《渔业研究》【年(卷),期】2017(039)001【总页数】7页(P8-14)【关键词】观赏鱼 DNA条形码物种鉴定应用【作者】陈信忠;郭书林;龚艳清【作者单位】厦门出入境检验检疫局,福建厦门361026【正文语种】中文【中图分类】S917.4近年来我国观赏鱼产业和国际贸易快速发展。

全球已知具有商业化价值的观赏鱼类约有2 000余种。

虽然约80%的观赏鱼来自人工繁育，但绝大多数观赏鱼的原产地来自非洲、南美洲以及东南亚部分国家和地区[1]。

由于观赏鱼种类繁多，欣赏价值和经济价值相差巨大，因此对观赏鱼物种的准确鉴定，成为观赏鱼国际贸易中迫切需要解决的问题。

传统的形态学鉴别方法主要依据鱼类的形态、体色和斑纹等特征，由于很多鱼类的形态特征容易受年龄、环境和养殖条件等因素的影响，尤其许多鱼类的卵和幼体很难进行形态学鉴别。

因此，迫切需要开发更加准确的物种鉴别方法。

基于DNA序列进行物种鉴定的DNA条形码技术为观赏鱼物种的准确鉴定提供了全新的方法。

全球鱼类生命条形码计划(Fish Barcode of Life Initiative，FISH-BOL)于2004年开始实施，并建立了生命条形码数据系统(Barcode of Life Data Systems，BOLD SYSTEMS)。

中国动物药材DNA 条形码数据库[摘要]课题组联合相关研究者开展动物药材DNA 条形码分子鉴定研究，并结合分析GenBank 序列，采用BLAST分析防错、系统树分析防错和Barcoding Gap 检验防错等方法核验序列的可靠性，构建了中国动物药材DNA 条形码数据库。

该库由样品数据库、序列数据库和文献数据库组成，包含800 余种动物药材和大量动物药材混伪品及密切相关物种。

中国动物药材DNA 条形码数据库可以通过中药材DNA 条形码鉴定系统 ( )进行网络访问并实现未知动物样本的DNA 条形码鉴定。

该研究首次构建统一的中国动物药材DNA 条形码数据库，对动物药材鉴定、资源可持续利用和濒危物种保护均有重要意义。

[关键词]动物药材；数据库；COI ；鉴定DNA 条形码技术是动物药材鉴定的新工具[1] ，国家药典委员会已讨论通过在《中国药典》增补本中列入中药材DNA 条形码分子鉴定指导原则[2] 。

本课题组联合相关研究者开展了大量的动物药材DNA 条形码分子鉴定研究工作。

鄢丹等对包含羚羊角、鹿角的传统角类药材进行DNA 条形码研究[3] ，并以此为基础提出了濒危动物药材的贸易监控和替代品寻找策略[4] 。

张辉等对《中国药典》45 种动物药材及其混伪品进行 DNA 条形码研究， 结果表明 45 种动物药材的 正品来源与其混伪品均可相互区分 [5] 。

崔丽娜等利用 COI 序列对金钱白花蛇及其常见混伪品进行 DNA 条形码鉴别研 究，结果表明， 金钱白花蛇 COI 序列可以明确地与混伪品区 分开[6] 。

胡嵘等对海马、海龙及其混伪品共 14 个种 20 份样 品的 COI 条形码序列进行研究， 结果表明运用 COI 序列能够 准确鉴定海马、海龙的基原动物及其混伪品 [7] 。

此外，还开 展了龟甲、鳖甲、鹿茸以及蛤壳等的 DNA 条形码研究工作[8-11] 。

动物 DNA 条形码分子鉴定研究工作的大量开展，为 构建中国动物药材 DNA 条形码数据库奠定了基础。