生物样品分析方法的基本要求

方法分类
按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC。
（一）HPLC法
1. 对HPLC仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。
2. 系统性试验
色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)2 分离度：R = 2（tR1 – tR2)/(W1 + W2); 要大于1.5 拖尾因子：T = W0.05h/2d1 应在0.9 ～ 1.05
后银量法
3. 利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量
（1）含锑药物 例如：葡萄糖酸锑的含量测定
Sb5+ + 2KI H+ Sb3+ + 2K+ ++ I2
I2 + 2Na2S2O3
2NaI + Na2S4O6
（2）含铁药物
2Fe3+ + 2KI I2 + 2Na2S2O3
2Fe2+ + 2K+ + I2 2NaI + Na2S4O6
2. 制剂 要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原 料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。
具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3, 共9个数据来评价 回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC法时，一般回 收率可达98%～102%；容量法可达99.7%～100.3%
（二）数据要求
回收率% = （测定平均值— 空白值）/加入量×100% 要求制备高、中、低三浓度的样品，各测定3次。应 报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值 之差及其可信限。
3. 百分含量的计算
（1）直接滴定法 D% = V ×F × T/W ×100% F = 实际标定的浓度/规定的浓度

9012生物样品定量分析方法验证指导原则9012生物样品定量分析方法验证指导原则是为了确保生物样品定量分析方法的准确性和可靠性而制定的一系列原则和指导。

生物样品定量分析方法验证是指通过实验和数据分析，验证该方法能够准确、可靠地定量分析生物样品中目标物质的含量。

以下是关于9012生物样品定量分析方法验证指导原则的详细介绍。

1.验证目标：明确验证的目标，即要验证的生物样品定量分析方法和目标物质的含量范围。

验证的目标应明确具体，包括检测的目标物质、所用的定量方法和样品类型等。

2.实验设计：合理设计验证实验方案。

验证实验应采用相关的生物样品，并根据目标物质的特性选择合适的样品处理方法。

实验设计应包括重复次数的确定、正负对照样品的设置和实验步骤的详细描述。

3.准确性：验证方法的准确性是指分析结果与真实值之间的一致性。

通过对一定数量的已知浓度样品进行分析，评估方法的准确性。

评估指标可包括回收率、偏差等指标。

4.精密度：验证方法的精密度是指同一样品在重复测量条件下，方法重复性的可靠性。

通过测量同一样品的重复测量值，评估方法的精密度。

评估指标可包括相对标准偏差(RSD)、变异系数等指标。

5.灵敏度：验证方法的灵敏度是指方法对目标物质浓度变化的敏感程度。

通过测量不同浓度样品的分析信号，评估方法的灵敏度。

评估指标可包括最低检测限、定量限等指标。

6.选择性：验证方法的选择性是指方法对其他干扰物质的响应能力。

通过测量其他相关物质的干扰试验，评估方法的选择性。

评估指标可包括干扰物质的峰检出率、峰分离度等指标。

7.稳定性：验证方法的稳定性是指方法在规定条件下的变化范围。

通过存储试样的时效试验、方法的变更试验等，评估方法的稳定性。

评估指标可包括试样的峰面积或峰高百分含量的变化程度。

8.结果分析：根据验证实验的结果，进行数据统计和分析。

根据评估指标的要求，判断方法是否满足准确性、精密度、灵敏度、选择性和稳定性等要求。

结果分析应包括合理的统计方法和结果显示方式。

生物样品定量分析方法验证指导原则1.设计验证计划：验证计划应明确验证的目的、范围和任务，并确定所需资源和时间。

验证计划还应包括验证参数、验证样品数量和测试条件等详细信息。

2.确定验证参数：验证参数是指确定方法准确性、精密度、线性范围、检测限和选择性等方面的参数。

根据具体的分析方法，选择适当的验证参数进行验证。

3.准确性验证：准确性验证包括回收率、加标回收率和对照品比较等方法。

在准确性验证中，使用已知浓度的标准品或对照品进行分析，并比较结果与标准值或真实值之间的差异。

4.精密度验证：精密度验证是通过重复测定同一样品，评估方法的精密度。

重复测定应在相同条件下进行，采用适当的统计方法计算结果的精密度。

5.线性范围验证：线性范围验证涉及不同浓度下的响应与浓度之间的线性关系。

通过分析一系列不同浓度的标准品或对照品，并绘制浓度与响应之间的曲线，确定方法的线性范围。

6.检测限验证：检测限是方法能够可靠检测到的最低浓度。

通过分析一系列浓度低于检测限的样品，并确定能够可靠检测到的最低浓度。

7.选择性验证：选择性验证是评估方法对目标物和干扰物的选择性。

通过分析不同的样品矩阵或添加干扰物，并验证分析结果是否受到干扰。

8.数据分析：在验证完成后，应进行数据分析和评估。

使用适当的统计方法，计算准确度、精密度和线性范围等参数，并评估分析方法的可行性和可靠性。

9.结果报告和文件管理：验证的结果应记录并报告。

应编写验证报告，包括验证计划、实验结果、数据分析和结论等。

还应制定相应的文件管理措施，以确保验证结果的追溯性。

综上所述，生物样品定量分析方法验证是确保分析结果准确性和可靠性的重要步骤。

实施验证需要设计验证计划、确定验证参数、进行准确性、精密度、线性范围、检测限和选择性等方面的验证，并进行数据分析和结果报告。

通过遵循上述指导原则，可以有效验证生物样品定量分析方法的可行性和可靠性。

生物样品分析方法的基本要求目录一、内容概述 (2)1.1 目的与意义 (3)1.2 生物样品分析的重要性 (3)二、生物样品的采集与保存 (4)2.1 采样原则与方法 (5)2.2 样品类型及采集量 (6)三、生物样品的前处理 (8)3.1 提取与分离 (9)3.2 净化与富集 (10)3.3 样品制备过程中的注意事项 (12)四、分析方法的建立与验证 (13)4.1 分析方法的选择 (15)4.2 方法学考察 (15)4.3 确证实验设计与实施 (17)五、生物样品分析质量控制 (18)5.1 质量保证与控制体系 (19)5.2 检测方法的性能指标 (21)5.3 质量控制图的绘制与应用 (22)六、生物样品分析结果的报告与解释 (24)6.1 结果报告的内容与格式 (25)6.2 结果的解释与判断 (27)6.3 异常值的分析与处理 (28)七、生物样品分析方法的应用与发展趋势 (30)7.1 应用领域与案例分析 (32)7.2 新技术、新方法的发展趋势 (34)一、内容概述生物样品分析方法的基本要求是针对生物样本进行科学研究的基础工具与技术方法的具体规范，主要涉及到实验设计、样本采集、样本处理以及分析方法等内容。

本文内容概述将概述该分析方法的整体框架与核心内容。

本文将阐述生物样品分析的基本目的和意义，强调其对于生物科学研究的重要性。

会介绍分析方法的实验设计部分，包括实验对象的选取原则、实验设计的合理性和科学性等要求。

本文将详细介绍样本采集的要求，包括采样点的选择、采样时间的选择以及采样技术的标准化等。

本文将重点介绍样品处理过程，包括样品的保存、预处理以及化学或物理性质的调整等步骤，以确保样品的完整性和准确性。

本文将强调分析方法的建立与优化，包括实验技术的选择与应用、数据分析与解读等关键环节，以确保分析结果的准确性和可靠性。

生物样品分析方法的基本要求涵盖了实验设计、样本采集、样本处理和分析方法等多个方面，旨在确保生物样品分析的准确性和可靠性，为科学研究提供可靠的实验数据支撑。

微生物样品的取样方法及取样要求样品取样的要求1）在取样之前应确认货、证是否相符。

2）取样过程中应避免与水等环境的不良因素影响，防止样品被污染。

3）取样用具（如注射器、采血管、试管、探子、铲子、匙、取样器、剪子、样品袋等）必须是经过灭菌的。

4）对采集的样品一般要求随机取样。

若怀疑最有可能受病原体污染或者带有病原体的样品，可以进行选择取样。

5）根据样品种类（如盒装、袋装、瓶装和罐装），应取完整密封的样品。

如果样品很大，则需用无菌取样器取样；若样品是粉末，应边取边混合；若样品是液体的，通过振摇即可混匀；若样品是冷冻的，应保持冷冻状态（可放在冰内、冰箱的冷盒内或低温冰箱内保存），而非冷冻动物产品须保持在0℃~5℃中保存。

6）取样前或取样后应在盛装样品的容器或样品袋上立即贴上标签，每件样品必须标记清除（包括品名、来源、数量、取样地点、取样人及取样日期）。

7）获取有关取样产品的信息：如样品名称、批量大小、包装类型、包装容器体积、生产线、产品编号或控制号、批量号、标签内容、包装破损状况、产品存放地点或建筑物的基本情况等。

8）当客户对所规定的取样程序有偏离、添加或删节的要求时，应详细记录这些要求和相关的取样资料，并记入包含检测结果的所有文件中，同时告知相关人员。

9）当取样作为检测一部分时，实验室应有程序记录与取样有关的资料和操作。

这些纪录应包括所用的取样程序、取样人的识别、环境条件（如果相关）、必要时有抽样地点的图示或其他等效方法，如果合适，还应包括取样程序所依据的统计方法。

食品微生物学的取样点食品微生物的取样计划中常包括以下取样点：原料、生产线（半成品、环境）、成品、库存样品、零售商店、或批发市场、进口或出口口岸。

原料的取样包括食品生产所用的原始材料、添加剂、辅助材料及生产用水等。

生产线样品是指食品生产过程中不同加工环节所取的样品，包括半成品、加工台面、与被加工食品接触的仪器面以及操作器具等。

对生产线样品的采集能够确定细菌污染的来源，可用于食品加工企业对产品加工过程卫生状况的了解和控制，同时能够用于特定产品生产环节关键控制点的确定和HACCP的验证工作。

加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有：CUS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上清液。
5.酶解法
在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。
加入中性盐 使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。 常用的中性盐：饱和硫酸胺等。盐析的方法与有机溶剂提取法常并用，药物的回收率高。
加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有：10%三氯醋酸等。含药物血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质，取上清液作为样品。在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。
批内精密度：是同一次测定的精密度。所得RSD应争取达到5％以内，但不能超10％。 批间精密度：是不同次测定的精密度。所得RSD应控制在15％以内。 回收率一般应在85%－115%范围内，在LOD附近应在80%一120％范围内。
1
（四）最低定量限
最低定量限LOQ至少能满足测定3 -5个半衰期时样品中的药物浓度或Cmax的1/10一1/20时的药物浓度。
常用的烷基化试剂：碘庚烷、叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺（TMAH）等； 常用的酰化试剂：乙酸酐、丙酸酐等； 硅烷化试剂：三甲基氯硅烷（咖CS）、双-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（IMTS）等。
具有光学异构体药物的分离也可采用不对称试剂，使其生成非对映异构体衍生物，然后用GC法或HPLC法进行分析测定。常用的不对称试剂有：（S）-N-三氟乙酰脯氨酰氯、（S）-N-五氟乙酰脯氨酰氯等。

生物样品定量分析方法验证指导原则（草案）11. 范围2准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和3制剂研发非常重要。

这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动4学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。

因此，必须完整地验证和5记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。

6本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实7际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。

8生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。

9应该在相应的生物样品分析中遵守GLP原则或GCP原则。

102.生物分析方法验证112.1 分析方法的完整验证12分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析13物浓度的可靠性。

此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。

一般应对每14个物种和每种基质进行完整验证。

当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质15替代，但要说明理由。

16一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范17围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液18中储存和处理全过程中的稳定性。

19有时可能需要测定多个分析物。

这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一20个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。

在这些情况下，验证和21分析的原则适用于所有涉及的分析物。

22对照标准物质23在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质24中。

此外，色谱方法通常使用适当的内标。

25应该从可追溯的来源获得对照标准物质。

应该科学论证对照标准物质的适用26性。

分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。

27对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质28不产生干扰。

29当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内30标。

第四节
Hale Waihona Puke 生物样品分析方法的 基本要求
二、样品的储存
血浆和血清都必须在采血后即时分离。否则，血凝 后冰冻保存，则因冰冻时引起细胞溶解，而阻碍血浆 或血清的分出，同时因溶血而影响药物浓度变化。 冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1~2d)
冷冻—冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃) 中长期保存
尿样宜立即测定，否则应加入防腐剂或低温冷藏。
四、简述容量分析法的特点及计算公式？
五、紫外吸收光谱有什么特征？哪些特征和常数可作为 鉴定药物的定性定量指标？
思考题
六、简述紫外分光光度法在药品质量标准中的应 用。 七、简述HPLC法中系统适用性试验的意义与内容。 八、HPLC法定量的分析方法哪些？各人何特点？ 九、药物分析方法的选择原则？比较几种定量分 析方法的特点并指出适用范围。 十、简述准确度与精确度的定义以及它们之间的 关系？ 十一、什么叫有效数字？如何正确运用有效数字 的运算规则来表示分析结果？
加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一 定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用
第四节
(二)
生物样品分析方法的 基本要求
缀合物的水解
尿中药物多呈缀合状态。一些含-OH，COOH，-NH3，-SH的药物可与内源性物质葡 萄糖酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸缀合物。
1）酸水解 2）酶水解
第四节
(三) 有机破坏
生物样品分析方法的 基本要求
习
题
十六、取维生素B2 20片,精密称得重量为 1.6011g，研细，精密称取片粉0.1518g， 置于１000ml量瓶中，溶解．于444nm波 长处测得吸收度为0.312,按C17H20N4O6的 吸光系数为323计算。求维生素Ｂ２的标 示百分含量（标示量５mg/ 片）．(101.9%)。

一、验证目标和范围生物样品定量分析方法的验证目标是评估方法的适用性、准确性、精密度、灵敏度、线性范围、选择性、稳定性和测定限等指标。

验证的范围应包括常规样品、稳定样品和特殊样品等方面。

二、验证计划和报告验证计划应包括验证的目的、范围、方法、样品、检测设备和仪器的选择、验证标准和指标的确定、样品的制备与处理、实验设计和统计分析等内容。

验证报告应包括验证计划的执行情况，具体的验证结果和分析，以及结论和建议等内容。

三、适用性验证方法要考虑分析方法的适用性，包括样品的特性和要求、方法的灵敏度和特异性、样品制备和处理的方法、测定限和线性范围等因素。

四、准确性和精密度准确性和精密度是衡量定量分析方法的重要指标。

准确性的评估包括系统误差的测定和修正，常用方法有标准样品、对比法和加标回收法等。

精密度的评估要考虑到实验操作的稳定性和方法的重复性等因素。

五、选择性和特异性选择性和特异性是评估定量分析方法对目标物质的识别和测定能力的指标。

选择性的评估要考虑方法的干扰物质的影响和实际样品的复杂性。

特异性的评估要考虑到方法对其他物质的干扰以及交叉反应的影响。

六、线性范围和灵敏度线性范围是评估定量分析方法测定结果与目标物质浓度之间的关系的指标。

灵敏度是评估定量分析方法对目标物质低浓度范围内变化的敏感性的指标。

线性范围的评估要包括线性相关系数、回归方程和相关系数的确定。

灵敏度的评估要考虑到检测限和测定限等因素。

七、稳定性稳定性是评估定量分析方法在时间、温度、湿度、光照等条件下的稳定性和耐受性的指标。

稳定性的评估要包括样品的稳定性、试剂的稳定性和仪器的稳定性等方面。

八、测定限测定限是评估定量分析方法可以测定的最低浓度的指标。

测定限的评估要考虑方法的灵敏度和噪声的干扰等因素。

综上所述，中国药典2024年版生物样品定量分析方法验证指导原则（草案）主要涵盖了验证目标和范围、验证计划和报告、适用性、准确性和精密度、选择性和特异性、线性范围和灵敏度、稳定性和测定限等方面的内容。

生物样品的质量控制和标准化方法的研究随着生物技术的发展，越来越多的生物样品被用于科研和临床诊疗。

但是，在进行分析和检测之前，必须进行质量控制和标准化，以确保分析结果的准确性和可重复性。

本文将讨论生物样品的质量控制和标准化方法的研究。

一、质量控制生物样品的质量控制是指在采集、保存、加工和运输样品的过程中，通过采取相应的措施，保证样品的质量符合要求。

生物样品的常见质量问题包括样品污染、溶液浓度误差、pH值不稳定、样品保存不良、样品含量不足等。

1.采集样品时：（1）选择合适的采集容器：不同的生物样品对采集容器的要求有所不同。

一般来说，应选择无毒、无细菌和无菌的容器，并且采用适当的标识方式。

（2）采集前检查：在采集样品之前，必须先检查容器是否损坏或污染，并且卫生手段是否足够。

（3）采集时注意体积和采集方法：不同的生物样品对采集方法的要求也有所不同，必须根据实际情况来选择采集体积和采集方法。

2.样品保存时：（1）温度控制：不同的生物样品对保存温度的要求也有所不同。

应根据生物样品的特性，选择合适的保存温度。

（2）防止自然腐烂：应选用适当的防腐剂，或进行冷冻保藏，以防止生物样品的自然腐烂。

（3）样品分类保存：不同的生物样品需要进行不同的分类保存，以避免相互污染或混淆。

二、标准化方法生物样品的标准化是指通过外部标准物质来比对、校正和规定生物样品的性质和含量，以保证分析和检测结果的准确性和可比性。

生物样品的标准化方法包括内标法、外标法和加标法等。

1.内标法：内标法是将具有明确结构和特定质量的物质加入生物样品中，作为参照物来校正分析结果。

通常使用的内标物质包括同位素标记物质、荧光标记物质等。

2.外标法：外标法是通过将已知浓度的标准物质加入生物样品中，比较加标前和加标后分析结果之间的差异，来校正生物样品的分析结果。

3.加标法：加标法是将已知浓度的物质直接加入生物样品中，通过比较加标前和加标后分析结果之间的差异，来测定生物样品中该物质的含量。

9012生物样品定量分析方法验证指导原则生物样品定量分析方法验证是确保所采用的分析方法能够准确、可靠地定量生物样品中目标分析物的含量的过程。

验证验证是科学研究中非常重要的步骤，能够确保分析方法的可靠性和有效性。

本文将就生物样品定量分析方法验证的指导原则进行详细介绍。

一、准备工作：1.要明确分析方法的目的和要求，明确分析的目标物质、相关物质和可能影响分析结果的有害物质。

2.正确选择参考标准物质，确保其纯度、稳定性和可获得性。

二、验证方案的制定：1.根据样品的特点和目标物质的性质，制定验证方案。

验证方案应包括验证对象（样品类型、目标物质），验证方法（样品前处理、分析流程），验证指标（准确度、精密度、线性等）等内容。

2.确定验证方案的验证参数，包括样品容量、配制方案、浓度范围等。

三、验证准确度：1.准确度是指分析结果与真实值的接近程度。

验证准确度可以使用加标回收率和对照样品法进行验证。

2.加标回收率验证是在不同浓度水平下，加入一定量的目标物质，并对其进行分析，计算加标回收率。

3.对照样品法是用已知浓度的标准物质进行测定，计算其测定值与已知浓度之间的偏差。

四、验证精密度：1.精密度是指同一样品在同一实验室下，通过多次测定得到的结果的一致性。

验证精密度可以使用重复测定法进行验证。

2.重复测定法是在相同条件下，对同一样品进行多次独立测定，计算测定结果的方差或相对标准偏差。

五、验证线性范围：1.线性范围是指分析方法能够在一定范围内随着目标物质浓度的变化而呈现线性关系。

验证线性范围可以使用系列标准品浓度进行测定，绘制标准曲线。

2.根据标准曲线，分析样品中目标物质的浓度，在线性范围内，测定值与实际浓度之间的误差应在一定范围内。

六、其他验证指标：除了上述的准确度、精密度和线性范围，根据实际需要，还可以对选择性、稳定性、重复性、指标回收率等指标进行验证。

七、结果分析和报告：1.对验证结果进行评价和分析，判断分析方法是否满足要求。

常用的烷基化试剂：碘庚烷、 叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺 （TMAH）等； 常用的酰化试剂：乙酸酐、丙 酸酐等； 硅烷化试剂：三甲基氯硅烷 （咖CS）、双-三甲基硅烷乙酰胺 （BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰 胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑 （IMTS）等。
具有光学异构体药物的分离 也可采用不对称试剂，使其生成 非对映异构体衍生物，然后用GC 法或HPLC法进行分析测定。常用 的不对称试剂有：（S）-N-三氟 乙酰脯氨酰氯、（S）-N-五氟乙 酰脯氨酰氯等。
1.取样： 供测定的血样应能代表整个血药 浓度，因而应待药物在血液中分布 均匀后取样。 动物实验时，可直接从动脉或 心脏取血。 对于病人，通常采取静脉血， 有时根据血药浓度和分析方法灵敏
度。也可用毛细管采血。
2.制备： 血浆的制备 将采取的血液置 含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等） 的试管中，混合后，离心，分离血 细胞，上清液即为血浆。
（三）尿液 尿药测定主要用于药物剂量回收研 究、尿清除率、生物利用度的研究。 体内药物清除主要是通过尿液排出， 药物可以原型（母体药物）或代谢物及 其缀合物（conjugates）等形式排出。 尿液主要成分是水、含氮化合物 （其中大部分是尿素）及盐类。
尿液中药物浓度较高，收集量
可以很大，也方便，但尿液浓度通
对于遇酸及受热不稳定的药物，
可以用酶水解法。常用葡萄糖醛酸
苷酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸苷酶
一硫酸酯ห้องสมุดไป่ตู้的混合酶。
（三）分离、纯化与浓集 1.液～液提取法（liquidliquid extraction; LLE)多数药物 是亲脂性的，在适当的有机溶剂中 的溶解度大于在水相中的溶解度， 而血样或尿样中含有的大多数内源 性杂质是强极性的水溶性物质。因 而用有机溶剂提取一次即可除去大 部分杂质。

生物样品分析方法确证的SOP1.专属性：应着重考察药物的代谢物、内源性物质和同时服用药物的干扰。

取6个个体空白样品，采用拟定的方法测定，所得结果与接近于定量限的被测物浓度的纯溶剂溶液所得的结果进行比较。

在药物、代谢物、内标物的保留时间处不应有大的干扰，任何有大干扰的样品应舍去，如果大于10%的空白样品有干扰，应另取一组空白样品重试，如果仍有大于10%的空白样品有干扰，则应改变拟定方法。

2.质控样品（QC样品）：系将已知量得待测药物加入到生物介质中配制的样品，用于质量控制。

3.线性范围：标准曲线由5 ～ 8个系列浓度标准溶液组成，包括LOQ，线性程度用加权最小二乘法处理，相关系数r不应低于0.99，同时必须符合一定的精密度和准确度。

线性范围浓度上限为实际样品最高浓度的120%，下限为实际样品最低浓度的80%。

要求LOQ偏离标准浓度（RSD）应小于等于20%，其他各点应小于等于15%。

截距与C max响应值之比应≤5.0%。

4.准确度：测得的样品浓度与真实浓度的接近程度，常用回收率表示。

a．绝对回收率（萃取回收率、提取回收率）萃取回收率(%)＝A测/A真×100%A测:取一定量的被测物标准品,加到空白血浆样品中,按方法处理,使最后溶液中药物标准品浓度为1μg·mL-1 ,测定峰面积,记为A测。

A真:取1μg·mL-1的药物标准品的纯溶剂溶液直接进样,测定峰面积,记为A。

真考察高、中、低三个浓度，低浓度选在定量限（LOQ）附近，高浓度在标准曲线上限的附近（上限的80%），中间选一个浓度。

每个浓度各3份样品，加入量一般在10-6～10-9g, 绝对回收率50%～80%。

（注：内标法中，药物与内标各自用外标法测得的绝对回收率应相近，两者相差应小于10%。

）b．方法回收率建立标准曲线后，取高、中、低药物标准品溶液加到空白血浆中，每个浓度至少平行测定5份，按标准曲线制备法同法制备，将所得值代入回归方程，求得测定值C测。

二、生物分析方法验证
为了验证批内准确度，应 取一个分析批的定量下限及低、中、高浓度质控样品，每个浓 度至少用5个样品 浓度水平覆盖标准曲线范围：定量下限，在不高于定量下限浓度3倍的低浓度质控样品， 标准曲线范围中部附近的中浓度质控样品，以及标准曲线范围上限约75 %处的高浓度质控 样品
准确度均值一般应在质控样品标示值的±15%之内，定量下限准确度应在标示值的±20%范围 内
除正常基质外，还应关 注其他样品的基质效应， 例如溶血的或髙血脂的 血浆样品等
二、生物分析方法验证
9.稳定性
必须在分析方法的每一步骤确保稳定性，用于检查稳定性的条件，例如样品基质、抗凝剂 、容器材料、储存和分析条件，都应该与实际试验样品的条件相似 用文献报道的数据证明稳定性是不够的 采用低和髙浓度质控样品(空白基质加人分析物至定量下限浓度3倍以内以及接近定量上限 )，在预处理后以及在所评价的条件储存后立即分析 由新鲜制备的校正标样获得标准曲线，根据标准曲线分析质控样品，将测得浓度与标示浓 度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15%范围内 应通过适当稀释，考虑到检测器的线性和测定范围，检验储备液和工作溶液的稳定性
中国药典（2020版）9012 生物样品定量分析方法验
证指导原则
中国药典（2020版）9012生物样品定量分析方法验证指导原则
二、生物分析方法验证 三、试验样品分析
目录
中国药典（2020版）9012生物样品定量分析方法验证指导原则
9012生物样品定量分析方法验证指导原则 —、范围 准确测定生物基质(如全血、血清、血浆、尿)中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重 要 这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验 的结果做出关键性决定 因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果 本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本 要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证 本指导原则二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法 生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求

专属性专属性系指在其他成分（如杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能够正确鉴定、检出被分析物质的特性。

通常，鉴别、杂质检查、含量测定方法中均应考察其专属性。

如采用的方法不够专属，应采用多个方法予以补充一、精密度精密度(precision)系指用该法测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度。

它们越接近就越精密。

在药物分析中，常用标准差(S)或相对标准差(RSD)表示：1.标准(偏)差(standard deviation，SD或S)2.相对标准(偏)差(rdative standard deviation，RSD)，也称变异系数(coefficient of variation，CV)。

生物样品分析时，常用RSD表示精密度，并可细分为批内(或日内)精密度及批间(或日间)精密度。

批内精密度(within-run precision)：是同一次测定的精密度。

通常采用高、中、低三种浓度的同一样品各7～10份，每种浓度的样品按所拟定的分析方法操作，一次开机后，一一测定。

计算每种浓度样品的SD值及RSD值。

批内精密度也可视为日内精密度(with-in-day precision)。

所得RSD应争取达到5%以内[17-181，但不能超过10%。

批间精密度(between-run precision)：是不同次测定的精密度。

通常采用高、中、低三种浓度的同一样品，每种浓度配制7～10份，置冰箱冷冻。

自配制样品之日开始，按所拟定的分析方法操作，每天取出一份测定，计算每种浓度样品的SD值及RSD值。

批间精密度也可视为日间精密度(day to day precision)。

所得RSD应控制在15%以内。

二、准确度准确度(Accuracy)是指测得结果与真实值接近的程度，表示分析方法测量的正确性。

由于“其实值"无法准确知道，因此，通常采用回收率试验来裴示。

生物药物分析中，常用标准添加法来计算回收率，即取已准确测定药物含量P(present)的真实样品(如人血浆样品等)，再加入药物标准品已知量A(added)，混合物作为测定液，其测定值为M(measured)。

2024药典生物样品定量分析方法验证指导原则2024药典生物样品定量分析方法验证指导原则是指对于药物及其原料药以及相关的生物样品进行定量分析方法验证的准则和指导性原则。

这些原则是为了确保药物和生物样品的准确性、可靠性和重复性，从而保证药物的质量和安全性。

以下是关于2024药典生物样品定量分析方法验证指导原则的详细介绍。

首先，2024药典生物样品定量分析方法验证指导原则要求验证人员具有相应的专业知识和经验，能够进行准确、可靠和重复的测试。

验证人员应具备合适的教育背景、培训经历和实践经验，能够正确操作和解释测试结果。

其次，验证步骤应按照规定的程序和要求进行。

验证步骤包括方法准确性验证、方法精密度验证、方法线性范围验证、方法选择度验证和方法稳定性验证等。

这些步骤能够评估方法的准确性、精密度、线性范围、选择度和稳定性等重要指标。

方法准确性验证是评估方法测量结果与真实值之间差异的步骤。

验证人员可以通过比较方法测得的样品浓度与已知浓度的样品进行对照，以评估方法的准确性。

方法精密度验证是评估方法测量结果的一致性和重复性的步骤。

验证人员应根据规定的程序使用不同的检测设备、分析仪器和操作员对同一样品进行多次测试，以评估方法的精密度。

方法线性范围验证是评估方法在一定浓度范围内能否提供可靠测量结果的步骤。

验证人员应根据规定的程序和要求，测试一系列浓度不同的样品，以评估方法的线性范围。

方法选择度验证是评估方法在存在多种干扰物或类似物质的情况下是否准确测量目标物质的步骤。

验证人员可以通过加入干扰物或其他相关物质来评估方法的选择度。

方法稳定性验证是评估方法在不同条件下是否产生相似结果的步骤。

验证人员应根据规定的程序和要求，测试样品在不同条件下的稳定性，以评估方法的稳定性。

最后，验证人员应根据验证结果制定合适的验证报告，包括验证方案、方法验证结果、数据分析和结论等内容。

验证报告应清晰、准确地描述验证过程和结果，并提供可验证性的依据。

⽣物利⽤度是指剂型中的药物被吸进⼊⾎液的速率和程度。

⽣物等效性是指⼀种药物的不同制剂在相同的试验条件下，给以相同的剂量，反映其吸收速率和程度的主要动⼒学参数没有明显的统计学差异。

⼝服或其他⾮脉管内给药的制剂，其活性成分的吸收受多种因素的影响，包括制剂⼯艺、药物粒径、晶型或多晶型，处⽅中的赋形剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、包⾐材料、溶剂、助悬剂等。

⽣物利⽤度是保证药品内在质量的重要指标，⽽⽣物等效性则是保证含同⼀药物的不同制剂质量⼀致性的主要依据。

⽣物利⽤度与⽣物等效性概念虽不完全相同，但试验⽅法基本⼀致。

为了控制药品质量，保证药品的有效性和安全性，特制订本指导原则。

何种药物制剂需要进⾏⽣物等效性或⽣物利⽤度试验，可根据有关部门颁布的法规要求进⾏。

进⾏药物制剂⼈体⽣物利⽤度和⽣物等效性试验的临床实验室和分析实验室，应提供机构名称以及医学、科学或分析负责⼈的姓名、职称和简历。

⼀、⽣物样品分析⽅法的基本要求 ⽣物样品中药物及其代谢产物定量分析⽅法的专属性和灵敏度，是⽣物利⽤度和⽣物等效性试验成功的关键。

⾸选⾊谱法，如HPLC、GC以及GC-MS、LC-MS、LC-MS-MS联⽤技术，⼀般应采⽤内标法定量。

必要时也可采⽤⽣物学⽅法或⽣物化学⽅法。

由于⽣物样品取样量少、药物浓度低、内源性物质（如⽆机盐、脂质、蛋⽩质、代谢物）及个体差异等多种因素影响⽣物样品测定，所以必须根据待测物的结构、⽣物介质和预期的浓度范围，建⽴适宜的⽣物样品分析⽅法，并对⽅法进⾏验证。

1．专属性 必须证明所测定的物质是原形药物或特定的活性代谢物，内源性物质和相应的代谢物不得⼲扰样品的测定。

对于⾊谱法⾄少要提供空⽩⽣物样品⾊谱图、空⽩⽣物样品外加对照物质⾊谱图（注明浓度）及⽤药后的⽣物样品⾊谱图。

对于复⽅制剂应特别加强专属性研究，以排除可能的⼲扰。

2．标准曲线与线性范围 根据所测定物质的浓度与响应的相关性，⽤回归分析⽅法获得标准曲线。