PCR-RFLP基因分型方法 PPT课件

影响因素
1. 限制性内切酶
一般双酶切 由一个高频内切酶和一个低频内切酶组成 一般高（G+C）摩尔分数的基因组选择识别位 点富含（G+C）的内切酶组合；低（G+C）摩尔 分数的基因组选择识别位点富含AT的内切酶组合 酶切反应对模板质量要求很高 酶切时间1 ～3h DNA含量一般0.5μg左右，DNA含量不应太高
RFLP操作流程图
基 本 方 法
聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术
PCR-RFLP
结合PCR技术与RFLP技术的优点 其基本原理是对目的基因片段 PCR 扩增后，利用 多种限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，不同基 因序列，不同限制性内切酶酶切扩增产物，在电泳 后可产生不同电泳图谱，通过对电泳图谱的分析， 得出基因多态性结果。
G AATCC CCTAA G
T TAA AAT T
ACA G AATCCA CCTAA GT
Step 4: Selective PCR
AT TAA TAAT T CAT
G AATCCACA CCTAA GTGT
GTAT TAA CATAAT T
基因组DNA提取
基本程序
酶切与接头连接
PCR扩增
电泳分析
5. 对显示出来的带谱进行分析。
RFLP与PCR-RFLP的应用
Company name
扩增片段长度多态性分析技术
Amplified fragment length polymorphism，AFLP
结合限制性酶切消化的可靠性和严格的 PCR退火条件，有高度特异性 既 克服 了 RFLP 技术中 Southern 杂交 繁琐 和耗时 的缺点，又解决了 RAPD等技术中 非特异PCR扩增引起的可信度问题

引物二聚体
总结词
引物二聚体是指引物之间形成的二聚体，影响PCR扩增效率。
详细描述
引物二聚体的形成可能由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度过低等原因 导致。为解决这一问题，可以优化引物设计，降低引物浓度，适当提高退火温度 等措施。
05
PCR 实验设计
选择合适的引物
引物长度
根据基因序列选择合适的引物长度， 通常为18-30bp。
设置PCR 仪温度循环
设置变性温度
将PCR仪温度设置为95℃，进 行变性处理，使DNA双链解开
成单链。
设置退火温度
根据引物特异性，设置适当的 退火温度，使引物与单链DNA 结合。
设置延伸温度
设置适当的延伸温度，使DNA 聚合酶从引物起始合成DNA链 。
设置循环数
根据实验目的和DNA片段大小 ，设置适当的循环数，确保目
PCR PPT课件教程
目录
• PCR 简介 • PCR 原理 • PCR 实验步骤 • PCR 常见问题与解决方案 • PCR 实验设计 • PCR 数据分析
01
PCR 简介
PCR 定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA的分子生物学技术，通过DNA聚合酶的作用，以一对寡核苷酸引 物定向导引下完成特定DNA的片段扩增。
在PCR中，DNA的复制是通过特定的引物和聚合酶，在特定的温度和循环次数下完 成的。
引物与模板DNA结合后，聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链。
聚合酶与引物
聚合酶是生物体内负责DNA复 制的酶，具有耐高温的特性。
在PCR中，常用的聚合酶有Taq 酶和Tfl酶等。
引物是人工合成的短片段DNA ，能够与目标DNA特异性结合 ，为聚合酶提供起始点。

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引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
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引物设计的基本原则
3、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成
正相关。
过短：扩增特异性下降 过长：引物自身形成二级结构，以及引物二 聚体。
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引物设计的基本原则
4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度 产生影响。
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退火温度与时间取决于引物的 碱基组成、长度和浓度。退火温度 可以通过计算推断，通常采用温度 梯度PCR的方法进行摸索。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M
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低温退火
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中温延伸
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• 理论：2n递增（n为循环次数）， 如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。

三、实验目的
通过此实验操作， 通过此实验操作，掌握琼脂糖凝胶电 泳技术、 泳技术、DNA的分离鉴定及基因型判 的分离鉴定及基因型判 定方法。 定方法。
实验材料、 四、实验材料、仪器和试剂
材料： 材料：DNA样品 样品 仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、 仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、 紫外透射仪、 头 紫外透射仪、Tip头 试剂
PCR反应体系 反应体系
DNA模板 模板 dNTP Taq DNA聚合酶 聚合酶 引物 Mg2+ 缓冲液
PCR反应程序 反应程序
预变性 94℃ 3~5min ℃ 35循环： 循环： 循环 30s~1min 变性 94 ℃ 退火 50~65 ℃ 30~60s 1~2min 延伸 72 ℃ 5~10min 后延伸 72 ℃
动物遗传学实验
鸡基因组的PCR-RFLP分析 实验七 鸡基因组的 分析
一、实验方法
1、鸡基因组DNA的提取 、鸡基因组 的提取 2、目的基因的PCR扩增 、目的基因的 扩增 3、内切酶消化PCR产物 、内切酶消化 产物 4、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型） 、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型）
鸡DNA的获取 的获取
PCR产物电泳检测结果 产物电泳检测结果
内切酶消化PCR产物 产物 内切酶消化
PCR产物 缓冲液 内切酶 产物+缓冲液 产物 缓冲液+内切酶
5‘-TCATGA-3’ 3’-AGTACT-5’
电泳检测基因（ ） 电泳检测基因（1）
A B
电泳图谱
AA BB AB
电泳检测基因（ ） 电泳检测基因（2）
六、结果分析
1. 将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统的平脑中观察图像； 开通紫外光 3.关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像； 关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像； 关上紫外光电源 4.根据图像结果判定不同个体基因型。 根据图像结果判定不同个体基因型。 根据图像结果判定不同个体基因型

步骤
• • • • • ( 1) 选择目标序列 ( 2) 设计特异引物 ( 3) PCR扩增 ( 4) 酶切 ( 5) 琼脂糖电泳分离与鉴定
特点
• (1) 引物与限制性内切酶组合非常多, 增加了揭示多态性的 机会,而且操作简便,可用琼脂糖电泳分析; • (2) 在真核生物中,CAPS标记呈共显性, 即可区分纯合基因 型和杂合基因型; • (3) 所需DNA的量很少, 且对DNA的浓度要求不严格; • (4) 使用的引物较长, 扩增的结果比较稳定且避免了RFLP 分析中膜转印这一步骤, 又能保持RFLP分析的精确度; • (5) 操作简便、快捷和自动化程度高。
PCR-RFLP
分子标记
• 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的 遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接反映。 • 某种意义上分子标记也指DNA分子标记, 就是指能反映生 物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。它能 够直接反映基因组DNA间的差异。
原理
• PCR-RFLP是酶切扩增多态性序列标记技术, 又称为 CAPS, 主要是对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切分 析。它是根据EST或已发表的基因序列等设计特异引物, 将特异PCR与限制性酶切相结合而检测多态性的一种技术。 • 基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异 性的PCR引物( 19~27bp) , 然后用这些引物扩增该位点上 的某一DNA片段,接着用专一性的限制性内切酶切割所得 扩增产物,凝胶电泳分离酶切片SCP的比较
应用
• 植物基因分型、定位、克隆、分子鉴定和动物的遗传多样 性、品种鉴定以及微生物的连锁图谱和品种鉴定等方面。
小概念
• DNA的多态性(不同个体间基因组的核苷酸序列存在的差 异性)可影响限制酶的切割位点，造成限制性片段长度多 态性，即用同一种限制酶消化不同个体的DNA时，会得到 长度各不相同的限制性片段类型。不同个体基因组在同一 段DNA是否有同样的酶切位点，决定了酶切后是否产生同 样大小的片段。当碱基组成的变化改变了限制酶的识别位 点时，就会得到不同的限制性片段类型，这样的位点称为 多态性位点。

加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
.
*
cDNA序列的克隆
.
*
（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
.
*
EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
.
*
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
.
*

• 阳性对照（弱阳性对照） FAM通道Ct值≤32，VIC通道Ct值<38， 但可能会由于不同仪器的不同阈值设 置而发生波动。
验证PCR有效性
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Hale Waihona Puke 19样品的外控和内控
• 待测样品的外控（8号管FAM信号曲线）应有FAM信号 以友芝友试剂盒为例：FAM通道23≤Ct值≤30；
Ct<23：DNA加 入过量
优点
缺点
灵敏度高（0.1-1%） 操作简便 周期短 不产生PCR产物污染 适用样本类型多（如FFPE） 精确突变类型
方法建立需时较长 仅能检测已知突变
适用于临床检验
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测序法与等位基因特异性PCR法比较
敏感度 FFPE标本成功率
商用试剂盒 流程与速度 数据分析要求
试剂成本 仪器成本
Sanger测序法 10-20% 低 无 1-2天 高 低 高
System-PCR，ARMS-PCR）
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PCR扩增过程中，引物从 3’末端开始延伸，要求3’端
碱基与模板完全配对
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等位基因特异性PCR基本原理
Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3' end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR).

01 2)变异更稳定。其表现不受环境条件的影响, 其他变异均是从表型或基因作用产物来研究 遗传和变异的 , 而 RFLP 则是直接研究基因的 构成
02
03
比生化标记更丰富,区分能力更强。
其标记为共显性 , 能区分纯合显性和杂 合显性,而且非等位基因间无互作。
04
2 基本实验程序和主要影响因素
01
DNA的提 取
14cm左右停止。
基本实验程序
04
转移
DNA支持膜现在均采用带正电荷的尼龙膜。将经酸碱
处理的琼脂糖凝胶放在玻璃板上 , 上面铺上尼龙膜,
其上压约10cm 的吸水纸,用磷酸转移液, 转移24h后, 取出尼龙膜,在94℃烘烤2h以固定DNA。
放射自显影 标记探针,每泳道探针DNA用量为5ng。分子杂交,探针与尼龙膜 保温在65℃ ,缓慢转动16～18h。洗膜压片,取出杂交膜,用SSC、SDS洗去 末杂交上的探针, 直到杂交膜上的放射性到100～200counts /min为止。 用保鲜膜将尼龙膜包好, 压上X光片, 在- 70℃下放射自显影5～ 15d 。洗 片、显影结束后取出,定影、凉干保存。
2 RFLP用于作物育种研究

一副高度饱和的 RFLP 连锁图 , 为基因选择、回交育种、预 测杂种优势以及基因克隆等方面提供了诸多方便。利用与 目标基因连锁的 RFLP 标记进行间接选择 , 就能克服传统育 种方法进行基因选择和回交育种中所遇到的种种困难和麻 烦。因为知道目的基因与 RFLP 标记连锁 , 这使我们相信在 选择 RFLP 的同时 , 也选择了目的基因 , 因为使二者分开的 重组机率太小。另一方面 , 连锁的 RFLP 标记能在植株苗期 进行测定记录 , 因为只需提取少量 DNA, 故不必毁坏整个植 株。不带目的基因的植株能在早期被剔除 , 节省了空间和 费用。

新一代血小板抗体测定？
致谢
1、 Justus Liebig University 和临床免疫输注医学研究所 （Giessen, 德国） Ines Socher ， Cornelia Andrei-Selmer ，Tamam Bakchoul，Ulrich Sachs，Hartmut Kroll 2、剑桥大学和国家健康服务血液移植（英国）PrachiStafford， Cedric Ghevaert ，Willem Ouwehand3、血液研究所 ，（密尔沃， 基威斯康星， 美国） Peter Newman，Brian Boylan
人类血小板抗体的分析
动物模型？ 抗体介导的血小板清除和相关 抑制因子的测定
以NOD/SCID 鼠作为
模型进行人类血小板抗体的研究
在NOD/SCID 鼠体内循环期间人类血小板存活的动力学
FNAIT
的病理机制
问题
我们如何改进同种免疫性血小板减少症的诊断呢？
以稳定的细胞系为来源的DNA产品和血小板同种抗原
基因分型，来自于人类血小板同种抗原的表型的献血者的Ｂ淋巴细胞系抗体鉴定，转染的CHO细胞稳定表达的人类血小板同种抗原
以Ｂ淋巴细胞系作为来源获得标准DNA
人类血小板同种抗原基因分型的
Ｂ淋巴细胞系
ISTH/ISBT血小板基因型鉴定实验室
抗HPA-1a 水平和NAIT严重程度
之间的关系
9、静夜四无邻，荒居旧业贫。。10、雨中黄叶树，灯下白头人。。11、以我独沈久，愧君相见频。。12、故人江海别，几度隔山川。。13、乍见翻疑梦，相悲各问年。。14、他乡生白发，旧国见青山。。15、比不了得就不比，得不到的就不要。。。16、行动出成果，工作出财富。。17、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。。9、没有失败，只有暂时停止成功！。10、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。。11、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。。12、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。。13、不知香积寺，数里入云峰。。14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。15、楚塞三湘接，荆门九派通。。。16、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。。17、空山新雨后，天气晚来秋。。9、杨柳散和风，青山澹吾虑。。10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。11、越是没有本领的就越加自命不凡。12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。。16、业余生活要有意义，不要越轨。17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。

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PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
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PCR扩增体系
➢模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可
以是细菌、组织样品等。
➢引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定
1、避免重复碱基，尤其是G。
2、引物退火温度在58-60℃之间。
3、G+C为30-80%。
4、3’端最后5个碱基内不能有多于2个
的G或C。
5、引物的产物大小一般在80-250bp之
间；80-150 bp最为合适（可以延长至
300 bp）。 2021/3/26
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Real-Time PCR引物设计原则
2021/3/26
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引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。
引物3’端错配时，不同碱基引发效率存 在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即 使在错配的情况下，也能有引发链的合成， 而当末位链为T时，错配的引发效率大大降 低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所 以3’端最好选择T。
引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
2021/3/26
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引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
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引物设计的基本原则