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第二章预处理及固液分离技术

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发酵液的预处理与固液分离

发酵液的预处理与固液分离
发酵液中杂质很多，其中对提炼影响最 大的是高价无机离子（ Ca2+、Mg2+、 Fe3+ ）和杂蛋白质等。
二、 发酵液的预处理
采用理化方法设法增大悬浮液中固体粒 子的大小、或降低粘度，以利于过滤。
去除会影响后续提取的高价无机离子和 杂蛋白质等。
预处理的方法
1，高价无机离子的去除方法 2，杂蛋白质的去除 3，发酵液的凝聚和絮凝
3 发酵液的凝聚和絮凝
凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋 白质等胶体粒子的分散状态，使聚集起来，增 大体积，以便于过滤，常用于菌体细小而且粘 度大的发酵液的预处理中。
絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速 度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质和固 体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高了 滤液质量
酶解作用
如发酵液中有不溶解的多糖存在则最好 用酶将它转化为单糖，以提高过滤速度。 例如万古霉素用淀粉作培养基，加入淀 粉酶后，能使过滤速度加快。
3、固—液分离设备的选择
不同性状约发酵液应选择不同的固—液 分离设备。常用于发酵液的分离设备有：
✓ 板框压滤机 ✓ 鼓式真空过滤机 ✓ 离心沉降分离机
如新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成的磷 酸钙可作为填充-凝固剂。
一方面作为助滤剂，另一方面还可使某些蛋白质凝固。 又如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成的磷
酸钙沉淀，能使悬浮物凝固。多余的磷酸根离子，还 能除去钙、镁离子。并且在发酵液中不会引入其它阳 离子而影环环丝氨酸的离子交换吸附。正确选择反应 剂和反应条件，能使过滤速度提高3~10倍。
2 杂蛋白质的去除方法
热变性 沉淀 大幅度改变pH 加有机溶剂
杂蛋白质的去除方法
热变性 变性蛋白质溶解度较小。最常用的使蛋

第二章 生物材料预处理技术

第二章 生物材料预处理技术
杂质多糖的去除方法：
• 酶解法
杂质DNA的去除法： • 核酸酶水解 • 超声波破碎 • 离子交换层析或亲和层析
12
应用实例：发酵液的预处理
一、降低发酵液黏度—加热法
• 将发酵液温度升高到80℃，保温即可将其黏度降 低数十甚至数百倍 二、凝聚沉降分离悬浮物—凝聚剂法 如明矾凝聚法（测产品澄清液浊度）
–双电层（以及带同种电荷）
（图见下页）
–水化层
• 预处理应破坏料液的胶体的稳定性。
3
正电荷分布
负电荷分布
图1 胶体双电层结构
4
一、 凝聚和絮凝技术
（一）凝聚技术
凝聚技术原理：中性盐作用下，中和胶体粒子表面电 荷和脱去其水化层而使胶体粒子沉淀。 中和电荷：一般，菌体或细胞带负电荷，其周围吸附 正电荷，加入中性盐后，阳离子会中和负电荷，减少了 胶体间斥力，胶体粒子由于热运动碰撞而聚集沉淀。 去水化：中性盐离子的水化作用而破坏胶体粒子的水 化层，使胶体粒子能相互碰撞而凝聚沉淀。
5
常用的凝聚剂 金属离子凝聚能力比较
Al 3+ >Fe 3+ >H + > Ca 2+ > Mg 2+ > K + > Na + > Li +
常用的凝聚剂中性盐
Al2(SO4)3·18H2O（明矾）明矾净水原理
AlCl3.6H2O、FeCl较小，分离仍较困难。
水溶性 • 絮凝剂的用量 • 料液的pH值 • 搅拌速度和时间：变速搅拌
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常用的絮凝剂 人工合成高分子聚合物 聚丙烯酰胺类：用量少（10-6级）、絮凝体粗大、效 果好，速度快，种类多，适用范围广。 聚乙烯亚胺衍生物类。 聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。 无机高分子聚合物絮凝剂：聚合铜盐，聚合铁盐。 天然有机高分子絮凝剂 壳聚糖，葡聚糖，明胶， 海藻酸钠等 微生物絮凝剂 主要为糖蛋白、黏多糖、纤维素及核酸等高分子物质。 安全，无毒，不污染环境。

生物分离工程第二章 预处理和固液分离

生物分离工程第二章 预处理和固液分离

b 园盘真空过滤器
与转鼓真空过滤器相比．圆盘直径大．更易实现大型化。 其最大过滤面积可达400m2。
圆盘盘式真空过滤器有两种变种．即水平圆盘过滤器及水平回 转翻盘式过滤器，如图所示，其中前者适用于对滤饼洗涤效果 要求较高的场合、而后者过滤时圆盘向上，卸料时则翻转向下， 借重力或压缩空气卸去滤饼，因此适合于过滤密度大、浓度高 的粗颗粒悬浮液。
表滤饼和介质。
cake 滤饼
传统的过滤
Conventional filtration
滤饼的厚度(lc)可用下式表示：
通常给滤饼的比阻定义为:α=Rc/ρw
由于过滤介质产生的流动阻力可以使其转变成 为当量滤饼厚度lF ，设VF是该当量滤饼厚度的 滤液当量体积，则滤液的流速可表示为：
U A dV
2.4.1 过滤的理论基础
过滤操作理论分析的起点是达西(Darcy)定律
(2.1)
式中U=(1/A)×(dV/dt)为流体的速度，V为在时间t内 排出液体的体积，A为床层的横断面积，Δp为通过厚 度为l 的床层时液体的压力降,K为比例常数，与流体 和床层的性质有关，又称为达西定律的渗透度。
2.5.1 过滤基础理论
c 水平带式真空过滤器
水平带式真空过滤器的优点是处理量大(滤饼厚度可200mm)， 并可根据对物质的洗净要求进行滤饼的洗涤，洗涤效果良好， 无需搅动装置．操作也灵活，其缺点为：占地面积大，有效过 滤面积小，投资较高。
(2) 压滤器
根据结构型式可将压滤机分为：板框式压滤器、加压叶滤器、 带式压滤机和气压罐式连续压滤器等，其中前面两种属于间歇 型，后面两种属于连续型。
絮凝剂按官能团分为阴离子、阳离子和非 离子三大类型，熟知的聚丙烯酰胺絮凝剂， 经不同改性可以成为上述三种类型之一。 除此以外，人工合成的高分子絮凝剂还有 非离子性的聚氧化乙烯；阴离子性的聚丙 烯酸钠和聚苯乙烯磺酸，阳离子性的聚丙 烯酸二烷基胺乙酯和聚二烯丙基四胺盐等 等。天然和生物絮凝剂目前用得较少。

生物分离工程复习重点

生物分离工程复习重点

第二章发酵液的预处理和固液分离的方法一、名词1、凝聚：凝聚作用就是向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集（1mm左右）的现象。

2、絮凝：是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，形成粗大的絮凝团（10mm）的过程。

絮凝是一种以物理的集合为主的过程。

3、混凝：对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂通常会与无机电解质凝聚剂搭配使用。

在发酵液中首先加入无机电解质凝聚剂，使得悬浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成微粒，然后再加入絮凝剂，通过分子间引力和氢键作用产生吸附架桥形成絮凝团的过程。

这种包括凝聚和絮凝机理的过程称为混凝。

4、亲和絮凝：利用絮凝剂和细胞膜表面某种组分间具有的专一性亲和连接作用而产生吸附架桥。

如硼酸盐（四硼酸纳）可与多羟基的糖类化合物（甘露糖醇、山梨糖醇）发生专一性亲和连接作用而产生吸附架桥。

5、凝聚价：电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩尔／升）6、过滤：过滤是借助过滤介质，将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。

7、质量比阻：衡量过滤特性的主要指标是滤饼的质量比阻（r B），表示单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼结构特性有关。

8、离心技术：离心技术是借助离心机旋转所产生的离心力，对具有不同沉降系数或浮力密度的物质进行分离、浓缩和提纯的一项技术；其目的是达到固-液或液-液的分离。

9、分离因子（Z）：离心力/重力加速度(g)的比值，也称为相对离心力(RCF)。

衡量离心程度的一个参数,用于离心机的分类。

10、沉降系数：指单位离心力作用下颗粒沉降的速度。

一般用斯维德贝格单位(Svedbergs) S 表示，1S =10−13s。

11、壁效应：由于溶剂在层析容器周壁附近流动不均匀造成分离区带在边缘部分扩散和弯曲的现象。

第二章 预处理及固—液分离

第二章 预处理及固—液分离
4、过滤技术在生物技术中的应用
23、惰性助滤剂的使用
1）基本概念和使用方法
种颗粒均匀．质地坚硬．不可压缩的粉状或纤维状 的固体，能形成疏松结构。它能使滤饼疏松，减 小过滤阻力．使滤速增大，提高滤饼的刚性和孔 隙率的惰性材料。
要求：作助滤剂的物质应能较好地悬浮于料液 中，且颗粒大小合适，助滤剂中还不应含有可溶 于滤液的物质，以免污染滤液。助滤剂必须不吸 附或很少吸附生化物质。
对于好的定形的晶体，这是一种最直接的步
骤。常用来分离固体量较大的悬浮液.
在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清，并且有高的收 率。
根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。
澄清过滤：
过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，当悬浮液通过滤 层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，适合于固体 含量少于0.1g/100ml、颗粒直径在5-100um的悬浮液的过滤分离，如河水、麦 芽汁、酒类和饮料等的澄清。
2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。
• 高速珠磨法
• 设备是珠后机，瑞士WBC公司和德国西门 子机械公司均制造各种型号的珠磨机，其破碎机 下：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆 作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间 和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含 物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎 室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中， 生的热量由夹套中的冷却液带走。 存在的问题：操作参数多，一般赁经验估计 并且珠子之间的液体损失30％左右。
4.酶解法（enzymatic lysis）：
外加酶法： 根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶：溶菌酶、 纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解， 使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感，加入 少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏 感而溶解。 自溶法（autolysis）: 在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系 统将细胞破碎的方法。此过程需较长时间，常用少量防腐 剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。

第二章-发酵液预处理与固液分离

第二章-发酵液预处理与固液分离
采用絮凝和添加助滤剂等方法进行预处理后，细菌和酵母 菌细胞悬浮液亦可采用过滤方法进行固液分离。
（粒度、密度差；投资、能耗、适应性）
2.2.1 过滤
过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差 ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔 道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固 液分离的单元操作。
过滤介质filter medium : 过滤采用的多孔物质；
2.1.2.6 加入反应剂
（1）生成不溶性沉淀
加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀 ，如 CaSO4 、AlPO4 等。
产生的沉淀可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而 改善过滤性能。
如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成磷酸钙沉淀，能使 过滤速率提高3～10倍。
（3） 错流过滤（Cross-Flow Filtration ）
在分离细菌、细胞碎片等悬浮液时，由于其固体颗粒细 微，可压缩性大，所形成的滤饼阻力很大，随着过滤过 程的进行，过滤速度迅速下降。因而一般过滤不适合细 菌悬浮液的分离。
错流过滤（Cross-Flow Filtration)又称切向流过滤，是 一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮 液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将 过滤介质表面的固体（滤饼）移走。
粗制产品：如工业用酶制剂，只需考虑产品提取。 精制产品：有纯度要求，大多数生物产品属此类，其
分离回收过程一般包括预处理与固液分离、提取、精 制和成品加工四步。
精制产品分离纯化一般流程：
胞外产品：
发酵液 ↓预处理
目的产物尽量进液相 ↓固液分离
收集液相 ↓
后提取与精制
•胞内产品：
发酵液 ↓预处理
动盘(18个孔，分别与扇 形格的18个通道相连)； 定盘(三个凹槽：滤液真 空凹槽、洗水真空凹槽、 压缩空气凹槽，分别将动 盘的18个孔道分成三个通 道)； 滤浆槽。

Ch2 发酵液的预处理和固液分离方法幻灯片

Ch2 发酵液的预处理和固液分离方法幻灯片
5
6
②胶粒能保持分散状态的原因：
主要是带有相同电荷和扩散双电层结构，一旦 由于布朗(Brown)运动使粒子间距离缩小到它们的 扩散层部分重叠时，即产生电排斥作用，使两个粒 子分开，从而阻止了粒子的聚集。ζ电位越大，电 排斥作用就越强，胶粒的分散程度也越大，此外由 于胶粒表面的水化作用，形成了包括于粒子周围的 水化层，也能阻碍胶粒间的直接聚集。但是水化膜 主要是伴随胶粒带电而引起的，一旦ζ电位降低或 消除，水化层也随之减弱消失。
T(s)
5 10 20
30
V(10-6m3) 40 55 80
95
求滤比阻和过滤介质阻力Rm。
23
解：据实验数据以q对 t/q 作图，得到一条过 滤操作直线，其截矩B≈0，即过滤介质阻力 Rm=0，由此可求得直线的斜率 M=(2.8 × 103))/(10.2 ×10-3 ) =2.75×105
热敏感的生化物质不易用该法。
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六、全发酵液提取
为避开固液分离操作,从悬浮液中直接 提取生化物质是国内外学者探索的方向 第一，用膜分离技术进行全发酵液的提取 第二，用双水相萃取进行全发酵液的提取 第三，用扩张床吸附进行全发酵液的提取
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本章小结：
重点： 难点： 作业：
1、改善发酵液的过滤性能方法有哪些？ 试简述之。
9
(2)絮凝作用(flocculation)：
①概念：
指在某些高分子絮 凝剂存在下，在悬 浮粒子之间产生架 桥作用，而使粒胶 形成粗大的絮凝团 的过程，它是一种 以物理的集合为主 的过程。
10
②絮凝剂按带电状况分：
阳离子絮凝剂、阴离子絮凝剂、非离子型的絮凝剂。
凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝。
③絮凝剂按其来源分：

Chapter 2 发酵液的预处理与固液分离

Chapter 2 发酵液的预处理与固液分离


微生物或动植物细胞在合适的培养基，pＨ值，温度和通气 搅拌（或厌气）等发酵条件下进行生长和合成生物活性物质 —目标产品； 培养（发酵）液中包含了菌（细胞）体，胞内外代谢产物， 胞内的细胞物质及剩余的培养基残分等； 只有将固，液分离开，才能从澄清的滤液中采用物理、化学 的方法提取代谢产物，或从细胞出发进行破碎、碎片分离和 提取胞内产物。
ζ电位
ζ电位是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双 电层的特征，并作为研究凝聚机理的重要参数。 胶粒能保持分散状态的原因主要是带有相同电荷和扩 散双电层的结构，一旦由于布朗（Brown）运动使粒子 间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时，即产生使两 个粒子分开的斥力，从而阻止了粒子的聚集。ζ电位 越大，电排斥作用就越强，胶粒的分散程度也越大。 此外，由于胶粒表面的水化作用，形成了包围于粒子 周围的水化层，也能阻碍胶粒间的直接聚集。
发酵液的胶体性质
水合膜和双电层的存在，使蛋白质的分子与分子
之间不会相互凝聚，成为比较稳定的胶体溶液。
如果消除水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质
溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白 质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉淀。
凝聚（Coagulation）
胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质作用下，胶
无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等。 天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻
酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。
微生物絮凝剂
直接利用微生物细胞的絮凝剂，如某些细菌、
霉菌、放线菌和酵母；
利用微生物细胞提取物的絮凝剂，如酵母细胞
壁的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和N一乙酰葡 萄糖胺等成分；
ζ电位
ζ电位的基本公式为：

预处理及固液分离

预处理及固液分离

（五）发酵液中杂质的去除，使发酵液相对纯化 发酵液中杂质的去除，
高价无机离子（ A.高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）
在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。 在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。
•
杂蛋白
常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率； 常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率； 采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力； 采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力； 有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。 有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。
pH 2.8
3
pH 3.8 600 pH 4.2 400 200 0 0 6 12 Time,minutes 18
pH 4.6
The effect on filtrate volume of pH
• 案例 案例1 • 链霉素生产中，采用调pH至酸性 链霉素生产中，采用调 至酸性pH3.0 ，加热至 至酸性 70℃，维持半个小时的方法来使蛋白变性，能使过 ℃ 维持半个小时的方法来使蛋白变性， 滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低 。 滤速度增大 倍 滤液粘度可降低1/6。 • 案例2 案例 • 柠檬酸发酵液，采用加热至80℃以上，使蛋白质变 柠檬酸发酵液，采用加热至 ℃以上， 性凝固和降低发酵液粘度， 性凝固和降低发酵液粘度，从而大大提高了过滤速 度。
• 有机溶剂变性法影响因素： 有机溶剂变性法影响因素：
• • •
无机盐对蛋白质的溶解度影响很大； 无机盐对蛋白质的溶解度影响很大； 在低离子强度和等电点附近，容易生成沉淀； 在低离子强度和等电点附近，容易生成沉淀； 蛋白质相对分子质量越大，越易沉淀。 蛋白质相对分子质量越大，越易沉淀。

第二章发酵液的预处理和固液分离方法

第二章发酵液的预处理和固液分离方法
采用凝聚和絮凝技术能有效地除去杂蛋 白质和固体杂质，提高滤液质量。
1．凝聚
凝聚是指在电解质作用下，由于胶 粒之间双电层电排斥作用降低，电位下 降，而使胶体体系不稳定的现象。
在生理pH值下，发酵液中的菌体或蛋白质常 常带有负电荷，由于静电引力的作用，使溶液中 带相反电荷的阳离子被吸附在其周围，在界面上 形成双电层。
应用实例：
在膜过滤中，发酵液中的大分子物质易 与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附 分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。
细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某 个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒， 有利于过滤的进行。
三、凝聚与絮凝
采用凝聚和絮凝技术能有效改变大分子 物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒， 便于提高过滤速率；
第二章 发酵液的预处理 和固液分离方法
发酵液预处理的目的
①改变发酵液的物理性质，提高固液 分离效率；
②尽可能使产物转入便于后处理的某 一相中(多为液相)；
③去除发酵液中部分杂质，以利于提 取和精制后续各工序的顺利进行。
2.1 发酵液过滤特性的改变
微生物发酵液的特性
① 发酵产物浓度较低，而且悬浮液中大部分是水； ② 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； ③ 固体粒子可压缩性大； ④ 液相粘度大，大多为非牛顿型流体； ⑤ 性质不稳定，随时间变化。
改善发酵 液过滤特 性的物理 化学方法
调酸(等电点) 热处理 电解质处理 添加凝聚剂 添加表面活性物质 添加反应剂 冷冻－解冻 添加助滤剂
一、降低液体粘度
根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速 率与液体的粘度成反比，降低液体粘度就可 有效提高过滤速率。
降低液体粘度的常用方法 加水稀释法 加热法
加水稀释法

第二章 发酵液的预处理和固

第二章 发酵液的预处理和固

二、发酵液的预处理（续）
调整pH（预处理中较常用方法）： – pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电 荷性质，调节pH可改善其过滤特性； 如调液pH值使蛋白质等达到等电点以除去；膜 过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附， 调pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵 塞和污染。 – 调pH时，选较温和的酸或碱，防止局部过酸、 过碱。常用草酸
选择和使用助滤剂要点
根据目的产物选择助滤剂品种；
根据过滤介质和过滤情况选择助滤
剂品种； 粒度选择：
– 与悬浮液中固体粒子的尺寸相适应。
使用量选择： – 与悬浮液中固形物含量相等，过滤速 度最快。
二、发酵液的预处理（续）
加入反应剂：
– 加入某些反应剂（不影响产物），利 用反应剂和某些可溶性盐类发生反应 生成不溶性沉淀。 –作用：生成的沉淀能防止菌丝体粘结， 使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作 为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物 凝固，消除发酵液中某些杂质对过滤 的影响，从而改善过滤性能。
第二节 发酵液的固液分离
固液分离的目的：
– 收集胞内产物的细菌或菌体，分离除 去液相； – 收集含生化物质的液相，分离除去固 体悬浮物； 固液分离的方法：离心分离、过滤、分 离筛、重力沉降、浮选分离。
不同性状的发酵液应选择不同的固液分离方法 霉菌和放线菌发酵液：过滤方法 细菌和酵母菌发酵液（未经预处理）：高速离心。 细菌和酵母菌发酵液（进行预处理）：过滤方法。
举例：如菌体较小的氨基酸发酵液，采用絮凝 和添加助滤剂等方法进行预处理后，即可用板 框过滤机或带式过滤机进行菌体分离
一、影响固液分离的因素
发酵液中细胞或菌体、各种悬浮粒子的
大小和形状：

2 发酵液的预处理细胞破碎与固液分离

2 发酵液的预处理细胞破碎与固液分离

过滤助剂
过滤助剂可解决两个问题
–滤饼的可压缩性问题 –小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到 转鼓真空过滤预覆盖层内部。使得预覆盖层 的部分孔被堵塞，影响了渗透性。加入助滤 剂可以解决这一问题
常用的过滤助剂 硅藻土、珍珠岩、活性白土
助滤剂的加入有两种方法
在滤布上预先铺一层助滤剂(1~2mm)， 该方法，会使滤速降低，但滤液透明 度增加。
特点
对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不 同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰 氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果级差。该 法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的 能量来提供必要的冷却，这是困难的。
超 声 波 破 碎 仪
2.2.3.2 化学和生物化学渗透
酸碱处理 可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组 分从细胞内渗漏出来。
区带离心（Zonal centrifugation）
密度梯度制作： • 先调配不同浓度（密度）的蔗糖溶液，然后在离 心管中以浓度从大到小层层加入即可。 • 将一定浓度的蔗糖溶液经一定时间的高速离心后 可制成连续的蔗糖密度梯度。 • CsCl 和NaBr在离心力的作用下可自动形成密度 梯度。
区带离心：差速区带离心和平衡区带离心。
袋 式 过 滤 机
2.1.2.2 离心
优点：分离速度快，分离效率高、液 相澄清度好，操作时卫生条件好； × 缺点：设备投资高、能耗大。
表2.3 离心机的种类和适用范围
项目 离心力
细胞 细胞核 细胞器
低速离心机 2000-7000g

高速离心机 8000800000g

超离心机 100000600000g
2.1.1.2 改善培养液的性能
主要通过降低发酵液的黏度、调节适宜的pH 值和温度、絮凝与凝聚等操作来实现

预处理及固液分离技术

预处理及固液分离技术

平衡区带离心
平衡区带离心的 密度梯度比差速 离心的密度梯度 大。
离心的结果
料液中高分子物质在与自身密度相等 的溶剂密度处形成稳定的区带。
区带中的高分子物质浓度以该密度处浓度为 中心，呈高斯分布。
等密度离心法
等密度离心的有效分离仅取 决于粒子的密度差，与粒子 的大小和形状无关，但是此 二者决定着达到平衡的速度、 时间和区带宽度。
○ 实际物系的特点、 分离目的、分离 程度
○ 选择适当的操作 条件（离心转数 和时间）
○ 使料液的不同组 分得到分级分离
细胞破 离心 碎液 600g,10mi
n
沉降层
（细胞膜碎片、线 粒体、溶菌酶）
沉降层（核糖体）
沉降层/细胞核（4－6μm)
上清液 (细胞膜碎片、线粒体、溶菌
体、核糖体、水溶性物质
2 2、可溶性蛋白质
发酵液的预处理主要是如何使可溶性蛋白质变性 沉淀除去。
单击此处添加大标题内容
一．蛋白质的性质和变性机理 二．沉淀法：酸性溶液与碱性溶液 三．变性法：加热、调pH、酒精、丙酮、表面活性剂 四．吸附法：有色物质
○ 常用的是离子交换剂、离子交换纤维、活性碳等 材料的吸附法。
○ 如：强碱性阴离子交换剂用于酪蛋白酶或果胶酶 的脱色。
需进行预处理 由于
改变发酵液的物理性质，改善流体性能，提高过滤速率。
○ 使目的产物转相便于后处理（多数是液相）。 ○ 去除发酵液中的部分杂质，便于后续操作。
发
酵
预
液
处
的
理
预
的
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目的产品在发酵液中浓度很低 与许多杂质（溶解的和悬浮的）夹在一起， 发酵液属于非牛顿型流体
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一般用草酸或无机酸、碱来调节。
通常加热和调pH协同作用。
例 链霉素生产发酵液预处理时，采用调pH＝3.0 左右，加热至70℃，维持半小时以凝固蛋白质， 这样可使过滤速度增大10～100倍，滤液粘度 降低为原先的1/6。
第二章预处理及固液分离技术
反应剂
加入某些反应剂，某些物质或杂 质能转为助滤剂，可消除这些物质 对过滤的影响，从而提高速率。
正确选择能提高3-10倍速率
第二章预处理及固液分离技术
助滤剂
助滤剂是一种具有特殊性能的细粉 或纤维，它能使某些难于过滤的物料 变得容易过滤。
硅藻土和珍珠岩是两种最常用的助 滤剂。硅藻土是几百年前的水生植物 沉淀下来的遗骸，珍珠岩是处理过的 膨胀火山岩。
第二章预处理及固液分离技术
二、去除杂质的具体方法
性物质）
内酶或核酸等）
通过微生物发酵或动植物培养得到的原料液应 首先将其中的菌体或细胞与培养液分离。
如果目标产物为胞外代谢物则直接对培养 液进行分离纯化；
如果目标产物为胞内代谢产物，要对细胞 进行处理，释放目标产物，然后除去细胞 碎片，再进行目标物质的纯化。
第二章预处理及固液分离技术
一、预处理特性的改变方法
第二章预处理及固液分离技术
第四节 细胞破碎
第二章预处理及固液分离技术
定义: 细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程
度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产 物最大程度地释放到液相中，破碎后的细 胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采 用不同的分离手段进一步纯化.
第二章预处理及固液分离技术
一、细胞壁的组成和结构
第二章预处理及固液分离技术
2）絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂存在下， 基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过 程。
絮凝剂必须具有长链线状的结构，易溶 于水，在长的链节上含有相当多的活性功能 团。
絮凝剂的功能团强烈地吸附在胶粒的表 面上。一个高分子聚合物的许多功能基团分 别吸附在不同颗粒的表面上，因而产生架桥 联接。
第二章预处理及固液分离技术
絮凝剂包括各种天然聚合物和人工合成聚合物。
天然絮凝剂：多糖、海藻酸钠、明胶和骨胶等。 无毒、 使用安全、适于食品或医药。 人工合成的絮凝剂：聚丙烯酰胺类、聚苯乙烯类 物和聚丙烯酸类聚合物等。 某些絮凝剂可能具有一定的毒性，在食品和医药 工业的使用中应考虑最终能否从产品中除去。
第二章预处理及固液分离技术
通常发酵液中细胞或菌体带负电荷，由于静电 引力的作用将溶液中带相反电性的粒子（即正 离子）吸附在周围，在界面上形成了双电层。 反离子化合价越高，即凝聚能力越强。 阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为： Al3+>Fe3+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。 常用的凝聚剂有：Al2(S04)3 ·18H20(明矾)； AlCl3·6H20； FeCl3；ZnS04；MgC03等
第二章预处理及固液分离技术
高速珠磨机（high spced bead mill） 研磨是常用的一种方 法，它将细胞悬浮液 与玻璃小珠、石英砂 或氧化铝等研磨剂一 起快速搅拌，使细胞 获得破碎。
测定导电率 导电率随着破碎率的增加而呈线性增加
第二章预处理及固液分离技术
三、细胞破碎技术
机械法和非机械法 机械法
机械法主要是利用高压、研磨或超声波等 手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目 的。 包括高压匀浆法、珠磨法和超声破碎法。
第二章预处理及固液ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ离技术
高压匀浆器 影响匀浆破碎的主要
因素是压力、温度和 通过匀浆器阀的次数。 高压匀浆法的适用范 围较广，在微生物细 胞和植物细胞的大规 模处理中常采用。
微生物细胞壁的化学组成和结构 细菌：肽聚糖的网状结构 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌：聚合物的网状结构、几丁质、纤 维素的纤维状结构
植物细胞壁的化学组成和结构 初生壁，次生壁 具有很高的机械强度
第二章预处理及固液分离技术
二、细胞破碎效果的检查
直接测定法 测定破碎前后的细胞数量
目的产物测定法 测定破碎液中目的产物的释放量（含量、活 性）
1、无机离子－利用沉淀作用
钙离子：加草酸或磷酸盐 镁离子：磷酸盐 铁离子：加黄血盐，生成普鲁士蓝沉淀
2、可溶性蛋白质
发酵液的预处理主要是如何使可溶性 蛋白质变性沉淀除去。
第二章预处理及固液分离技术
蛋白质的性质和变性机理 1）沉淀法：酸性溶液与碱性溶液 2）变性法：加热、调pH、酒精、丙酮、表面活性
第二章 预处理及固 液分离技术
2012.02
第二章预处理及固液分离技术
主要内容
预处理的本质（固-液分离） 发酵液的相对纯化方法 絮凝的基本原理和影响因素 细胞破碎的方法 影响离心分离的因素、方法及设备
第二章预处理及固液分离技术
发酵液的预处理
由于 目的产品在发酵液中浓度很低
与许多杂质（溶解的和悬浮的）夹在一起，
取决于可分离物质的性质，主要考虑目的物质的 分子大小、热稳定性、pH的适应性。
加热：最简单最经济的预处理方法（常用）
加热能使液体粘度降低，过滤速度加快。 该方法只适合于对热较稳定的生化物质，加热
的温度和时间须严加选择。
第二章预处理及固液分离技术
调pH
改变发酵液的胶体状态 使产物转入液相 使杂质（蛋白、多糖、Ca2+等）发生沉淀。
发酵液属于非牛顿型流体
预处理的目的
需进行预处理
改变发酵液的物理性质，改善流体性能，提高 过滤速率。 使目的产物转相便于后处理（多数是液相）。 去除发酵液中的部分杂质，便于后续操作。
第二章预处理及固液分离技术
（在合适的培养基pH、温度和通气搅拌 （包括菌体、胞
或经厌氧条件下进行生长并合成生物活 外代谢产物或胞
剂 3）吸附法：有色物质
常用的是离子交换剂、离子交换纤维、活性碳等 材料的吸附法。
如：强碱性阴离子交换剂用于酪蛋白酶或果胶酶的脱色。 阴离子交换树脂用于谷氨酸发酵液脱色。
第二章预处理及固液分离技术
三、凝聚和絮凝
凝聚与絮凝在预处理中常用于细胞、菌体（胞外 产物）、细胞碎片（胞内产物）以及蛋白质等胶 体粒子的去除。 与热处理和加无机电解质相比，作用条件温和， 实验剂量小。 1）凝聚作用是指在某些电解质作用下，由于胶粒之 间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体 体系不稳定的现象。