下载文档原格式
实验七 测定细菌生长曲线一、实验目的1. 了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时；2. 学习液体培养基的配制以及接种方法；3. 反复练习无菌操作技术；4. 了解不同细菌，不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同；5. 掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的方法二、 实验原理将一定量的细菌接种在液体培养基内，在一定条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定的规律性，如以细菌的活菌数的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，可绘成一条曲线，成为生长曲线（如图一）。
图一 微生物生长曲线示意图单细胞微生物的发酵具有四个阶段，即Ⅰ调整期（延滞期）、Ⅱ对数期（生长旺盛期）、Ⅲ平衡期（稳定期）、Ⅳ死亡期（衰亡期）。
生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的全过程的动态。
不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。
因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。
测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数板法、平板菌落计数法、称重法和比浊法等。
本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用分光光度计测定细菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。
将所测得的光密度值（OD600）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。
注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌与死菌，因此所测定的生长曲线的衰亡期不明显。
从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G 表示。
其计算公式为：2lg /)lg (lg 1212W W t t G --=式中t1和t2为所取对数期两点的时间；W1和W2分别为相应时间测得的细胞含量（g/L ）或OD 。
三、 实验仪器、材料和用具1. 实验材料:大肠杆菌，枯草杆菌菌液及平板；2. 培养基:牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基3.实验仪器:取液器(5000ul, 1000ul 各一支);培养箱, 摇床，722s分光光度计；4.实验用具:无菌1000ul吸头80个;无菌5000ul吸头2个;比色皿9个+共用参比杯一个.四、实验步骤1.准备菌种：将细菌接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培养基中，37℃振荡培养18h，另外准备单菌落平板各1块2.分为三个小组：第（1）小组取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基, 37 ℃200rpm取3.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃200rpm取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃200rpm第（2）小组取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培养基，37 ℃200rpm取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ℃110rpm取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基，30 ℃200rpm第（3）小组取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基，37 ℃200rpm取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基，30 ℃200rpm取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基，37 ℃110rpm每培养一小时取样一次(2.5h,3.5h加测1次). 对照组测量起始pH,所有瓶子测量发酵9h结束测pH.3.测量：选用600nm波长，以蒸馏水作为参比，开始培养前测定每组培养液的OD值作为起始点。
用比浊法测定大肠杆菌的生长(shēngzhǎng)曲线(一)实验(shíyàn)目的了解细菌生长曲线的持点及测定(cèdìng)原理，学会用比浊法测定细菌的生长曲线。
(二)实验(shíyàn)原理将一定数量的细菌，接种于适宜的液体培养基中，在适温下培养，定时取样测数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲线称为生长曲线。
该曲线表明细菌在一定的环境条件(tiáojiàn)下群体生长与繁殖的规律。
一般分为延缓期、对数期、稳定期及衰亡期四个时期，各时期的长短同菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。
比浊法是根据细菌悬液细胞数与混浊度成正比，与透光度成反比关系，利用光电比色计测定细胞悬液的光密度(即OD值)，用于表示该菌在本实验条件下的相对生长量。
实验设正常生长、加酸抑制和加富培养等三种处理，以了解细菌在不同生长条件下的生长情况。
（三）实验器材(1)活材料：大肠杆菌(E.coli)。
(2)培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨液体培养基14支(每支10mL)，浓缩5 倍的牛肉膏蛋白胨培养基1支。
无菌酸溶液(甲酸：乙酸：乳酸=3：1：1)。
(3)器材：1mL无菌吸管、摇床、冰箱、光电比色计、标签等。
（四）实验方法方法(1)1)接种(jiēzhòng)：取13支装有牛肉(niú ròu)膏蛋白胨培养液的试管，贴上标签(注明(zhù mínɡ)菌名、培养处理、培养时间、组号)。
按无菌操作法用吸管向每管准确(zhǔnquè)加入0.2mL的大肠杆菌培养液，接种(jiēzhòng)后，轻轻摇荡，使菌体混匀。
另一支不接种的培养管注明CK(对照)。
2)培养：将接种后的培养管置于摇床上，在37℃下振荡培养。
其中9支培养管分别于培养的0、1．5、3、4、6、8、10、12和14h后取山，放冰箱中贮存，待测定。
第九次课大肠杆菌生长曲线的测定（2学时）一、基本原理大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次．将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。
以培养时间为横坐标，以细菌数日的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。
不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。
测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。
本实验用分光光度计进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线．也可以直接用试管或带有测定管的三角瓶测定“klett units”值的光度计。
只要接种1支试管或1个带测定管的三角瓶，在不同的培养时间(横坐标)取样测定，以测得的klett units为纵坐标，便可很方便地绘制出细菌的生长曲线。
如果需要，可根据公式1klett units=OD／0.002换算出所测菌悬液的OD值。
二、实验器材1．菌种大肠杆菌。
2．培养基LB液体培养基70m1，分装2支大试管(5ml／支)，剩余60ml装入250ml的三角瓶．3．仪器或其他用具722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。
三、实验步骤1.标记取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。
2．接种分别用5m1无菌吸管吸取2．5m1大肠杆菌过夜培养液(培养10—12h)转人盛有50m1 LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取5m1混合液放人上述标记的11支无菌大试管中。
3．培养将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r／min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。
大肠杆菌生长曲线测定一、实验简介大多数细菌的繁殖速度很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次，将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段。
以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制曲线称为该细菌的生长曲线。
不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下培养所绘制的生长曲线也不相同。
测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。
本实验用分光光度计进行光电比浊测定。
当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过率降低，在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成（OD值）正比。
因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘制出该菌在一定条件的生长曲线。
二、实验试剂与材料1、菌种：大肠杆菌2、培养基：LB培养基（蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、PH 7.0～7.2）70ml，分装2支大试管（5ml/支），剩余60ml装入250ml三角烧瓶中进行灭菌。
3、仪器及器具：分光光度计、比色杯、水浴恒温摇床、接种环、无菌吸管、三角瓶、无菌水、无菌操作台、酒精灯。
三、实验过程和步骤1、种子液制备：在无菌操作台上用灭菌的接种环以无菌操作挑取大肠杆菌菌种放入灭过菌的无菌三角烧瓶中，并用无菌水稀释50倍。
放在无菌条件下静置一段时间作种子悬液。
注：挑取菌落时必须对大肠杆菌菌落的形态特点进行深入了解以便挑取同一菌落菌种，从而避免对后面的比浊产生影响。
2、大肠杆菌形态学观察：取菌悬液将其涂布在1cm^2的载玻片的面积上自然烘干，然后进行革兰氏染色（涂片—晾干—固定—结晶紫染色—水洗—媒染—水洗—脱色—复染—水洗—晒干—镜检），对其进行形态学观察。
