Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题

ELISA原理方法操作及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测目标分子的存在和浓度。

ELISA方法基于抗原-抗体反应的原理，通过酶标记的二抗或底物来标记和检测特定抗原或抗体的结合。

1.涂覆：将特异性抗体或抗原溶液加入微孔板的孔中，使其在孔壁上吸附，形成“涂覆抗原”或“涂覆抗体”的微孔板。

孔顶部通常需要使用一个覆膜或负压干燥来防止蒸发。

2.阻断：将孔中添加阻断剂如牛血清白蛋白（BSA）或乳糖，以防止非特异性结合。

3.样品加入：将待测样品加入微孔板，并充分搅拌孔内溶液，以使潜在的目标分子与涂覆的抗原或抗体结合。

4.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。

5.次级抗体加入：加入酶标记的二抗，以与结合到涂覆抗原或抗体的目标分子结合。

这种二抗可以是对目标物质抗体的抗体，也可以是对使用的抗原的抗体。

6.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。

7.底物加入：加入底物（通常为染色底物），以使酶标记的二抗产生可观察的信号。

底物反应产生的颜色或荧光强度与目标分子的浓度成正比。

8.停止反应：加入停止剂如酸，以停止底物反应，并防止进一步的信号增加。

此步骤通常在一定时间后进行。

1.注意对ELISA试剂的保存和使用条件，避免试剂的过期或不适当的保存导致结果偏差。

2.样品收集和处理方面要仔细。

避免样品的污染和交叉污染。

根据检测的目标分子选择适当的样品收集方法和处理方法。

3.在操作过程中，严格控制操作温度和时间。

不同的ELISA方法和试剂可能需要不同的温度和时间条件。

4.遵循相关的操作规程和实验室安全准则，使用个人保护装备，确保实验室安全。

5.在操作过程中，要准确记录每个步骤的时间、温度和取样量等信息，以便进行准确的数据分析和结果解释。

6.ELISA的结果通常是通过测量光密度或荧光强度来表达的，因此在结果分析时需要针对每个样品和对照进行准确的光度或荧光测量。

Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常见的免疫检测方法，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。

Elisa的操作方法和常见问题对于熟练进行实验和解决实验中的问题都至关重要。

以下是Elisa的常见类型、实验标准操作方法以及常见问题的详细介绍。

一、常见类型：1. 间接Elisa：该方法利用抗体的特异性结合性质来检测特定抗原。

首先，在官网上涂上反应性抗原的试样，然后添加能与抗原结合的一抗，再加入与一抗结合的二抗和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。

2. 直接Elisa：该方法利用特异性抗体与抗原的结合性质来检测特定抗原。

在官网上涂上反应性抗原的试样，然后加入能与抗原结合的标记抗体和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。

二、实验标准操作方法：1.样品制备：收集要检测的样品，并进行必要的处理和制备，如离心、稀释等。

2.官网涂布：将样品或标准物质涂在官网上，并在适当的温度条件下孵育一段时间，使其抗原完全吸附到官网上。

3.阻断：用适当的阻断缓冲液或血清阻止非特异性结合。

4.添加（初级）抗体：加入特异性的初级抗体，让其与官网上的抗原结合。

5.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的初级抗体。

6.添加（二级）抗体：加入特异性的二级抗体，使其与初级抗体结合，并将标记物引入实验系统。

7.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的二级抗体。

8.底物添加：加入含有底物的溶液，使底物被标记物催化，产生颜色反应。

9.反应终止：加入适当的溶液将反应停止。

10.测定：通过检测底物催化反应产生的颜色变化，使用酶标仪等设备测量并分析光密度。

三、常见问题：1.如何选择合适的抗体和标记物？2.如何优化实验条件？在实验过程中，可以通过优化浓度和孵育时间等条件来提高实验的敏感性和特异性。

可以尝试不同浓度的抗体和试剂，并对孵育时间和温度进行调整。

3.如何处理实验结果？实验结果通常会通过测量光密度来表示。

典型的Elisa实验结果可以使用标准曲线进行定量，或者通过比较样品和对照组的光密度差异来进行定性判断。

酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤酶联免疫吸附测定（ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

实验步骤1.标准品的稀释：按表1在小试管中进行标准品的稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品1 0µl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（O D值）。

测定应在加终止液后15分钟以内进行。

12.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

BDNF的ELISA结果显示为毫微克/毫克组织（ng / mg）或皮克/mL上清液（pg / mL），并表示为平均值±SEM。

常见问题一、白板现象：显色结束后，酶标板所有孔均无颜色，阳性对照不显色。

ELISA步骤试剂及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生命科学、医学和工业领域的实验技术，用于检测和测定生物样本中的抗原或抗体。

以下是ELISA的一般步骤、试剂及注意事项的详细介绍。

一、ELISA步骤：1.样品制备：首先，需要将待测样品（血清、细胞上清、组织提取物等）制备成特定体积的稀释液，以便进行ELISA实验。

2.涂布：将测定物（抗原或抗体）加入固相（例如，微孔板或磁珠）上，使其与固相表面发生特异性结合。

3.阻断：将非特异性结合位点阻断，以降低假阳性结果。

常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）和干奶粉等。

4.孵育：将样品（稀释液）加入到涂布的微孔板孔中，与固相上的结合位点结合，并孵育一定时间，促使特异性结合反应进行。

5.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。

6.探针反应：加入特定的称量标记的抗体或标记化的抗原，使其与待测样品特异性结合，并与固相上的结合位点结合。

7.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。

8.显示：加入染色剂或底物，使其与标记物发生特异性反应，并显示颜色或荧光。

9.终止反应：加入终止液停止底物与染色剂的反应。

10.读板：使用酶标仪或光度计测量吸光度，在特定波长下测量显示产物的光密度，并根据标准曲线或控制组数据计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。

二、常用ELISA试剂：1.涂布缓冲液：主要用来将测定物溶解在其中，涂布在微孔板或磁珠上。

2.试样稀释液：用于制备待测样品的稀释液。

3.标准物：用于制作标准曲线，以确定待测样品中抗原或抗体的浓度。

4.阻断剂：用于封闭非特异性结合位点，以降低假阳性结果。

5.洗涤缓冲液：用于去除孔内非特异性结合物质。

6.探针：用于特定抗体或抗原的检测，通常经过标记，如HRP（辣根过氧化物酶）或荧光染料等。

7.显示试剂：用于显示标记物与底物的特异性反应，如碱性磷酸酶底物或H2O2和TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二唑基）等。

（完整版）Elisa常见类型及实验标准操作⽅法与常见问题Elisa常见类型及实验标准操作⽅法与常见问题酶联免疫吸附试验（ELISA）是⼀种实验室常⽤的检测⽅法，⼴泛应⽤于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。

与其他基于抗体的检测⽅法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相⽀持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和⾮特异性相互作⽤的分离，并可通过最终有⾊产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。

ELISA 实验通常以细胞培养上清液、⾎清、⾎浆以及组织裂解物等为样品。

该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作⽤的底物。

根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测⽅法。

该实验可迅速分析⼤量平⾏样品，在基础研究和临床诊断实践中⼴泛使⽤。

⼀、直接ELISA原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。

加酶标抗体进⾏孵育。

固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。

彻底洗涤未结合的酶标抗体。

此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

加底物反应。

直接法主要⽤于测定抗原。

优点：操作流程简短，实验步骤少；⽆需使⽤⼆抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。

缺点：实验中的⼀抗需要直接⽤酶标记，成本相对较⾼。

⼆、间接法ELISA原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。

洗涤除去未结合的抗原及杂质。

加⼊特异性⼀抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。

经洗涤后，加酶标⼆抗。

固相免疫复合物中的抗体与酶标⼆抗结合，从⽽间接地标记上酶。

洗涤后，加底物显⾊。

优点：酶标⼆抗可加强信号，提⾼灵敏度；灵活性更⼤，同⼀酶标⼆抗可应⽤于多种不同的⼀抗；不直标⼀抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使⽤标记抗体更少。

缺点：交叉反应⼏率升⾼。

三、双抗夹⼼法ELISA原理：双抗体夹⼼法适⽤于测定⼆价或⼆价以上的⼤分⼦，但不适⽤于⼩分⼦抗原。

将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。

ELISA实验中常见问题和注意事项临床标本的收集和保存用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）。

本实验室用ELISA测定乙肝两对半，甲肝，戊肝，抗HIV的标本时，在处理和保存方面要考虑以下几个方面：1）要注意避免出现严重溶血及血清中混有红细胞。

当标本出现严重溶血及血清中混有红细胞时，反应孔不易洗净，残留在反应孔内的血红蛋白具有过氧化物酶的活性，显色时可能造成假阳性。

2）标本凝固不全强行离心，造成血清中含有少量的纤维蛋白原，在实验过程中形成纤维蛋白吸附在反应孔孔壁上不易洗掉，易造成假性结果。

3）血清标本可在2～8℃下保存1周。

如血清样本需长时间保存，则需放入-20℃冰柜内冰冻保存。

冰冻保存的血清标本须注意避免反复冻融，标本可能引起假阴性结果。

此外冻融标本的混匀不要进行剧烈振荡，应反复颠倒混匀。

ELISA测定中试剂准备在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，证试剂盒温度要和室温一致。

如果把试剂盒从冰箱拿出来直接做实验会造成一些弱阳性标本的检测出现假阴性。

因为在后面的孵育反应步骤中，造成孵育时间不够。

其次，ELISA实验中洗板用的洗液需每日更换配制，稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。

加血清样本及反应试剂血清样本使用微量加样枪加样。

使用微量加样枪加样必须注意避免以下几点：1）加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。

需匀速加样，吸样时，加样枪需按到第一档，加样时，加样枪需直接按到底。

2）加样应直接加入反应孔底部，加在反应孔孔壁上易溅出会对邻近孔产生污染。

尽量避免出现气泡。

3）反应试剂的加入时先要注意试剂的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。

滴加太快易出现重复滴加或加在两孔之间。

温育的时间与温度温育是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。

温育温度应在37℃，水浴。

温育时间应按照试剂说明书上的时间严格执行。

温育实际测定操作中要注意以下几点：1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。

elisa常见实验方法摘要：1.ELISA实验原理简介2.ELISA实验步骤概述3.常见ELISA实验方法分类4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景5.提高ELISA实验效果的方法6.ELISA实验中常见问题及解决策略正文：ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于生物医学领域，用于检测蛋白质、抗原和抗体等生物分子的方法。

ELISA实验通过特异性抗体与待检测物结合，再通过酶标记的二抗检测结合物，从而实现对目标分子的定量分析。

以下是ELISA常见实验方法的详细介绍。

1.ELISA实验原理简介ELISA实验基于抗原抗体反应原理，将抗原或抗体固定在固相载体上，待检测样品中的目标分子与固定在载体上的抗体结合，再加入酶标记的二抗，与结合在载体上的抗原或抗体发生反应。

最后，通过底物显色反应，根据颜色的深浅判断待测物含量。

2.ELISA实验步骤概述ELISA实验一般分为以下四个步骤：（1）抗原或抗体固定：将抗原或抗体吸附在固相载体（如酶标板）上；（2）样品处理：对待测样品进行适当处理，使其与实验体系相适应；（3）加样：将处理后的样品和酶标记的二抗加入酶标板，incubate；（4）底物显色：加入底物，酶标记的二抗与抗原或抗体结合后，底物被酶催化显色；（5）读数：用酶标仪测定显色程度，换算成待测物浓度。

3.常见ELISA实验方法分类根据实验过程中抗原抗体结合的方式，ELISA实验可分为以下几类：（1）双抗原夹心法：待测物为抗原，实验中使用两种针对抗原不同表位的抗体；（2）竞争法：待测物为抗体，与固定抗原竞争结合酶标抗体；（3）间接法：待测物为抗体，通过酶标记的二抗检测；（4）免疫共沉淀法：利用抗原抗体结合后形成的免疫复合物与底物结合。

4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景（1）双抗原夹心法：优点为特异性高、灵敏度高，适用于抗原含量较低的检测；缺点为操作复杂，易出现交叉反应。

（2）竞争法：优点为操作简便，适用于抗体含量较低的检测；缺点为特异性相对较低，易受其他物质干扰。

ELISA原理方法操作及注意事项酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测特定物质的存在和浓度。

ELISA基本原理是利用抗体和抗原之间的特异性结合来检测目标分子，通过酶的催化作用产生可定量的信号，从而实现对目标分子的检测。

ELISA方法操作简单、灵敏度高，广泛应用于医学、生物化学、环境监测等领域。

ELISA方法的基本原理是：首先，在试验板上涂覆抗原或抗体，在特定条件下，待分析的样品中的靶分子与已固定在板上的抗原或抗体发生特异性结合；接着加入配制好的检测抗体，检测抗体中含有特定酶，与靶分子结合形成抗原-抗体-酶复合物；加入底物，酶作用产生信号物质以定量检测目标物质的浓度。

1.准备试验板：将试验板中的孔涂覆抗原或抗体，然后将孔洗涤去除未结合的抗原或抗体。

2.加样：加入待检样品，待靶分子与抗原或抗体结合后，洗涤去除未结合的物质。

3.加检测抗体：加入检测抗体，与已结合的靶分子形成特异性结合，洗涤去除未结合的抗体。

4.加底物：加入底物，酶催化底物形成产物，产物的量与目标物质的浓度成正比。

5.停止反应：加入停止液终止酶的催化作用。

6.读板测定：用酶标仪测定产生的信号物质的光密度，根据标准曲线计算出目标物质的浓度。

1.实验前要认真准备实验物品和试剂，保证试验仪器和试剂的良好状态。

2.试验过程中要注意严格按照操作规程进行，避免污染和交叉污染。

3.操作过程中要注意操作手法轻柔，避免样品的损伤或渗漏。

4.样品处理要小心，确保样品完整性和纯度，避免因样品质量引起误差。

5.洗板操作要彻底，确保去除未结合的物质，避免干扰信号的产生。

6.实验过程中要注意仪器的准确校准，避免因仪器误差导致结果不准确。

7.实验结束后要及时清洗、消毒实验器具和废弃化学品，避免环境污染和安全事故发生。

总之，ELISA方法是一种简单、灵敏和可靠的生物化学分析方法，广泛应用于科研和生物医学领域。

在进行ELISA实验时，要严格按照操作规程进行，注意操作的细节和注意事项，保证实验的准确性和可靠性。

ELISA操作常见问题解决办法ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。

但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。

引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。

下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。

1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。

因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。

一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。

但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。

2．试剂盒平衡试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温（约25℃），一般需在室温放置20～30分钟以上。

平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。

冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。

3．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。

4．加样在现在的ELISA商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。

注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。

加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。

加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。

溅出会对邻近孔产生污染。

出现气泡则反应液界面有差异。

所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。

5．温育温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。

ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。