第八章 液相色谱分离方法

液相色谱的原理以及操作要点液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种常用的分离和分析技术，它基于不同物质在流动相中的分配行为来实现分离。

本文将介绍液相色谱的原理，同时探讨液相色谱的操作要点。

一、液相色谱的原理液相色谱的原理主要基于两个关键概念：分配系数和吸附性质。

1. 分配系数分配系数（Distribution coefficient）是指样品在固定相和流动相之间的分配比例。

它是液相色谱中物质分离的基础。

分配系数的大小决定了物质在固定相上停留的时间，从而实现了不同成分的分离。

2. 吸附性质液相色谱还涉及到物质在固定相上的吸附行为。

当样品溶液通过固定相时，固定相表面上的吸附剂与样品物质发生相互作用，使得物质被吸附，从而发生分离。

二、液相色谱的操作要点为了有效地进行液相色谱实验，以下是一些操作要点需要注意：1. 样品制备样品制备是液相色谱分析的首要步骤。

样品应准备恰当，并考虑到溶解度、稳定性以及待分析物之间的相互干扰。

此外，样品需要经过适当的前处理（如过滤、稀释等）以达到分析要求。

2. 流动相选择流动相的选择对液相色谱分离效果起到至关重要的作用。

合适的流动相应能够与待分析物有良好的相容性，并且具有适当的溶解性和流动性。

常用的流动相包括水、有机溶剂和缓冲溶液。

3. 固定相选择固定相是液相色谱中的另一个关键部分。

不同的固定相具有不同的化学性质，因此会影响到分离的选择性和效果。

根据待分析物的特性，选择合适的固定相对于分离效果至关重要。

4. 色谱柱选择色谱柱是液相色谱系统中用于分离的核心组成部分。

不同的色谱柱具有不同的长度、直径和固定相材料，这些参数会影响到分离性能和分析时间。

根据待分析物的特性和分离要求，选择合适的色谱柱尤为重要。

5. 色谱条件优化为了获得最佳的分离效果，需要进行色谱条件的优化。

例如，可以调整流速、梯度程序和柱温等参数，以达到更好的分离和峰形。

6. 数据处理和解释液相色谱实验完成后，需要对得到的色谱图进行数据处理和解释。

第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。

HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。

具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。

HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。

高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。

目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。

将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。

C18（ODS）是最常使用的化学键合相。

根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。

《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。

一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。

经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。

它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。

HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。

五、液相色谱分离法（一）色谱法分离原理色谱法（Chromatography）又称层析法，是一种高效分离方法，它利用物质在两相中的分配系数（由物理化学性质：溶解度、蒸汽压、吸附能力、离子交换能力、亲和能力及分子大小等决定）的微小差异进行分离。

当互不相溶的两相做相对运动时，被测物质在两相之间进行连续多次分配，这样原来微小的分配差异被不断放大，从而使各组分得到分离。

本节主要介绍经典的液相色谱法，包括柱色谱、纸色谱和薄层色谱。

1、固定相和流动相色谱分离体系有两个相构成，固定的一相称为固定相（stationary phase），移动的一相称为流动相（mobile phase）。

固定相，在经典柱色谱中也称为柱填料。

通常是一些具有特定的分离性质，具有一定粒度和刚性的颗粒均匀的多孔物质，如吸附剂、离子交换剂、反相填料等。

流动相有气体和液体两种。

在经典柱色谱中流动相也称为洗脱剂，液相色谱的流动相通常由混合溶剂以及一些添加剂（如无机盐、酸等）组成。

流动相对样品组分要有一定的溶解度；粘度小，易流动；纯度要高。

色谱分离应根据被分离物质的结构和性质，选择合适的固定相和流动相，使分配系数K值适当，以实现定量分离的目的。

因此，固定相和流动相的选择是色谱分离的关键。

2、色谱分配系数在色谱分离时，溶质随着流动相向前迁移，在这个过程中，它既能进入固定相，又能进入流动相，即在两相之间进行分配。

分配系数定义为对于确定的色谱体系，K值在低浓度和一定温度下是个常数，它的大小取决于的溶质的溶解、吸附、离子交换等性质。

在色谱分离过程中，K值大的溶质，在固定相的停留时间长，移动速度慢。

两个化合物之间的K值相差越大，越容易分离。

（二）柱色谱柱色谱（Column Chromatography）是最常见的色谱分离形式，它具有高效、简便和分离容量较大等特点，常用于复杂样品分离和精制化合物的纯化。

柱色谱主要有吸附色谱和分配色谱两类。

前者常用氧化铝或硅胶为柱填料。

现代⾊谱分析试题第⼀章⾊谱法概论1. 综述各种⾊谱法的特点及其应⽤。

2. 简要说明⽓相⾊谱法（GLC、GSC）、⾼效液相⾊谱法（HPLC的各类⽅法）特点及其应⽤范围？3. 试⽐较⾊谱法（GC、HPLC）之间的异同？第⼆章⾊谱基本理论例1 采⽤3M⾊谱柱对A、B⼆组分进⾏分离，此时测得⾮滞留组分的t M值为0.9min ，A组分的保留时间（t R(A)）为15.1min，B组分的t R为18.0min，要使⼆组分达到基线分离（R=1.5），问最短柱长应选择多少⽶（设B组分的峰宽为1.1 min）？解⽅法（1）：由已知条件，得n B=16(18.0/1.1)2=4284r i,B=18.0-0.9/15.1-0.9=1.20K/B=18.0-0.9/0.9=19则因为所以故⽅法（2）：同⽅法（1）得n B=4284；r i,B=1.20；K/B=19所以则n B (R=1.5)=16 (1.5)2(1.2/0.2)2[(1+19)/19]2=1425故L=n (R=1.5)H=14250.07=99.8cm1m1.A、B ⼆组分的分配系数之⽐为0.912，要保证⼆者的分离度达到1.20，柱长因应选择多少⽶？设有效塔板⾼度为0.95mm.。

2.有⼀液相⾊谱柱长25cm,流动相速度为0.5ml/min，流动相体积为0.45ml，固定相体积为0.25ml,现测得萘、蒽、菲、芘四组分（以A、B、C、D）的保留值及峰宽如表3-1。

根据已知条件试计算出：（1）各组分容量及分配系数；（2）各组分的n及n eff；（3）各组分的H 值及H eff值；（4）画出四组分的K/值之间的关系曲线表3-1 在HPLC柱上测得的A、B、C、D 的组分t R(min) W h/2(min)⾮滞留组分ABCD 4.06.513.514.620.10.420.971.101.38答：（1）K/（A=0.60；B=2.38；C=2.65；D=4.03）；（2）（A=4021；B=3099；C=2818；D=3394）n eff（A=595；B=1535；C=1486；D=2178）;（3）H（A=0.06；B=0.08；C=0.09；D=0.07）H eff（A=0.42；B=0.16；C=0.17；D=0.11）;(5)根据已有数据，绘出K/--n--n eff曲线，⾃⾏判断正确与否，并分析原因。

液相分离度的原理液相分离是化学和生物学实验中非常常见的过程。

它是一种将混合溶液中的各种成分分离的技术。

液相分离是基于不同的物理和化学特性运用在不同物质之间产生的差异上的。

这些差异可以被利用来引导同一混合物中的成分分离到不同的区域，最终使得它们成为单独的成分。

液相分离主要需要依靠以下三种方式来实现：色谱、离子交换和凝胶过滤。

这些方法都有各自的作用和原理。

1. 色谱分离色谱分离依据溶液中不同分子的相互作用差异将物质分离。

色谱分离公式是：移动速度（Vm） = 多项式（分子大小，极性，等等） X 运行介质（gas，liquid，etc）。

在这里，分子大小、化学性质和极性是色谱分离的三个基本特征。

当在不同的溶剂体系中进行色谱分离时，溶剂的不同极性和化学性质会影响各种成分在某一介质中的迁移速率。

这便是为什么不同的成分在色谱分离过程中可以被分离到不同的区域。

2. 离子交换分离离子交换属于离子交换色谱技术的一种，依赖于离子交换树脂与混合溶液中离子的电荷差异。

在离子交换分离过程中，树脂以负离子或正离子的形式交换吸附溶液中的离子。

具有不同电荷的离子在催化剂中的吸附作用不同，从而实现了混合溶液的分离。

3. 凝胶过滤分离凝胶过滤法是一种多孔性质的溶胶技术。

通过组成凝胶的空间中的间隙，大小不同的成分可以通过这个空间的大小作为动力进行分离。

在凝胶过滤过程中，溶液中的细胞、蛋白质、聚合物和其他成分将被分离，并随凝胶的筛网逐渐洗净。

凝胶过滤法也被广泛地应用在温度敏感性的和具有高极性的物质的分离中。

综上所述，液相分离依靠物质在分子大小、分子化学性质、分子表面电荷等方面的差异实现分离。

液相分离的原理与方式各不相同，但通常依赖于极性、电荷异性和孔径差异之共存来实现成分之间的分离。

由于液相分离的原理复杂，需要精细的实验条件和高质量的实验仪器，所以一些条件或时区的不匹配或者操作不当，可能会导致分离结果产生错误。

五、液相色谱分离法（一）色谱法分离原理色谱法（Chromatography）又称层析法，是一种高效分离方法，它利用物质在两相中的分配系数（由物理化学性质：溶解度、蒸汽压、吸附能力、离子交换能力、亲和能力及分子大小等决定）的微小差异进行分离。

当互不相溶的两相做相对运动时，被测物质在两相之间进行连续多次分配，这样原来微小的分配差异被不断放大，从而使各组分得到分离。

本节主要介绍经典的液相色谱法，包括柱色谱、纸色谱和薄层色谱。

1、固定相和流动相色谱分离体系有两个相构成，固定的一相称为固定相（stationary phase），移动的一相称为流动相（mobile phase）。

固定相，在经典柱色谱中也称为柱填料。

通常是一些具有特定的分离性质，具有一定粒度和刚性的颗粒均匀的多孔物质，如吸附剂、离子交换剂、反相填料等。

流动相有气体和液体两种。

在经典柱色谱中流动相也称为洗脱剂，液相色谱的流动相通常由混合溶剂以及一些添加剂（如无机盐、酸等）组成。

流动相对样品组分要有一定的溶解度；粘度小，易流动；纯度要高。

色谱分离应根据被分离物质的结构和性质，选择合适的固定相和流动相，使分配系数K值适当，以实现定量分离的目的。

因此，固定相和流动相的选择是色谱分离的关键。

2、色谱分配系数在色谱分离时，溶质随着流动相向前迁移，在这个过程中，它既能进入固定相，又能进入流动相，即在两相之间进行分配。

分配系数定义为对于确定的色谱体系，K值在低浓度和一定温度下是个常数，它的大小取决于的溶质的溶解、吸附、离子交换等性质。

在色谱分离过程中，K值大的溶质，在固定相的停留时间长，移动速度慢。

两个化合物之间的K值相差越大，越容易分离。

（二）柱色谱柱色谱（Column Chromatography）是最常见的色谱分离形式，它具有高效、简便和分离容量较大等特点，常用于复杂样品分离和精制化合物的纯化。

柱色谱主要有吸附色谱和分配色谱两类。

前者常用氧化铝或硅胶为柱填料。