版中国药典微生物限度检查方法验证方案

版药典微生物限度检查方法验证方案验证微生物限度检查方法的方案一、实验目的：验证药典中的微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性。

二、实验材料：1.药典中规定的微生物限度检查方法；2.待验证的药品样品；3.适用的培养基和培养条件；4.培养基的质量控制菌种。

三、实验步骤：1.制备适用的培养基：按照药典中规定的方法和成分制备适用的培养基，并进行批次记录。

2.准备质量控制菌种：3.制备菌液悬液：从购买的质量控制菌种中，挑取一株菌种进行连续传代培养至活性最佳的生长阶段。

然后制备菌液悬液，以备后续试验使用。

4.扩大悬液应用范围：从第3步得到的菌液悬液中，取适量接种于适用培养基上，培养出代表性的细菌菌液悬液。

然后，通过菌液的光学检测、显微镜检查和菌落计数，确定菌液的细菌浓度。

5.验证方法的准确性：将待验证的药品样品加入培养基，根据药典中的方法将培养基分成不少于3组。

每组培养基中分别加入一定量的菌液悬液，并在药典规定的温度和时间下培养。

同时，设置对照组，只加入菌液悬液和培养基。

6.菌落计数：取适量的培养基样品，分别进行菌落计数，并根据培养基的数量、培养基总菌落数、对照组的菌落数等数据，计算菌落形成单位。

7.验证方法的可靠性：将待验证的药品样品按照药典中的方法进行连续验证，至少重复3次。

然后，对比不同验证结果的一致性和稳定性，评估方法的可靠性。

8.验证方法的可行性：根据实际的样品情况和验证结果，评估方法在操作上和技术上的可行性。

如，是否存在样品的特殊要求，检测方法是否能满足检测要求等。

四、数据处理与分析：根据实验结果的菌落计数和验证的次数，进行数据处理和统计分析。

评估验证结果的一致性、可靠性和可行性。

五、结论：根据实验结果和数据分析，得出关于药典中微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性的结论。

如果验证结果与药典一致，说明方法可靠并可以使用。

如果验证结果与药典不一致，需要进一步分析原因和进行修正或优化。

药品微生物检验及方法验证药品微生物限度检查及方法验证从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。

第一部分：外围工作外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。

器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。

培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。

固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。

煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。

万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。

液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。

万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。

消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。

表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。

可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。

另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。

第二部分：检验过程整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。

首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。

文档来源为:从网络收集整理.word 版本可编辑.欢迎下载支持.文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告目录样品相关信息 基本信息主要仪器设备和试验耗材信息 主要使用的仪器设备 试验用培养基 试验用试剂 试验用菌种 试验环境 无菌室 洁净工作台 生物安全柜 试验方案 验证试验目的微生物限度检查方法草案 方法验证试验菌液制备计数培养基适用性检查控制菌检查用培养基使用性检查 供试液制备 方法验证菌落计数方法验证试验 控制菌检查方法的验证方法验证结论供试品微生物限度检查结果 样品相关信息 基本信息（三批）1 1.12 2.1 2.2 2.3 2.4 3 3.1 3.2 3.3 4 4.1 4.25 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.5.15.5.2 5.6 6 1 1.12主要仪器设备和试验耗材信息2.1主要使用的仪器设备2.2试验用培养基2.2.1对照培养基2.2.2试验用培养基2.3试验用试剂2.4试验用菌种3试验环境《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。

本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。

3.1无菌室无菌室按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。

3.2超净工作台超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。

超净工作台沉降菌检测记录3.3生物安全柜生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。

生物安全柜沉降菌监测记录4试验方案按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过lOOOcfu,霉菌和酵母菌总数不得过lOOcfu，大肠埃希菌不得检出。

微生物实验室检测设备配置方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。

验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。

3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录XI J微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。

4.验证实施：4.1.1试验前的准备：4.1.1.1试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃,灭菌30 min,在3天内使用。

4.1.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制微生物实验室检测设备配置方案说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃, 灭菌15 min，在3周内使用。

4.1.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。

药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。

细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。

特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。

2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。

（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。

（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。

6. 写出验证资料。

示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。

2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。

霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。

2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。

人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案下表用于记录修订/变更主要内容及历史..目录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法8.偏差与漏项控制9.验证报告会审1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊;产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查..参照中国药典2015版四部附录1105：微生物计数法;以及1106：控制菌检查法的规定;本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证..通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用..人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分;文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性;对霉菌和酵母菌无抑菌活性..甲硝唑在水中微溶;可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响..本验证方案通过试验菌株的回收率测试;首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用;则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查..本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件;按制定的方法进行试验;根据验证结果判断是否符合验证标准..2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性;对其有效性进行评价;保证检验结果的可靠性..本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊;进行微生物限度检查方法的验证..3.组织及职责3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草;由质量部审核;最终由质量负责人批准..验证方案实施完成后;由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告;由质量部审核;最终由质量负责人批准报告..3.2验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后;;由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作;并将该次的培训记录归档..3.3验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差;质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施..3.4 验证工作小组成员表4. 验证进度计划表本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月..5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认5.1.主要检验仪器设备确认表检查人/日期：复核人/日期：5.2.验证所需文件的确认表检查人/日期：复核人/日期：6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认6.1.试验菌种检查表检查人/日期：复核人/日期：6.2试验所需的培养基检查检查人/日期：复核人/日期：6.3.检验样品确认表检查人/日期：复核人/日期：7.验证项目和验证方法7.1试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌..试验菌株的传代次数不得超过5代;并采用适宜的菌种保藏技术进行保存;以保证试验菌株的生物学特性..7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中;30～35℃培养18～24小时;取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/ml的菌悬液备用..接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中;20～25℃培养2～3天;取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/ml的菌悬液备用..接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上;20～25℃培养5～7天;直到获得丰富的孢子..加入3～5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液;将孢子洗脱;吸至无菌试管中;取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/m的孢子悬液备用..菌液制备后若在室温下放置;应在2 小时内使用；若保存在2～8℃;可在24小时内使用..黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃ ;在验证过的贮存期内使用..验证时;对各试验菌的回收率逐一进行验证..7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.3.1.供试液的制备取供试品10g;加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml;振摇;制成1：10的供试液..7.3.2.试验组取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置30～35℃培养箱中培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..另取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置20～25℃培养箱中培养5天;点计菌落数..取1：10的供试液1ml注入平皿中;立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀;平行制备2个平皿..置30～35℃培养箱中培养5天;点计菌落数..另取1：10的供试液1ml注入平皿中;立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀;平行制备2个平皿..置20～25℃培养箱中培养5天;点计菌落数..取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置30～35℃培养箱中培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..另取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置20～25℃培养箱中培养5天;点计菌落数..常规倾注平皿法方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值即试验菌的回收率应在0 .5 2 范围内..常规倾注平皿法方法验证的结果常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验;若各试验菌株的回收率在0.5～2范围内;则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查..如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查;但不适用于需氧菌总数检查;则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查..7.4. 需氧菌总数检查—离心沉淀-薄膜过滤法7.4.1.供试液的制备取供试品10g;加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml;振摇;制成1：10的供试液贮备液..取1:10的供试液贮备液50ml;经500转/分钟离心3分钟;取上清液得供试液..7.4.2.试验组取供试液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次;然后在第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu 的试验菌;过滤..每株试验菌株平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..7.4.3.供试品对照组取供试液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次;平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养5天;点计菌落数..7.4.4.菌液对照组取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml;200ml通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;在余下的100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu的试验菌;过滤..每株试验菌株平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..稀释剂对照组依照7.2项下菌液制备方法;以0.9%无菌氯化钠为稀释液;将各菌液稀释至含菌50～100cfu/ml;然后以500转/分钟离心3分钟;取上层菌液作下面的试验..取上层菌液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次;每株试验菌株平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..7.4.6. 离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值即试验菌的回收率应在0 .5 2 范围内;同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在0 .5 2 范围内..7.4.7.离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：7.4.8. 离心沉淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验;若试验组各试验菌株的回收率在0.5～2范围内;稀释剂对照组各试验菌株的的回收率也在0.5～2范围内;则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的需氧菌总数检查..人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及计数方法进行需氧菌总数计数..7.5.控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法若在7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法的试验中;证实了人工牛黄甲硝唑胶囊有抑菌性;不能使用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查;则为了确保控制菌检查的可靠性;采用可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法进行控制菌检查;按照以下方案进行方法学验证..7.5.1试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准中规定检查的控制菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌;所以选择这两种菌株进行控制菌检查的方法学验证..试验菌株的传代次数不得超过5代;并采用适宜的菌种保藏技术进行保存;以保证试验菌株的生物学特性..7.5.2 控制菌检查方法验证的菌液制备分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中;30～35℃培养18～24小时;取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/ml的菌悬液备用..菌液制备后若在室温下放置;应在2 小时内使用；若保存在2～8℃;可在24小时内使用..验证时;对各试验菌的回收率逐一进行验证..7.5.3大肠埃希菌检查方法验证供试液的制备取供试品10g;加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml;振摇;制成1：10的供试液贮备液..取1:10的供试液贮备液50ml;经500转/分钟离心4分钟;取上清液得供试液..取供试液10ml;加至100 ml0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次;然后在第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入～100cfu的大肠埃希菌;过滤..取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中;42～44℃培养24～48小时..取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～72小时..麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长..组～100cfu/ml;然后以500转/分钟离心3分钟;取上层菌液作下面的试验..取上层菌液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次..取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中;42～44℃培养24～48小时..取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～72小时..麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长..取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..阴性对照应无菌生长..试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：大肠埃希菌检查方法验证结果小结按照验证方案的要求进行试验;若试验组与阳性对照组均检出典型大肠埃希菌;阴性对照组无菌生长;则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的大肠埃希菌检查..人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及大肠埃希菌检查方法进行检查..菌检查方法验证7.5.4.1供试液的制备取样品10g加0.9%无菌氯化钠溶液至100 ml制成1:10的供试液..取全部供试液经500转/分钟离心4分钟;取全部上清液为供试液..7.5.4.2.试验组取全部供试液;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次..然后在第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入～100cfu的乙型副伤寒沙门菌;过滤..取膜接种至200ml 胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基;30～35℃培养18～24小时..取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～48小时..沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好;菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色..用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落;于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种;培养18～24小时.. 7.5.4.3阳性对照组～100cfu/ml;然后以500转/分钟离心3分钟;取上层菌液作下面的试验..取上层菌液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次..取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基;30～35℃培养18～24小时..取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～48小时..沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好;菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色..用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落;于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种;培养18～24小时..7.5.4.4阴性对照组取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..阴性对照应无菌生长..7.5.4.5离心沉淀-薄膜过滤法测定乙型副伤寒沙门菌方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：7.5.4.6乙型副伤寒沙门菌检查方法验证结果小结按照验证方案的要求进行试验;若试验组与阳性对照组均检出典型乙型副伤寒沙门菌;阴性对照组无菌生长;则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的乙型副伤寒沙门菌检查..人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及乙型副伤寒沙门菌检查方法进行检查..8.偏差与漏项控制：微生物限度检查方法验证过程中存在和发现的任何偏差与漏项;都应进行详细的记录;并应按公司GMP文件偏差处理规程进行调查与处理..偏差调查与处理的报告和支持文件;应作为此确认方案的附录部分..检查人/日期：复核人/日期：9.验证报告会审验证报告会审表。

文件制修订记录微生物限度检查方法验证方案1.0概述药典微生物限度检查法中要求在建立药品的微生物限度检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。

所以对感冒灵颗粒微生物限度检查进行方法的验证。

2.0目的为了保证检验质量，对所用的检验方法必须经过验证，才能确保检验结果的准确可靠。

3.0适用范围本方案适用于感冒灵颗粒微生物方法学的确认与验证。

4.0验证人员职责4.1验证小组:组长：质量管理部经理成员：QC主管、微生物操作人员4.2职责及分工：QC主管组织起草该验证方案，并组织实施该方案；微生物操作人员具体实施该方案；质量管理部经理协助和监控该方案的实施。

4.3验证方案批准后，应进行培训。

由验证小组指定人员负责对小组成员及和验证有关的人员进行培训。

5.0验证依据中国药典2015年版通则“1105”、“1106”6.0感冒灵颗粒微生物限度检验方法验证风险分析：见附件。

6.1 结果分析：通过以上采取的措施，风险均控制在可接受范围内。

7.0人员培训确认表8.1 仪器及设备名称感冒灵颗粒规格：批号：感冒灵颗粒规格：批号：感冒灵颗粒规格：批号：验证用培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号：沙氏葡萄糖琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号：营养琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号：胰酪大豆胨液体培养基生产厂家：批号：配制批号：沙氏葡萄糖琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号：麦康凯液体培养基生产厂家：批号：配制批号：麦康凯琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号：8.3验证用菌种:金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26 003）、大肠埃希菌（CMCC(B)44 102）、枯草芽孢菌（CMCC(B)63 501）、白色念珠菌（CMCC(F)98 001）、黑曲霉菌（CMCC(F)98 003）8.4菌液制备：8.4.1取经30℃~35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌营养肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5～10－7为不大于100cfu/ml备用。

微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查法验证方案1。

目的:为确认所采用的方法适用于药品微生物限度检查，包括细菌、霉菌、酵母菌和对照菌的计数，特制定本验证方案。

通过比较试验菌的复苏生长结果，评价整个试验方法的准确性、有效性和重现性，从而确定试验样品在实验条件下无抑菌活性或抑菌活性可忽略不计。

所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。

验证过程应严格按照本计划规定的内容进行。

因特殊原因确需变更的，应填写《验证计划变更申请书》，报验证领导小组批准。

2.范围: 本验证计划适用于微生物限度检查方法的验证。

3。

规范性引用文件:根据《中国药典》XXXX版附录二附录九J微生物限度检查法的要求，由于部分试验品的抗菌活性，当已建立的微生物检查方法或产品的成分发生变化或原检查方法的检查条件发生变化时，可能会影响检查结果的准确性。

因此，必须验证测试物品的抗菌活性和测试方法的可靠性。

4.验证和实施:4.4.1试验前准备:4.4.1.1试验设备的准备:试管、刻度移液器、薄膜过滤器、滤膜(孔径0.22um，直径50毫米)、平皿、空三角瓶、称重纸等。

试验要求用牛皮纸包裹，放在湿热灭菌器中，在121℃灭菌30分钟，3天内使用4.4.1.2试验培养基的制备:取脱水培养基如营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基(BL)、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡萄糖醛酸苷培养基(MUG)等经适用性检验合格的脱水培养基，按相应的制备说明用纯净水配制，分装，2小时内放入湿热灭菌器中，121℃灭菌15分钟，3周内使用4.4.1.3试验用稀释液/缓冲液和冲洗液的配制:取有效期内的试剂，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%(毫升/毫升)聚山梨酯80无菌氯化钠溶液和0.05%(毫升/毫升)0.9%氯化钠溶液等。

按照相应的制备方法，用纯净水配制，加热溶解，过滤，分装，121℃灭菌15分钟，3周内使用4.4.2试验菌的制备和稀释:4.4.2.1细菌、霉菌和酵母菌计数法验证菌液:4.4.2.1.1取少量新鲜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，接种于10毫升营养肉汤中，在30-35℃培养18-24小时；将新鲜白色念珠菌培养物接种到改良的马丁培养基中，在23-28℃培养24-48小时；将黑曲霉的新鲜培养物接种到改良的马丁琼脂斜面培养基上，在23-28℃培养5-7天4.4.2.1.2将上述大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的均匀培养物(细菌悬液)用0.9%无菌氯化钠溶液稀释两次，以制备每毫升细菌含50-100伏的测试细菌溶液。

中国药典微生物限度检查法
中国药典是中华人民共和国国家药品监督管理局编制的用于药品质量标准和规范的权威性文献。

其中，微生物限度检查是对药物产品中的微生物污染进行评估和控制的重要环节。

中国药典中的微生物限度检查法主要包括以下几个方面：
1.检测项目：微生物限度检查主要关注细菌、真菌和酵母菌
的存在与数量。

通常会检测大肠杆菌、铜绿假单胞菌、霉
菌和酵母菌等常见微生物。

2.样品准备：样品准备过程中，要根据具体要求制备适当稀
释的样品溶液。

根据不同产品的特点和要求，可能需要使
用适当的培养基进行预处理。

3.检测方法：中国药典中提供了一系列的微生物限度检测方
法，包括涂片法、水洗法、滤膜法等。

这些方法可以根据
不同的样品类型和特性选择适合的检测方法。

4.培养和观察：按照检测方法的要求，将样品接种在适当的
培养基上，进行培养并观察一定时间。

观察期间，需要注
意各种细菌、真菌和酵母菌的生长情况。

5.计数和判定：根据培养结果，进行微生物数量的计数，并
与规定的限度标准进行比较。

根据比较结果，判定样品是
否符合微生物限度标准。

通过微生物限度检查，可以评估药物产品中的微生物污染状况，并确保其在接受者使用时的安全性。

中国药典中的微生物限度
检查法为药品质量控制提供了重要的指导和标准。