涂片找抗酸杆菌的标准操作规程

肺结核痰涂片检查工作规范--------------------------------------------------------------------------------痰涂片检查是肺结核病人诊断与鉴别诊断、制定化疗方案、疗效考核的主要方法或手段。

为贯彻落实市卫生局《关于在全市一级以上医疗单位中开展传染性肺结核筛查工作的通知》的精神,加强传染性肺结核病人发现力度,特制定本规范。

一、痰检的对象和要求(一)对象1.咳嗽、咳痰≥3周或有咯血或血痰症状以及胸片异常者。

2.进行疗效考核的病人:凡已确诊、登记、治疗的肺结核病人,在化疗期间应按规定定期作痰菌复查。

1)初治涂阳病人(含重症涂阴病人)在疗程满2、5、6个月时,复治涂阳病人在疗程满2、5、8个月时,各查痰一次。

2)初、复治涂阳病人在疗程满2个月时,痰菌仍为阳性者,应在治疗满 3个月时增加查痰一次。

3)确诊、登记的涂阴肺结核病人,即使病人因故未接受治疗,也应在登记后满2和6个月时进行痰菌检查。

(二)要求1.初诊病人应送3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)。

如无夜间痰,在留清晨痰后2~3小时再留取一份痰标本;或在送痰时,留取两份即时痰。

治疗中或复诊随访病人按期每次送检两份痰(清晨痰和夜间痰)。

2.痰标本采集:即时痰为病人就诊时咳出的痰液。

清晨痰为清晨深咳出的痰液。

夜间痰为就诊前一天晚睡前咳出的痰液。

痰标本应以脓样、干酪样或脓性粘液样性质的痰液为合格标本,痰量应为3~5毫升。

应由检验人员或专人验收痰标本,痰液不合格者,要求重新送检。

难以获得合格标本时,也应进行细菌学检查,但应注明标本性状以供分析结果时参考。

痰标本的容器,应采用国家参比实验室推荐的国际通用痰瓶或采用直径4厘米、高2厘米的塑料或涂蜡纸密闭盒。

留痰容器上应注明病人姓名、编号(门诊序号或病人登记号)及日期。

13.痰标本的保存和输送:痰标本容器密封,勿倒置,严防痰液外溢。

不能立即作涂片检查的痰标本,须置4℃冰箱保存,防止痰液干涸或污染。

抗酸染色镜检的操作规程1.目的:通过抗酸染色鉴别结核杆菌.2.原理:一般认为抗酸性菌体内含脂类物质较多,此物质具有抗酸的性质.染色时,它与石碳酸复红结合牢固,能抵抗酸性酒精的脱色作用,同时脂类又不易透过细胞膜,不能被脱色,因此抗酸菌能保持复红的颜色.相反,非抗酸性菌体内含脂类少,易被酸性酒精脱色,脱色时又易从细胞膜渗出而脱掉,最后被复染蓝色.3.试剂:3.1试剂来源:购买珠海贝索3.2试剂盒组成:R1:石碳酸复红溶液1χ100ml R2:酸性酒精溶液1χ100mlR3:亚甲基蓝溶液1χ100ml4.质量控制:室内质控包括痰标本收集,痰片染色和镜检结果复查.痰涂片应保存供上一级参比实验室质量控制检查.5.标本采集与处理:5.1病人留标本前用清水漱口,用力咳出来自支气管深部的脓样或粘液样痰,量不少于3ml避免留唾液或鼻咽部分泌物.5.2夜间痰为就诊前一天晚睡前咳出的痰液.5.3初诊病人应送3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰),痰液不合格者重送.5.4涂片:取脱脂过的干燥、清洁、无油污的新玻片，在玻片背面的左端1/3处以记号笔编号,用折断的竹签挑取痰标本的脓样,干酪样0.1ML,于玻片上均匀涂抹成2ⅹ2.5CM卵圆形痰膜,自然干燥后待检.6.染色方法:6.1用片夹夹住涂片火焰固定,加石碳酸复红溶液,徐徐加热至有蒸汽出现染5分钟,水洗.6.2加脱色剂,不时摇动玻片至无色脱落为止,水洗.6.3加复染液,染0.5-1分钟,水洗涂片后镜检.滴1-2滴香柏油,用油镜仔细观察.8.结果的判断:结核杆菌呈红色,其它细菌呈蓝色.9.实验完后的处理:9.1先用擦镜纸将镜头上的油擦去,再用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次,最后用干净擦镜纸擦2-3次,向一个方向擦拭。

9.2废弃玻片放入5% 84消毒液中浸泡60分钟,消毒液要每天更换。

9.3痰盒和废弃标本等污染物应弃于有盖的污物桶内,消毒后焚烧。

9.4痰检完成后,操作台面用5% 84消毒剂 液擦拭后,紫外线灭菌灯照射30分钟。

抗酸染色一、原理本试剂盒采用WHO推荐的Ziehl-Neelsen法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。

但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。

齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。

当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。

二、试剂石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液三、方法1.涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰2.固定：常用高温进行固定。

即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。

要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色3.染色3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色10分钟或更久，无需加温3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1-2分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色30秒钟3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块四、结果判定1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色2. 报告方式2.1 未找到抗酸杆菌2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌1-2条/300视野2.3 找到抗酸杆菌1+：发现抗酸杆菌3-9条/100视野2.4 找到抗酸杆菌2+：发现抗酸杆菌1-9条/10视野2.5 找到抗酸杆菌3+:发现抗酸杆菌1-9条/1视野2.6 找到抗酸杆菌4+：发现抗酸杆菌≥10条/1视野五、注意事项1.每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热7. 染色时勿使玻片上的染液干燥六、临床意义分支杆菌属（结核分支杆菌、麻风分枝杆菌、非典型分支杆菌）、放线菌抗酸染色阳性，可初步鉴定细菌。

抗酸染色操作规程
1.目的
规范抗酸染色操作规程，确保染色结果清晰可靠。

2、原理
分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。

3、范围
用于抗酸性细菌(结核、麻风分枝杆菌)初步鉴定
4、质量控制
龟分枝杆菌ATCC93326做染色阳性,大肠埃希菌ATCC25922为染色阴性对照。

5、试剂
5.1石炭酸复红
碱性复红 10g 95,酒精 100ml 5,石炭酸 900ml (边加边研磨) 5.2盐酸脱色液(3,盐酸酒精)
浓盐酸 3ml 95,酒精 97ml
5.3吕氏美兰
美兰 0.3g 95,酒精 30ml 蒸馏水 70ml 10,KOH水溶液 0.1ml 复染液 6、工作程序
6.1制片:待检标本用无菌生理盐水涂片，经自然干燥后用火焰固定。

6.2初染:加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。

反复染5分钟,清水冲洗。

6.3脱色:加盐酸脱色液，不时摇动玻片至无红色脱落为止，清水冲洗。

6.4复染:加美蓝复染，染0.5-1分钟，清水冲洗。

6.6待涂片自然干燥后，油镜镜检。

7、结果判断
结核杆菌呈红色，其它细菌呈蓝色
8、注意事项
染液注意密封，以免凝结产生沉淀影响使用效果。

体液标本均应离心后取下层沉淀液与染液混合，以提高检出率。

提高责任心，做到全片检查。

2.2.2.3滴加亚甲蓝复染液，染色30秒，流水从玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去玻片上剩余的水，待玻片干燥后镜检。

2.2.3待检涂片检查2.2.3.1染色合格的涂片，由于被亚甲蓝染色而呈均匀亮蓝色，且无红色斑块；染色后的痰膜脱落部分应小于整个涂布面积的10%2.3镜检2.3.1油镜下观察300个视野以上或者连续观察5分钟2.3.2观察方法2.3.2.1使用10×目镜双目显微镜读片；2.3.2.2取染色完毕且已经干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定；2.3.2.3首先使用40×物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；2.3.2.4移开40×物镜，在玻片上滴1-2滴镜油，使用100×油镜进行仔细观察。

但应注意避免油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。

2.3.2.5读片时，首先应从左至右观察相邻的视野；当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右至左观察，以此类推；2.3.2.6在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色；其他细菌和细胞呈蓝色。

2.3.2.7仔细观察完300各视野，一般需要5分钟；每个工作日，一位镜检人员阅读玻片量不超过25张，且连续阅读10-12张玻片后应休息20分钟左右。

2.4结果判断2.4.1阴性：镜检300个视野以上或连续观察5分钟未发现抗酸杆菌2.4.2阳性：阳性（300个视野内有1~8条抗酸杆菌）阳性1+（100个视野内有3~9条抗酸杆菌）阳性2+（10个视野内有1~9条抗酸杆菌）阳性3+（每个视野内有1~9条抗酸杆菌）阳性4+（每个视野内有9条以上抗酸杆菌）2.5结果报告与记录2.5.1将检测结果填写入申请单报告栏，报告格式如下:涂片1：阴性（-）镜检结果：涂片2：阴性（-）涂片3：阴性（-）2.5.2将检测结果记录于结合门诊检测登记册中：涂片号标本性状检测结果例： 1： D 阴性（-）2： D 阴性（-）3： D 阴性（-）2.6痰涂片的保存2.6.1阅读完毕后的涂片，应及时用擦镜纸轻轻在涂片上揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。

微生物抗酸染色步骤如下：
1. 准备试剂：选择合适的载玻片，用9%的冰醋酸溶液浸湿载玻片。

用无菌操作取瑞氏染液、美蓝染液、无菌生理盐水，分别滴加到染色槽中，确保每个槽中液体的高度占据染色槽的2/3。

2. 涂片：采取标本时，应使用无菌操作取少量标本放入无菌离心管中，加入少量的无菌生理盐水，振荡离心管使标本充分溶解。

用吸管吸取少量的溶解标本均匀涂布在载玻片上，注意应避免标本在载玻片上形成气泡。

3. 抗酸染色：用竹镊子将涂有标本的载玻片拿起来，先加入少量美蓝染液，盖上盖玻片，避免染液进入对下步观察产生干扰。

用同样方法加等量无菌生理盐水洗去染液后，再滴加少量瑞氏染液，迅速用滤纸吸去多余染液。

4. 镜检观察：染色后，待染色液稍干后，用显微镜观察染色情况。

如果是抗酸阳性杆菌，则会被染成蓝色或淡蓝色；而其他革兰阴性杆菌则会被染成红色。

微生物抗酸染色主要用于区分抗酸杆菌和其他革兰阴性杆菌，尤其是在结核病诊断和疫情监测中具有重要意义。

不同微生物的抗酸染色结果可能会因为菌种的差异而略有差异。

具体操作时应注意无菌操作和染液的配制方法，以及涂片、染色和观察的技巧。

以上内容仅供参考，建议到正规医疗机构进行咨询，获取更全面和准确的信息。

肺结核痰涂片检查工作规范--------------------------------------------------------------------------------痰涂片检查是肺结核病人诊断与鉴别诊断、制定化疗方案、疗效考核的主要方法或手段。

为贯彻落实市卫生局《关于在全市一级以上医疗单位中开展传染性肺结核筛查工作的通知》的精神，加强传染性肺结核病人发现力度，特制定本规范。

一、痰检的对象和要求（一）对象1．咳嗽、咳痰≥3周或有咯血或血痰症状以及胸片异常者。

2．进行疗效考核的病人：凡已确诊、登记、治疗的肺结核病人，在化疗期间应按规定定期作痰菌复查。

1）初治涂阳病人（含重症涂阴病人）在疗程满2、5、6个月时，复治涂阳病人在疗程满2、5、8个月时，各查痰一次。

2）初、复治涂阳病人在疗程满2个月时，痰菌仍为阳性者，应在治疗满 3个月时增加查痰一次。

3）确诊、登记的涂阴肺结核病人，即使病人因故未接受治疗，也应在登记后满2和6个月时进行痰菌检查。

（二）要求1．初诊病人应送3份痰标本（夜间痰、清晨痰和即时痰）。

如无夜间痰，在留清晨痰后2～3小时再留取一份痰标本；或在送痰时，留取两份即时痰。

治疗中或复诊随访病人按期每次送检两份痰（清晨痰和夜间痰）。

2．痰标本采集：即时痰为病人就诊时咳出的痰液。

清晨痰为清晨深咳出的痰液。

夜间痰为就诊前一天晚睡前咳出的痰液。

痰标本应以脓样、干酪样或脓性粘液样性质的痰液为合格标本，痰量应为3～5毫升。

应由检验人员或专人验收痰标本，痰液不合格者，要求重新送检。

难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状以供分析结果时参考。

痰标本的容器，应采用国家参比实验室推荐的国际通用痰瓶或采用直径4厘米、高2厘米的塑料或涂蜡纸密闭盒。

留痰容器上应注明病人姓名、编号（门诊序号或病人登记号）及日期。

3．痰标本的保存和输送：痰标本容器密封，勿倒置，严防痰液外溢。

不能立即作涂片检查的痰标本，须置4℃冰箱保存，防止痰液干涸或污染。

涂片找抗酸杆菌操作规程（改良碱性复红法）1 检验目的检验样本中是否含有抗酸杆菌，为临床提供诊断依据。

2 原理结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层脂或脂质之皮膜不易着色，但一经着色后酸或乙醇的作用亦是不容易把它脱色。

利用这特性并以增强的染色液予染色，然后再以酸及乙醇加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色（红色）。

3标本要求（1）标本类型：病人的痰、穿刺关节液、腹水、胸积液、组织、脑脊液、分泌物、尿液等（2）标本采集：见标本采集手册（一般须得深咳痰，其它无特殊要求。

）（3）标本储存和运输：可室温保存、室温运送。

病人标本须密封运送以避免污染环境。

4 容器和添加剂类型痰盒、尿杯、试管等6 试剂（1）试剂名称：结核菌染色液（2）试剂生产厂家：广东省结核病研究所统一配制（3）包装规格：3X500ML（4）试剂盒组成：试剂1：石碳酸复红液试剂2：酸性酒精溶液试剂3：亚甲基蓝溶液7仪器设备：双目显微镜荧光显微镜8 校准程序送市计量质量检测研究所校准9操作步骤⑴涂片经火焰固定，加石碳酸复红液染色5分钟或更久（需加温）。

⑵水洗（之后尽可能将水沥干）。

⑶加酸性酒精溶液，脱色1-2分钟。

⑷水洗（假如标本面还可以看到残存红色时，再加酸性酒精溶液脱掉红色为止）。

⑸加亚甲基蓝溶液染色30秒，水洗，干燥。

(6)镜检。

10质量控制：参加我科质量管理组的质量控制活动。

11干扰和交叉反应麻风菌可能对检验结果产生影响。

12 生物参考区间涂片未见抗酸杆菌13 患者检验结果的可报告区间涂片未见抗酸杆菌/涂片见细长、红色抗酸杆菌14 临床意义：结核分枝杆菌不产生内毒素和外毒素，其毒力主要是在机体中细胞内、外生长与大量繁殖的能力，细菌成分与其代谢产物引起免疫反应（Ⅳ型）导致一系列组织学上的意义。

集菌涂片一步法检测脑脊液抗酸杆菌实验诊断结核性脑膜炎随着结核病发病率的提高，结核性脑膜炎（结脑）病例在临床也不断增多。

目前，结脑病例呈常年发病、不典型表现病例增多、各年龄组均有分布等特点，其中以不典型的临床表现和不典型的脑脊液（CSF）实验室检查结果增多为突出特点。

由于结脑的临床表现和CSF检测结果均呈不典型化变化，使临床诊断结脑的难度进一步增大。

结脑仍然是结核病中死亡率和致死率最高的病种，而降低其死亡率和致死率唯一有效的方法就是及时确认和及时治疗。

临床诊断结脑在很大程度上依靠实验室资料，但由于常规实验室方法诊断结脑的敏感性低（10-40%左右），难以满足诊断结脑的需要。

因此，进一步研究特异、灵敏、实用的实验诊断结脑的方法，具有重要的临床实用意义。

研究提示，集菌涂片一步法（一步法）能够显著地提高抗酸杆菌（AFB）的检出率。

1材料与方法1．1对象:所检测的对象，均为临床确认的病例，共165例，年龄2-70岁，男86例，女79例。

其中，结脑患者115例（结脑组）；对照组50例，包括病毒性脑膜炎患者30例、非结核性细菌性脑膜炎患者12例、新型隐球菌性脑膜炎8例。

所有对象经过临床诊断、实验室诊断、影像学诊断、临床治疗评价等而最终确诊。

1.2方法:采集CSF为检测标本。

对第一份CSF标本，平行进行培养结核杆菌、常规法检测AFB、一步法检测AFB，比较各种方法的特异性和阳性率。

1.2.1培养结核杆菌:应用改良罗氏法，按《结核病诊断细菌学检验规程》有关操作规程进行。

试剂自制。

1.2.2常规法检测AFB:应用CSF沉渣涂片、萋-纳氏抗酸染色法检测AFB，试剂自制，按《结核病诊断细菌学检验规程》有关操作规程进行。

1.2.3一步法检测AFB:此法检测CSB标本AFB实验分为3个步骤：首先，进行“玻片直接离心集菌涂片”步骤：取CSF1-5ml（根据CSF细胞数，摸索CSF用量，一般使用3ml可以满足检测需要），于CSF细胞离心涂片器（本实验应用第四军医大学生产的FMU-5型仪器）中用500rpm条件将液体全部离心甩干，进行CSF的离心集菌涂片。

SOP_15-16 结核杆菌涂片检查标准操作程序一、目的：统一项目操作规程，严格检验质量标准，为临床提供及时、可靠的结果报告。

二、适用范围：结核杆菌涂片检查三、操作人员：检验科授权工作人员四、操作步骤：1、原理抗酸染色的基本原理是抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物性状。

此类细菌在石碳酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性乙醇脱色，显微镜观察时保持紫红色；而其它脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性乙醇脱色后，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。

2、染色液的配制2.1碳酸复红染液：全省统一配送2.2 5%盐酸乙醇脱色液：35%浓盐酸5mL与95%乙醇混合2.3亚亚甲蓝染色液：全省统一配送3、载玻片的准备：用于AFB检查的载玻片要求：⑴一张载玻只能涂抹一份痰标本。

⑵每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片检查。

新的载玻片放入95%乙醇中浸泡2小时脱脂，用摄子夹出放干净纱布上阴干，放无尘容器（培养皿）中备用。

4、本的采集、运送及处理4.1初诊病人应送3份痰标本（夜间痰、晨痰和即时痰）。

如无夜间痰，在留晨痰后2-3小时再留取一份痰标本；或在送痰时，留取两份即时痰。

疗程中或复诊随访病人按期每次送检2份痰（晨痰和夜间痰）。

痰标本性质：干酪痰、血痰、粘液痰为合格标本；唾液或口水为不合格标本，除照常进行涂片检查外，应要求患者重新送检。

4.2收集标本的容器应采用WHO推荐的标准痰瓶，或采用直径4厘米、高2厘米的可密封塑料盒或蜡纸盒（我省统一采用蜡纸盒）。

★痰容器上就注明与检验单一致的病人姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、★检查项目和容器序号1、2、3（1为当日即时痰，2为夜间痰。

3为晨痰）。

5、涂片的制备5.1 编号：取经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片，在玻片背面左端1/3处注明实验室序号(56001递增)及标本序号（按1递增）（如使用的载玻片一端无磨砂面，须用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可用2B铅笔在磨砂面上直接书写）。

临床微生物SOP-穿刺液涂片标准操作规程1．目的规范穿刺液标本涂片标准操作规程。

2．适用范围穿刺液标本，包括胸腔积液、腹水及胆汁等。

3．检验步骤3.1 胸腔积液、腹水及胆汁：将标本经3000 r/min离心10min后取沉淀物涂片。

涂片自然干燥或烘片机烘干后进行革兰染色或抗酸染色。

3.2 镜检与结果报告：标本涂片经革兰染色，根据染色特性、形态排列，初步报告“找到革兰阴性或革兰阳性球菌或杆菌”。

3.2.1 在镜下找到革兰阳（阴）性球菌，可报告“找到革兰阳（阴）性球菌”。

3.2.2在镜下找到革兰阳（阴）性杆菌，可报告“找到革兰阳（阴）性杆菌”。

3.2.3 如镜检未找到细菌可报告“未查见细菌”。

3.3 真菌涂片检查：参见《真菌涂片标准操作规程》、《墨汁染色标准操作规程》。

3.4 抗酸染色：参见《抗酸染色标准操作规程》。

3.5 质控：每张涂片均做革兰阳性和阴性菌对照。

4．注意事项胸腔积液、腹水及胆汁标本涂片可以为单一菌种，也可为混合菌种。

5．危急值无菌体液查见细菌或真菌均需按危急值报告，并记录。

参考文献[1] 中国合格评定国家认可委员会．CNAS-GL42医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明．2014.[2] 周庭银编著．临床微生物学诊断与图解，第3版，上海：上海科学技术出版社,2012[3] Versalovic J, Carroll KC, Funke G, et al. Manual of Clinical Microbiology. 10th ed. Washington: ASM Press, 2011.。

抗酸染色的操作及临床应用抗酸染色是一种在临床病理学中常用的技术，用于检测和诊断与酸性染料亲和的微生物，特别是结核分枝杆菌。

这种染色方法被广泛应用于结核病的确诊、治疗监测及相关疾病的鉴别诊断。

下面将详细介绍抗酸染色的操作及临床应用。

操作方法：1. 原料准备：准备好益氏染液、酸酒红溶液、高锰酸钾溶液、酸性酮液、甲苯、绝对醇和脱脂溶剂等试剂和溶液。

2. 标本制备：将待检标本如痰液、尿液、刮片等经过前处理（如离心、加热、电洗等）后涂片制备，并将涂片固定在90摄氏度的焙烧烘箱中固定片上3~5秒钟，然后用冷水洗净。

3. 染色操作：将固定的检测标本涂片用甲苯浸泡2~5分钟，将甲苯吸出后加入酒精脱脂2~5分钟，然后再用绝对醇脱脂2~5分钟，最后用脱脂溶剂脱脂30~120秒。

4. 抗酸染色：将脱脂后的标本涂片完全浸入益氏染液中，保持液面在标本上1~2毫米高，将益氏染液再加热到80摄氏度，静置5~10分钟，待酸性酮为蓝色。

5. 染色反应：用高锰酸钾溶液滴落在标本上，加热到细菌虫红颜色被去掉，再滴落高锰酸钾溶液热到细菌虫红显现为红色。

6. 清洗与固定：倾倒掉多余的染色剂和高锰酸钾溶液，用自来水彻底冲洗，将标本涂片风干或用吹风机吹干。

7. 反染：将涂片溶于酸酒红溶液中，温和地与酸酒红反应。

反应结束后，再次用自来水冲洗，风干，镜片上缀油。

临床应用：1. 结核菌检测：抗酸染色是诊断结核病的重要手段之一。

通过检测患者痰液、刮片等标本中的抗酸染色-阳性颗粒，可以快速、敏感、直观地进行结核分枝杆菌的检测和诊断。

2. 结核病确诊：抗酸染色技术作为结核病的初筛方法，可帮助医生进行早期诊断和治疗。

对于疑似结核病患者，通过抗酸染色检测可快速识别结核菌，指导早期治疗方案的制定。

3. 结核病治疗监测：抗酸染色技术可用于结核病治疗效果的评价和疗程的调整。

治疗过程中，定期检测患者的痰液标本，观察结核菌的存在和培养基的数量，以判断治疗效果并及时调整治疗策略。

抗酸染色（冷染法）标准操作规程01原理本试剂盒采用 WHO 推荐的 Ziehl-Neelsen 法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。

但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。

齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。

当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。

02试剂石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液03方法1. 涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰2. 固定：常用高温进行固定。

即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动 3 ~ 4 次，共约 3 ~ 4 秒。

要求玻片温度不超过 60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色3. 染色3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色 10 分钟或更久，无需加温3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色 1 ~ 2 分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色 30 秒钟3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑04结果判定1. 干燥后油镜观察 300 个视野（观察时间不少于 4 min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色2. 报告方式2.1 未找到抗酸杆菌2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌 1 ~ 2 条 / 300 视野2.3 找到抗酸杆菌 1+：发现抗酸杆菌 3 ~ 9 条 / 100 视野2.4 找到抗酸杆菌 2+：发现抗酸杆菌 1 ~ 9 条 / 10 视野2.5 找到抗酸杆菌 3+: 发现抗酸杆菌 1 ~ 9 条 / 1 视野2.6 找到抗酸杆菌 4+：发现抗酸杆菌≥ 10 条 / 1 视野05质量控制每次用卡介苗做阳性对照大肠埃希菌 ATCC25922 做阴性对照06注意事项1. 每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆；2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止；3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长；4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意；5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射；6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热；7. 染色时勿使玻片上的染液干燥。

微生物检验实验室抗酸染色标准操作规程1．目的规范抗酸染色标准操作规程。

2．原理抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物状，此类细菌在石碳酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性酒精脱色，显微镜观察时保持紫色红色；而其他脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性酒精脱色，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。

3．试剂3.1 Kinyoun溶液。

碱性品红40g 乙醇（95%）200ml 石碳酸80ml 蒸馏水1000ml3.2 Gabett溶液亚甲蓝10g 无水酒精300ml硫酸200ml 蒸馏水500ml4．质控每天用龟分支杆菌ATCC93326做阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922做阴性对照。

5.操作步骤5.1 初染涂片上滴加石碳酸复红液，用火焰加热至产生蒸汽，约5分钟，水洗。

5.2 脱色第二液脱色约1分钟，轻轻摇动玻片，无红色脱色或略呈粉红色时为止，水洗。

5.4 复染第三液复染30秒，水洗。

自然干燥后镜检。

6.结果判断抗酸杆菌呈红色。

7.注意事项7.1 每张玻片只能涂一份标本，禁止将2份或2份以上的标本涂在同一张载玻片上。

7.2 为防止交叉感染，标本应先高压灭菌后再涂片染色。

7.3 在涂抹痰标本时，严禁对载玻片进行加热。

7.4 菌龄为18～24小时为佳。

8.临床意义只针对用于结核病、麻风病等的细菌检查，初步诊断。

9.安全防护措施9.1操作人员要戴口罩、手套和穿隔离衣。

9.2涂片制备痰标本要高压灭菌或者在标本中加入等量0.5%“84”消毒液（含有效氯2500mg/L）后涂片。

气管刷片送检的玻片，紫外线灯下照射30分钟进行染色镜检。

或者对于进行抗酸染色的痰标本（因使用的容器原因不能高压灭菌）。

9.3镜检后的玻片均浸泡在含有效氯1000mg/L的消毒液中，高压灭菌后处理。

9.4所有标本、污染物丢弃之前，都需经高压灭菌、焚烧或浸泡杀菌剂中。

抗酸染色操作程序【检验原理】抗酸染色可将细菌分为两大类，即抗酸性细菌和非抗酸性细菌，因日常大多数病原菌为非抗酸性细菌，所以抗酸染色不作为临床上常规的细菌检测项目，只针对结核病等具有抗酸性细菌标本的染色。

【主要组成成分】1.石碳酸复红溶液2.脱色剂（3%盐酸酒精溶液）3.复染液（吕氏美兰溶液）【样本要求】1.直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率；2.直接用细菌染色，要注意防护，以防生物感染。

【检验方法】1.涂片经火焰固定，加1液徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。

染5分钟（若染色奴卡氏菌需要更长时间），水洗。

2.加第2液不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗；3.加3液，染0.5-1分钟，水洗。

4.干后油镜镜检。

【结果判断】分支杆菌在暗背景中呈红色，背景为蓝色。

镜检结果分级报告抗酸杆菌阴性（-）：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌抗酸杆菌阳性（报告抗酸杆菌菌数）：1~8条/300视野抗酸杆菌阳性（1+）：3~9条/100视野，连续观察300个视野抗酸杆菌阳性（2+）：1~9条/10视野，连续观察100个视野抗酸杆菌阳性（3+）：1~9条/每视野抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条/每视野【注意事项】1、严格掌握脱色时间，要脱色充分，脱色时间过短易使红色的石炭酸复红染料残留显红色而造成假阳性。

2、在染片过程中，加1液后一定要酒精灯徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾，这样才能使细菌充分着色。

3、石碳酸对皮肤、粘膜有强烈的刺激性和腐蚀性，使用时要注意安全，如果不慎沾到皮肤上，立即用水或酒精冲洗。

4、涂片染色阳性只能说明抗酸杆菌的存在，不能区分是结核菌还是非结核分支杆菌。