【生物工程下游技术】第三章 发酵液预处理

通常发酵液的黏度大，其中的微生物
体积小，造成过滤的困难。
在过滤前，一般需对料液进行絮凝或
凝聚等预处理，此外可添加助滤剂提 高过滤速度。
A. 根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。
澄清过滤：
过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，当悬浮液通过滤层 时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，适合于固体含量 少于0.1g/100ml、颗粒直径在5-100μ m的悬浮液的过滤分离，如河水、麦芽汁、 酒类和饮料等的澄清。
高分子絮凝剂的吸附和絮凝作用示意图
工业上使用的絮凝剂可分为三类：
1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙 烯类衍生物； 2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等； 3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、 明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。
目前最常见的高分子聚合物絮凝剂
适用范围
细菌、酵母菌、放线菌、 细胞碎片
管式离心机
管式离心机是一种分离效率很高的离心 分离设备，其转鼓细长，可在15000-50000 的高转速下工作，分离因数可达104-6×105。 它设备简单、操作稳定。 适用范围 细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、 核酸等。特别适合一般分离机难以分离的固 形物含量<1% 发酵液的分离。
影响絮凝的因素

絮凝剂的加量(图3-1） 絮凝剂的分子量


溶液的pH
搅拌速度

搅拌时间
（3）混凝
对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型 高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸 附桥架的双重机理； 对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝 聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚 和絮凝机理的过程，称为混凝。
3.凝聚与絮凝
采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的 分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能 有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。
凝聚——指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排 斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象；
絮凝——指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用， 使胶粒形成较大絮凝团的过程。
4.加入助滤剂
一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量 的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过 滤阻力。 常用的助滤剂有： 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等， 最常用的是硅藻土。 使用硅藻土时，通常细粒用量为500 g/m3；中等粒度用量为700 g/m3； 粗粒用量为700-1000 g/m3。
2.调整pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值 可改善其过滤特性。氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发酵 液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的 电荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在 某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。
有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物
根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类： ① 非离子型、 ② 阴离子型（含有羧基） ③ 阳离子型（含有胺基）
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聚丙烯酰胺絮凝剂
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
用量少，一般以mg/L计量； 絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。
在碱性溶液中带负电荷。
在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。
酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。
在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、 水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成 沉淀；
在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu2+、 Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。
④ 性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、
蛋白酶水解等作用的影响。
改善发酵液过滤特性的物理化学方法：
调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添 加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。
1.降低液体粘度
根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，降低 液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提高过滤速率。注意加热 温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。
二、发酵液的相对纯化
发酵液中的杂质 a. 高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）
在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。
b.杂蛋白
在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，
在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。
在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。

倾析式分离机
是一种靠离心力和螺旋的推动力作用自动 连续排渣的离心机。具操作连续、适应性 强、结构紧凑和维修方便的优点。分离因 数为1500-3000。
适用范围 特别适合固形物含量较多的悬浮液的分 离。因分离因数较低，不适合细菌、酵母 等微小微生物悬浮液的分离。（P53图）
2 过滤

定义： 在一定的压力差 下，利用多孔性介质 截留固液悬浮液中的 固体粒子，进行固液 分离的方法称为过滤。
（2）真空转鼓过滤机 优点：
真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、 处理量大。特别适合固体含量大（>10％）的悬浮 液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌 和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。
一、发酵液过滤特性的改变
微生物发酵液的成分极为复杂，其中除了所培养的微生物菌体及残 存的固体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋 白质，以及微生物的各种代谢产物。
微生物发酵液的特性为：
① 发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮液中大部分是水； ② 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； ③ 液相粘度大，大多为非牛顿型流体；
管式离心机工作原理图

GF型，用于分离各种乳浊液, 特别适用于二相相对 密度差甚微的液一液分离以及含有少量杂质的液一 液一固分离。 分离原理：密度大的液相形成外环，密度轻的液相 形成内环，流体到转鼓上部各自的排液口排出，微 量固体沉积在转鼓壁上，待停机后人工卸出。 GQ型，用于分离各种难于分离的悬浮液。特别适合 于浓度小、粘度大，固相颗粒细，固液重度差较小 的固液分离。 分离原理：密度较大的固体微粒逐渐沉积在转鼓内 壁形成沉渣层，待停机后人工卸出，澄清后的液相 流动转鼓上部的排液口排出。
滤饼过滤：
过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布、玻璃纤维纸、合成纤 维等无纺布。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤 渣）。当滤饼至一定厚度时即起过滤作用，此时即可获得澄清的滤液，这种方 法叫做滤饼过滤，在滤饼过滤中，悬浮液本身形成的滤饼起着主要的过滤作用， 适合于固体含量大于0.1g/100ml的悬浮液的过滤分离。
（2）絮凝
采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质
量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有 许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如---COOH）或
阳离子（如---NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。
它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地 吸附在胶粒的表面。 当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒 表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是 絮凝作用。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点
存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺， 用于食品和医药工业时应谨慎。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的应用
医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍 生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有 机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、 脱乙酰壳多糖等）。
第三章 发酵液预处理
目的
不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞 碎片、核酸和蛋白质的沉淀物）， 还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质， 以利于后继各步操作。
采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子
的大小，提高其沉降速度；
或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。
第一节
发酵液的预处理
B. 常用过滤设备
（1）板框过滤机
广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、 酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于 固体含量1-10%的悬浮液的分离。
板框过滤机
板框过滤机
1. 结构：若干板，框交替排列，板，框都用支耳架在一对 横梁上，用压紧装置压紧或拉开。 2. 滤板结构：凹凸纹路作用支撑滤布，提供滤液或洗涤液 的流道。分为洗涤板和非洗涤板两种。 3. 滤框结构：有供料浆通过的暗孔，料浆在压差的推动下 籍框两侧覆盖的滤布进行过滤分离。 4. 过滤操作液体流动路径：料浆沿1通道输入，通过滤框 的暗孔进入滤框，框中的料浆在压差的推动下籍框两侧覆 盖的滤布进行过滤分离。滤饼在框内两侧生成并增长，滤 液通过滤布流到滤板板面的凹槽后因板面凹槽有暗孔与2、 4通道相连或与3通道相连，故滤液可由三条通道流到过滤 机外。
第二节
固液分离工程 及设备
一、固液分离的方法
A.重力沉降 B.浮选
通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。 用于固液比重差小、直径5～30μ m颗粒的分离，污水处理
C.旋液分离
悬浮液以较高速度沿切线方向进入旋液分离器， 轻相由分离器中央排出， 霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用 重相由分离器下部排出， 过滤方法； 细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采 但不适合直径<5 μm颗粒去除（可用丝网分离器）。 用高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可 用过滤进行固液分离。
5.加入反应剂
加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4， AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀 本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能； 如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤 速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉 酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。
D.过滤 E.离心
工业上常用
1. 离心分离
在液相非均一系统中，利用离心力达到液－液、液－固、 液－液－固分离的方法，统称为离心分离。
优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好； 缺点：设备投资高、能耗大。 离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机。
碟片式离心机
是传统离心机，为目前工 业上应用最广泛的离心机。 分离因数可达1000-20000， 最 大 处 理 量 达 到 300m3/h ， 常用于大规模的分离过程。
因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。
（一）、高价无机离子的去除方法
1. Ca2+ ——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀（注
意回收草酸） ；
2. Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可 溶性络合物； 3. Fe2+ ——黄血盐，→普鲁士蓝沉淀
（二）杂蛋白的去除方法
1. 沉淀法
蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。 在酸性溶液中带正电荷；
2. 变性法
① 加热 ② 大幅度调节pH值 ③ 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。
不足之处
a. 加热法只适合于对热较稳定的目的产物； b. 极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱； c. 有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。
3. 吸附法
加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 ① 在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同 作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质； ② 在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠， 两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶 性粒子吸附并包裹在其中除去。
（1）凝聚
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层
的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。
阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：
Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+
常用的凝聚剂电解质有：
硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O（明矾）； 氯化铝 AlCl3•6H2O; 三氯化铁 FeCl3; 硫酸亚铁 FeSO4· 2O ； 7H 石灰；ZnSO4；MgCO3