甲基化与液态活检PPT精选文档
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液体活检专家共识课件
意义
液体活检具有非侵入性、实时、动态监测等优点，可用于癌症等疾病的早期筛 查、诊断、疗效评估和预后判断，以及个性化医疗和精准医学的实施。
液体活检发展历程
01
02
03
初始阶段
液体活检最初是基于蛋白 质组学、基因组学等技术 发展起来的。
技术进步
随着高通量测序、质谱等 技术的发展，液体活检的 灵敏度和特异性得到了大 幅提升。
THANKS
[ 感谢观看 ]
液体活检专家共识课件
CONTENTS 目录
• 液体活检概述 • 液体活检技术原理及流程 • 液体活检在肿瘤诊断与治疗中的应用 • 液体活检专家共识及未来展望
CHAPTER 01
液体活检概述
液体活检的定义和意义
定义
液体活检是一种通过非侵入性方式获取生物体液（如血液、尿液、唾液等）， 检测其中携带的生物标志物，以评估机体生理状态或疾病状态的方法。
液体活检可应用于癌症、神经系统疾病、免疫系统疾病等多个 领域的诊断和治疗监测。
液体活检的样本类型包括血液、尿液、脑脊液、唾液等。
液体活检的技术方法包括PCR、二代测序、蛋白质组学、代谢 组学等。
液体活检技术存在的的收集、运输、保存和处理等过程可能 会影响生物标志物的含量和活性，从而影响液体 活检的结果。
CHAPTER 03
液体活检在肿瘤诊断与治疗中的应 用
液体活检在肿瘤诊断中的应用
早期筛查
液体活检可以通过检测血液中的 肿瘤标志物、循环肿瘤细胞等， 实现肿瘤的早期筛查，提高肿瘤
的检出率。
肿瘤分型
液体活检可以分析肿瘤细胞的基因 变异、表达谱等特征，帮助确定肿 瘤的类型和亚型，为个性化治疗方 案提供依据。
临床转化
液体活检具有非侵入性、实时、动态监测等优点，可用于癌症等疾病的早期筛 查、诊断、疗效评估和预后判断，以及个性化医疗和精准医学的实施。
液体活检发展历程
01
02
03
初始阶段
液体活检最初是基于蛋白 质组学、基因组学等技术 发展起来的。
技术进步
随着高通量测序、质谱等 技术的发展，液体活检的 灵敏度和特异性得到了大 幅提升。
THANKS
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液体活检专家共识课件
CONTENTS 目录
• 液体活检概述 • 液体活检技术原理及流程 • 液体活检在肿瘤诊断与治疗中的应用 • 液体活检专家共识及未来展望
CHAPTER 01
液体活检概述
液体活检的定义和意义
定义
液体活检是一种通过非侵入性方式获取生物体液（如血液、尿液、唾液等）， 检测其中携带的生物标志物，以评估机体生理状态或疾病状态的方法。
液体活检可应用于癌症、神经系统疾病、免疫系统疾病等多个 领域的诊断和治疗监测。
液体活检的样本类型包括血液、尿液、脑脊液、唾液等。
液体活检的技术方法包括PCR、二代测序、蛋白质组学、代谢 组学等。
液体活检技术存在的的收集、运输、保存和处理等过程可能 会影响生物标志物的含量和活性，从而影响液体 活检的结果。
CHAPTER 03
液体活检在肿瘤诊断与治疗中的应 用
液体活检在肿瘤诊断中的应用
早期筛查
液体活检可以通过检测血液中的 肿瘤标志物、循环肿瘤细胞等， 实现肿瘤的早期筛查，提高肿瘤
的检出率。
肿瘤分型
液体活检可以分析肿瘤细胞的基因 变异、表达谱等特征，帮助确定肿 瘤的类型和亚型，为个性化治疗方 案提供依据。
临床转化
液体活检专家共识 ppt课件
《二代测序（NGS）技术应用于 临床肿瘤精准医学诊断的共识》
（第一版2016.04.23）
中国临床肿瘤学会 （CSCO）
中国肿瘤驱动基因分析联盟（CAGC）
ppt课件
6
国内共识推荐NGS用于临床检测
“首先我们非常清楚液体活检和NGS的哪些部分可以应用到临床，如小的PANEL可用于现
在市场上CFDA已经批准的药物的检测，这些可以应用到临床”。
ppt课件
Presented By Lecia Sequist at 2015 ASCO Annual1M4eeting
耐药机制的精准分析
• 15 AZD9291 treated pts
• 6 cases of C797S mutations (40%)
ppt课件
15
Oxnard, et al. Nat med, 2015
基因变异类别及分析技术需求 精准诊断----分子分型 耐药机制的精准分析 液态活检的应用
ppt课件
9
肺癌中已发现的驱动基因及频率
未知 29%
BRAF M+ 2% PI3K M+ 4% C-MET Amp 5$ PTENM+ 6%
EGFR M+ 40%
KRAS 7%
EML4-ALK 7%
东方： 370例中国肺腺癌
液体活检的专家共识
军事医学科学院附属医院 秦海峰
ppt课件
1
Content
基因变异类别及分析技术需求 精准诊断----分子分型 耐药机制的精准分析 液态活检的应用
ppt课件
2
Content
基因变异类别及分析技术需求 精准诊断----分子分型 耐药机制的精准分析 液态活检的应用
DNA甲基化检测 ppt课件
PPT课件 18
PPT课件
19
(３） Total input DNA样品作为模板，用待测基因特异性引物 进行 qPCR检测得到 Ct值(Input）。ChIP DNA样品作为模板， 用待测基因特异性引物进行 qPCR检测得到 Ct值(ChIP ）。样 品 ＤＮＡ 甲基化相对量（ChIP/Total input）通过以下公式计 算: ChIP/Total input=2^ [Ct(Input)-Ct(ChIP)] 通过结果可见脊髓损伤后,大鼠腓肠肌 eif5a基因 DNA甲基 化水平降低。此结果与我们之前得到的 eif5a在脊髓损伤大鼠 腓肠肌中高表达结果相吻合(图8-3）。
甲基化 DNA免疫沉淀法是一种高效富集甲基化 DNA的方法 ꎮ。在该方法中，可与 5mC特异性结合的抗体加入到变性的 基因组 DNA片段中，从而使甲基化的基因组片段免疫沉淀， 形成富集，通过与已有DNA微芯片技术相结合，从而进行 大规模DNA甲基化分析。 该方法简便、特异性高，适合 DNA甲基化组学的分析。 高密度的甲基化芯片是研究全基因甲基化状态的有力工具。
单链DNA在亚硫酸氢钠存在的条件下,能有效地将未甲 基化的脱氧 胞嘧啶(C)转化为脱氧尿嘧啶(U),随后作PCR 扩 增。此过程进一步将模板上的尿嘧啶(U),进一步转化为脱氧 胸腺嘧啶(T),而甲基化的胞嘧啶(mC)不受亚硫酸氢钠影响保 持不变。使DNA片段甲基化状态的差异转化为碱基序列的 差异，根据这种差异即可以获得目的片段的甲基化信 息.MSP法的原理是用亚硫酸氢盐处理目的 DNA,然后设计针 对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR 扩增，最后通 过琼脂糖凝胶电泳确定与引物互补的 ＤＮＡ 序列的甲基化 PPT课件 状态。
表观遗传学是一种可遗传的调节基因表达的机制。不同于 经典遗传学，表观遗传学不涉及基因序列的改变，而且表观遗 传修饰是可逆的，在基因调控中起重要作用。 DNA甲基化是表观遗传学主要调控机制之一，在维持正常 细胞功能、遗传印记、胚胎发育、染色质结构改变以及人类疾 病的发生、发展中起着重要作用。 DNA甲基化是指，在DNA甲基转移酶（DNMT)作用下以S腺苷甲硫氨酸（SAM)作为甲基供体，将甲基转移到DNA脱氧胞 嘧啶的第五位C，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的化学修饰过 程 这一过程通常发生在二核苷酸CpG中的胞嘧啶，是最常见 的哺乳动物基因组DNA后天修饰。 PPT课件
PPT课件
19
(３） Total input DNA样品作为模板，用待测基因特异性引物 进行 qPCR检测得到 Ct值(Input）。ChIP DNA样品作为模板， 用待测基因特异性引物进行 qPCR检测得到 Ct值(ChIP ）。样 品 ＤＮＡ 甲基化相对量（ChIP/Total input）通过以下公式计 算: ChIP/Total input=2^ [Ct(Input)-Ct(ChIP)] 通过结果可见脊髓损伤后,大鼠腓肠肌 eif5a基因 DNA甲基 化水平降低。此结果与我们之前得到的 eif5a在脊髓损伤大鼠 腓肠肌中高表达结果相吻合(图8-3）。
甲基化 DNA免疫沉淀法是一种高效富集甲基化 DNA的方法 ꎮ。在该方法中，可与 5mC特异性结合的抗体加入到变性的 基因组 DNA片段中，从而使甲基化的基因组片段免疫沉淀， 形成富集，通过与已有DNA微芯片技术相结合，从而进行 大规模DNA甲基化分析。 该方法简便、特异性高，适合 DNA甲基化组学的分析。 高密度的甲基化芯片是研究全基因甲基化状态的有力工具。
单链DNA在亚硫酸氢钠存在的条件下,能有效地将未甲 基化的脱氧 胞嘧啶(C)转化为脱氧尿嘧啶(U),随后作PCR 扩 增。此过程进一步将模板上的尿嘧啶(U),进一步转化为脱氧 胸腺嘧啶(T),而甲基化的胞嘧啶(mC)不受亚硫酸氢钠影响保 持不变。使DNA片段甲基化状态的差异转化为碱基序列的 差异，根据这种差异即可以获得目的片段的甲基化信 息.MSP法的原理是用亚硫酸氢盐处理目的 DNA,然后设计针 对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR 扩增，最后通 过琼脂糖凝胶电泳确定与引物互补的 ＤＮＡ 序列的甲基化 PPT课件 状态。
表观遗传学是一种可遗传的调节基因表达的机制。不同于 经典遗传学，表观遗传学不涉及基因序列的改变，而且表观遗 传修饰是可逆的，在基因调控中起重要作用。 DNA甲基化是表观遗传学主要调控机制之一，在维持正常 细胞功能、遗传印记、胚胎发育、染色质结构改变以及人类疾 病的发生、发展中起着重要作用。 DNA甲基化是指，在DNA甲基转移酶（DNMT)作用下以S腺苷甲硫氨酸（SAM)作为甲基供体，将甲基转移到DNA脱氧胞 嘧啶的第五位C，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的化学修饰过 程 这一过程通常发生在二核苷酸CpG中的胞嘧啶，是最常见 的哺乳动物基因组DNA后天修饰。 PPT课件
生物学DNA甲基化PPT课件
第35页/共71页
DNA甲基化与去甲基化
第36页/共71页
DNA甲基化的维持：两种模型
PCNA:在染 色体上滑动 UHRF1： 特异性的与 半甲基化位 点结合
第37页/共71页
表观遗传修饰的重编程
配子形成
胚 胎植入前的发育
第38页/共71页
DNA甲基化：Cell Memory
第39页/共71页
因此也叫HTF岛
第10页/共71页
C––> 5mC ––> T?
第11页/共71页
Deamination 去氨基化反应
第12页/共71页
基因组甲基化的特点：
可逆性——许多甲基化位点可以根据细胞活性的要 求重新甲基化或去甲基化；
组织特异性——不同的组织细胞具有不同的甲基化 模式，为基因表达设定程序。
第9页/共71页
CpG岛的甲基化(2)
1. CpG在重复片段以及基因的3’UTR区域能够 发生甲基化
2. CpG岛通常不被甲基化 3. 哺乳动物中：26,000-45,000 CpG岛。常分
布在持家基因和一些组织表达特异性基因的启 动子区域
4. CpG岛：可以被HpaII酶(C|CGG)切成小片段，
第45页/共71页
Dnmt 1
1. Dnmt1chip/-: Dnmt1的表达量为正 常小鼠的10%；
2. 低甲基化 3. Dnmt1chip/-小鼠
出生体重为正常的 70% 4. 80%的小鼠4-8个月 内产生淋巴瘤 5. 癌基因c-myc表达量 异常增高
第46页/共71页
Dnmt3b
1. 小鼠胚胎纤维原细 胞中的Dnmt3b失活 导致DNA的低甲基 化
第42页/共71页
DNA甲基化与去甲基化
第36页/共71页
DNA甲基化的维持：两种模型
PCNA:在染 色体上滑动 UHRF1： 特异性的与 半甲基化位 点结合
第37页/共71页
表观遗传修饰的重编程
配子形成
胚 胎植入前的发育
第38页/共71页
DNA甲基化：Cell Memory
第39页/共71页
因此也叫HTF岛
第10页/共71页
C––> 5mC ––> T?
第11页/共71页
Deamination 去氨基化反应
第12页/共71页
基因组甲基化的特点：
可逆性——许多甲基化位点可以根据细胞活性的要 求重新甲基化或去甲基化；
组织特异性——不同的组织细胞具有不同的甲基化 模式，为基因表达设定程序。
第9页/共71页
CpG岛的甲基化(2)
1. CpG在重复片段以及基因的3’UTR区域能够 发生甲基化
2. CpG岛通常不被甲基化 3. 哺乳动物中：26,000-45,000 CpG岛。常分
布在持家基因和一些组织表达特异性基因的启 动子区域
4. CpG岛：可以被HpaII酶(C|CGG)切成小片段，
第45页/共71页
Dnmt 1
1. Dnmt1chip/-: Dnmt1的表达量为正 常小鼠的10%；
2. 低甲基化 3. Dnmt1chip/-小鼠
出生体重为正常的 70% 4. 80%的小鼠4-8个月 内产生淋巴瘤 5. 癌基因c-myc表达量 异常增高
第46页/共71页
Dnmt3b
1. 小鼠胚胎纤维原细 胞中的Dnmt3b失活 导致DNA的低甲基 化
第42页/共71页
甲基化进展ppt课件
结论：本研究发现 RASSF1A 和 RARB2 基因甲基化变化可用于肺癌的诊断、疗效 评估和复发监控。
思考
1.晚期患者中小细胞肺癌甲基化与预后的关 系？
2.术后小细胞肺癌甲基化与复发的关系？ 3.小细胞肺癌甲基化与肿块大小的关系？ 4.CIMP表达状态与小细胞肺癌回顾性研究
？
谢谢
研究目的：阐明小细胞肺癌的综合基因组甲基化的临床病理特征和预后治疗的关系
研究背景：DNA甲基化相关基因沉默在人类癌症中是一种常见的事件，全球低甲基化是被认为在 原发性肺癌中染色体不稳定性增加的发生发展中发挥了重要作用。然而，启动子CPG岛的持续抑 制其下游基因局部甲基化，包括抑癌基因。CPG岛甲基化表型（CIMP）在结直肠癌、胶质母细胞 瘤、乳腺癌中呈现了DNA甲基化的特征性改变。
cfDNA甲基化检 测：204例血浆标
本诊断分类
甲基化验证：46例 血浆标本
4基因模型
方法：入组129例肺癌、ILD、COPD患者，对组 织标本进行450K芯片检测，筛选各类疾病特异性 的甲基化位点。选取204例肺癌、ILD、COPD患 者，分别收集400ul血浆，提取cfDNA，经MSRE 处理，通过qPCR筛选DNA特异性甲基化分子标志 物，建议疾病鉴别模型。
区分组 癌症组与非癌症组 肺癌组与ILD 肺癌组与COPD ILD、COPD与健康人
灵敏性 87.8%
63.1%
特异性 90.2% 88% 88% 70%
红色：肺癌 蓝色：ILD 绿色：COPD 紫色：正常
结论：cfDNA甲基化测序能够区分肺癌、ILD/COPD和健康人群。
在手术切除小细胞肺癌中CpG岛甲基化表型的预后意义
未甲基化C U 甲基化C 不变
DNA甲基化检测技术ppt课件
MS-HRM检测方法及步骤
4. DNA样本的甲基化修饰：
可使用FFPE Tissue Kit (QIAGEN) 对DNA甲基化修饰及回收；
3. PCR扩增：
a. 上样体系 b. PCR-HRM反应程序
MS-HRM检测方法及步骤
a. 上样体系：
反应体系组分(20μL) 10×PCR Buffer(15 mM mgcl2)
癌
与DNA 修复与转录激活有关 周期素依赖性蛋白激酶抑制剂
乳腺癌、卵巢癌 GIT 、头与颈部瘤、NHL、肺癌
钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶; 凋亡抑制 肺癌
E-cadherin ER GSTP1 hMLH1
MGMT P15
增强增殖、侵袭与转移 激素抵抗 失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用 缺损DNA错配修复,基因点突变
DNA甲基化的形式：
DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌 呤（7-mG）
CpG 岛（CpG Island）
在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译 区和第一个外显子区，CpG序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为 鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。
DNA甲基化与肿瘤的关系
MGMT基因在许多肿瘤中被认为是抗肿瘤药物治疗的预测标记。MGMT启 动子肿瘤特异性甲基化，可以抑制MGMT蛋白的活性，从而使得肿瘤细胞对 烷化类的抗肿瘤药物敏感，因而被广泛用于肿瘤化疗治疗。
Figure： Kaplan–Meier Estimates of Overall Survival, According to MGMT Promoter Methylation Status.
DNA甲基化及其检测ppt课件
②只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态 时，该检测方法的结果才有意；
③需要样本量大；
④存在酶消化不完全引起的假阳性的问题；
⑤不适用于混合样本。
最新课件
51
应用五：甲基化敏感性单链构象分析 （methylation specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）
最新课件
基因诊断中心郑芳实验41 室
甲基化特异性PCR
优点： ①操作简便； ②敏感性高。 缺点： ①引物设计要求高； ②只能作定性研究； ③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性； ④只能了解部分位点的甲基化状态。
最新课件
42
应用四：结合重亚硫酸盐的限制性 内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)
最新课件
70
焦磷酸测序法（Pyrosequencing）
•是由4种酶DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶催化的同一反 应体系中的酶级联化学发光反应
•每一轮测序反应体系中只加入一种dNTP。如果该dNTP与模板配对，则会在DNA聚合 酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的 dNTP和释放的PPi是等量的
注：左图DNA无甲基化, DNA被切断, 无法得到PCR产物; 右图DNA有甲基化,
DNA保持完整,可以获得PCR产物.
最新课件
基因诊断中心郑芳实4验7 室
本课题组应用举例二：
采用甲基化敏感性限制性内切酶技 术结合PCR的方法（MSRE-PCR） 筛选在肝癌与癌旁组织中有甲基化 差异的基因。
最新课件
存在很大差异。
③需要样本量大；
④存在酶消化不完全引起的假阳性的问题；
⑤不适用于混合样本。
最新课件
51
应用五：甲基化敏感性单链构象分析 （methylation specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）
最新课件
基因诊断中心郑芳实验41 室
甲基化特异性PCR
优点： ①操作简便； ②敏感性高。 缺点： ①引物设计要求高； ②只能作定性研究； ③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性； ④只能了解部分位点的甲基化状态。
最新课件
42
应用四：结合重亚硫酸盐的限制性 内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)
最新课件
70
焦磷酸测序法（Pyrosequencing）
•是由4种酶DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶催化的同一反 应体系中的酶级联化学发光反应
•每一轮测序反应体系中只加入一种dNTP。如果该dNTP与模板配对，则会在DNA聚合 酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的 dNTP和释放的PPi是等量的
注：左图DNA无甲基化, DNA被切断, 无法得到PCR产物; 右图DNA有甲基化,
DNA保持完整,可以获得PCR产物.
最新课件
基因诊断中心郑芳实4验7 室
本课题组应用举例二：
采用甲基化敏感性限制性内切酶技 术结合PCR的方法（MSRE-PCR） 筛选在肝癌与癌旁组织中有甲基化 差异的基因。
最新课件
存在很大差异。
《解读DNA甲基化》幻灯片
中国测序论坛
影响DNA甲基化的因素
1、DNA甲基转移酶（DNMT）
2、组蛋白甲基化 3、RNA干扰
中国测序论坛
1、DNA甲基转移酶〔DNMT〕
• DNA甲基化是由DNMT催化完成的，哺乳动物细胞中有活性的 DNMT有3种，他们是DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。
• 甲基化形式的遗传是通过维持型甲基化酶DNMT1；甲基化形式的改 变那么是通过重新甲基化酶DNMT3a和DNMT3b，两类酶确保了在 生命过程中既相对稳定又可适时调节的表观遗传学遗传，在胚胎发育 中起重要作用。
中国测序论坛
5、DNA甲基化与肿瘤
• 肿瘤细胞的特征：
癌基因低甲基化 ——被激活；
抑癌基因高甲基化 ——被沉默
肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体的 甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。
•
低甲基化可诱导原癌基因和转座子成分活化，基因印迹缺失以
及染色体不稳定性增加，最终诱发肿瘤
•
在整体低甲基化的水平下，某些抑癌基因发生高甲基化，导致
a) 研究证明细菌DNA复制起始与DNA甲基化以及 DNA与细菌质膜的相互作用有关。DNA便甲基化 作为一种标签决定了复制起始点与细胞膜的结合， 控制了复制起始，使得DNA复制与细胞分裂保持一 致。
b) DNA错配修复〔mismatch repair〕作为细胞增殖 过程中纠正DNA复制错误的重要手段，对保证 DNA复制的忠实性与基因组的稳定性起重要作用。 复制后双链DNA在短期内〔数分钟〕保持半甲基化 状态，错配修复系统从而能够区分“旧链〞与“新 链’〞，为校正新链中掺入的错误碱基提供了理想
• DNMT1和DNMT3b共同维持DNA甲基化和基因沉默。
DNA甲基化课件
MGMT）是一种高效修复酶，能修复DNA序 列中6-氧-甲基鸟嘌呤损伤，对维持基因组 的稳定性有重要意义，该基因的表达缺失 可以导致肺癌的发生发展，其启动子区甲 基化是MGMT去表达的重要机制。
Tumor suppressor genes 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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DNA甲基化和CpG Islands
• DNA甲基化能关闭某些 基因的活性，去甲基化 则诱导了基因的重新活 化和表达。
• CpG岛通常位于基因的
DNA甲基化与肺癌的早期诊断
• 于DNA甲基化出现在几乎所有肿瘤中，并 且发生在癌前病变和癌变早期，因此是肿 瘤早期诊断的理想标志物。
• DNA甲基化改变常发生于肿瘤形成过程， 包括全基因组水平DNA低甲基化和CpG岛 高甲基化。
• 抑癌基因的失活是肿瘤发生的重要分子基 础。
Tumor suppressor genes 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 correlated with NSCLC
检测标本
• 3.支气管灌洗液中DNA甲基化的检测
同痰液类似，支气管灌洗液 （bronchoalveolar lavage, BAL）来源于肺 的特定肺叶，可能含有肺癌细胞或者DNA 可用于肺癌早期诊断。
• 4. 呼出气冷凝液中DNA甲基化的检 测
呼出气冷凝液（exhaled breath condensate, EBC）中除了大部分水蒸气外，
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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DNA甲基化和CpG Islands
• DNA甲基化能关闭某些 基因的活性，去甲基化 则诱导了基因的重新活 化和表达。
• CpG岛通常位于基因的
DNA甲基化与肺癌的早期诊断
• 于DNA甲基化出现在几乎所有肿瘤中，并 且发生在癌前病变和癌变早期，因此是肿 瘤早期诊断的理想标志物。
• DNA甲基化改变常发生于肿瘤形成过程， 包括全基因组水平DNA低甲基化和CpG岛 高甲基化。
• 抑癌基因的失活是肿瘤发生的重要分子基 础。
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检测标本
• 3.支气管灌洗液中DNA甲基化的检测
同痰液类似，支气管灌洗液 （bronchoalveolar lavage, BAL）来源于肺 的特定肺叶，可能含有肺癌细胞或者DNA 可用于肺癌早期诊断。
• 4. 呼出气冷凝液中DNA甲基化的检 测
呼出气冷凝液（exhaled breath condensate, EBC）中除了大部分水蒸气外，
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液体活检PPT学习课件
A， B， ， ． S0421：a
2014 32(11)：1136-1142．
L， T， Y， ． ： ” ”?． J ．2012，24：403-407．
•18
的研究方法
, , , . : , . & .2014; 141:209–221. 19
研究方法（1）
系统是唯一经批准进入临床应用的检测方案。 原理：抗体标识的微磁珠从全血中捕获细胞，用免疫荧光 识45−进行磁性分离。
据。
监测基因表达／突变，找到药物敏感的靶 点，指导个体化治疗
•17
优化治疗方案
2014年，接受多西他赛联合阿曲生坦治疗的转移性去势抵抗性前 列腺癌患者，基线循环肿瘤细胞数量可预测预后，3周时升高提示总生 存较差，有望作为重新指导和优化治疗的较好指标。
2012年,乳癌患者在接受化疗（白蛋白结合型紫杉醇+卡培他滨 +曲妥珠单抗）前后变化。 治疗前： 3，2+； 1疗程： 0。 6疗程：病理学 。 证实值在乳腺癌治疗早期发生显著变化，能够准确预示疗效，能 够科学指导选择治疗方案。
. ,2013,52(110) 21083-21088.
24
的分离方法（1）
, , , . : , . & .2014; 141:209–221. 25
的分离方法（2）-体外培养
：： ；67：； 45 ：； ： .
, ,,. . . 2014 ; 345(6193): 216–220.
26
研究概况
物，可以被定性、定量和追踪。
• :来源于肿瘤细胞的，属于的一种类型。不同患 者的水平差异显著，受肿瘤负荷，分期等因素的 影响
•5
&
a . . 2015,112–123
PAX甲基化ppt课件
有相关性（P ＜ 0.05）。精选课件ppt
25
数据：
通过 PAX1 基因甲基化水平鉴别诊断宫颈癌和 CIN，结果显示其
ROC 曲线下面积为 0.88（P ＜精选课0件.0pp0t 1），具有较高的诊断能力。
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ROC曲线指受试者工作特征曲线(receiver operating
characteristic curve), 是反映敏感性和特异性连续变量的综合 指标,是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系，它通过将连 续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和 特异性，再以敏感性为纵坐标、（1-特异性）为横坐标绘制成 曲线，曲线下面积越大，诊断准确性越高。在ROC曲线上，最 靠近坐标图左上方的点为敏感性和特异性均较高的临界值。
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数据：
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数据：
结论
由qMSP（定量甲基化特异性聚合酶链 反应）检测到的甲基化水平ΔCp作为控 制，以验证该方法的准确性，由图可知， 金纳米粒子标记的方法结果与使用由 qMSP检测到的甲基化水平的结果相似
精选课件ppt
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数据：
结论：由qMSP检测到的甲基化水平 ΔCp作为控制，以验证该方法的准确性， 由图可知，金纳米粒子标记的方法结果 与使用由qMSP检测到的甲基化水平的结 果相似
二．宫颈组织中PAxl甲基化水平
Lim等的研究结果显示，PAxl基 因的甲基化水平随着宫颈病变程度的 加深而逐渐增加。在正常宫颈组织及 低度鳞状上皮内病变(LSIL)中PAXl的甲 基化水平是2％，高度鳞状上皮内病 变(HSIL)中为41％，鳞状细胞癌(scc) 中是90％。
xu等研究显示，PAxl在宫颈癌组 织中的甲基化阳性率可达87.5％，且 随病情的演变呈现明显的上升趋势。
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DNA甲基化检测方法
• 基于芯片：illumina和Agilent
• 二代测序平台： • whole-genome bisulfite sequencing (WGBS) • Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS)
*注 RRBS：利用限制性内切酶对基因组进行酶切，可以极大幅度的提高CpG区域的测序深度， 与全基因组甲基化测序相比，测序量将大大减少，并在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域 达到更高精度的分辨率
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使用MHB及MHL进行cfDNA分析
基于MHL，癌症细胞与正常体细胞存在明显不 同的pattern
选取的用于后续分析的区域： 1. High MHL in solid tissues from patients 2. Low MHL in health people 3. Group II region
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使用MHB及MHL进行cfDNA分析
基于MHL的分析方法具有更高的信噪比
估算的cancer-DNA的载荷
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使用MHB及MHL进行cfDNA分析
癌症样本中，有明显的tissue-specific MHL 信号
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使用MHB及MHL进行cfDNA分析
基于HMB的样本起源预测
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使用MHB及MHL进行cfDNA分析
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基于MHL进行定量分析
• 基于MHL进行聚类，显著区分不同细胞来源，且优于别的定量方法MHB及MHL进行cfDNA分析
• 数据来源：Single-cell RRBS • Biomarker：cancer-associated highly methylated haplotypes (caHMHs) • Cancer DNA载荷分析：deconvolution analysis （基于simulation data）
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文献内容
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数据分析总概
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数据分析总概
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重要前提条件
• 甲基化具有细胞特异性 • 甲基化单倍型（methylation haplotype block，MHB）能够有效提
高分辨率
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鉴定MHB
• 共鉴定出147,888 个MHB • R2 约等于1 • 在癌症样本中，相比于其它样本，MHB中CpG 紧密度明显下降
Identification of methylation haplotype blocks aids in deconvolution of heterogeneous tissue samples and tumor tissue-of-origin mapping from plasma DNA
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DNA甲基化与肿瘤
•肿瘤细胞的特征： 癌基因低甲基化 ——被激活； 抑癌基因高甲基化 ——被沉默
•肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体的甲基化水 平降低与局部的甲基化水平升高。 • 低甲基化可诱导原癌基因和转座子成分活化，基因印迹缺失以及 染色体不稳定性增加，最终诱发肿瘤
•在整体低甲基化的水平下，某些抑癌基因发生高甲基化，导致基因 沉默，对肿瘤抑制能力低下 •甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，DNA甲基化水平越低，染 色体越容易发生功能异常，肿瘤的浸润能力就越高，临床分期也愈5
1
文章主要内容
使用甲基化测序解决两个液态活检中两个重要问题：
•肿瘤的异质性 •肿瘤的来源问题 •估算肿瘤细胞载荷
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背景知识
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甲基化测序
• 亚硫酸盐洗脱：C C（甲基化）C U T（未甲基化）
• DNA甲基化的生物学功能: ➢ DNA甲基化与遗传物质的稳定性 ➢ DNA甲基化与基因表达调控 ➢ DNA甲基化与表观遗传学 ➢ DNA甲基化与胚胎发育 ➢ DNA甲基化与肿瘤
使用构建的模型（RF count-based），能够准确的预测样本中癌症的起源
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（94.8% 91.2% 87.8%）
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鉴定MHB
• 一个MHB示例
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鉴定MHB
• HMB中，CpG的紧密度呈现下降趋势
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鉴定MHB
• HMB在基因组上分布区域
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鉴定MHB
• HMB在基因组富集区域
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基于MHL进行定量分析
• 概念：MHL，methylation haplotype load，用一个矩阵，表现在一个MLB中，不同 的CpG岛的甲基化模式