4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制

思考题
1.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点， 如何控制？
2.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。 3.简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产 率的意义。
二、柠檬酸及其盐的应用概况
食品工业：酸味剂、增溶剂、抗氧化剂，除腥脱 臭剂； 医药工业：
化学工业： 美容品、化妆品
三、我国柠檬酸生产现状 生产状况： 60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界
第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前，生产 厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原生物 化学集团公司（生产能力为12.0万吨/年）、江苏无锡罗氏 中亚柠檬酸有限公司（生产能力为4.0万吨/年）、安徽华 源生物药业有限公司（生产能力为3.5万吨/年）等。
2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。
3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰CoA
（二）三羧酸循环的调节
1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个 酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。 2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节： 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸 正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线 粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡： 柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。 顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬 酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L， 铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵 中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。
(三)氧对柠檬酸积累的调节
乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一 个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它 对柠檬酸发酵的作用为： (1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。 (2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链 以外，还有一条侧系呼吸链。

硫是含硫氨基酸的组成成分，构成酶的活性基团。培养基 中的硫酸镁供应的硫已充足，不需另加。
3. 钾盐
许多酶的激活剂,钾盐少长菌体，钾盐足够产谷氨酸。 谷氨酸发酵产物生成期需要的钾盐比菌体生长期高。
菌体生长期需硫酸钾量约为0.1g/L,谷氨酸生成期需硫酸钾量
为0.2－1.0g/L.
4. 微量元素
添加方式：
铵盐、液氨等可采取流加方法，液氨作用快，采取连续流加， 尿素少量多次分批流加。 用硫酸铵等生理酸性盐为氮源时，由于铵离子被利用而残留 SO42-等酸根，使PH下降，需在培养基中加入碳酸钙以自动中 和pH。但添加碳酸钙易形成污染，生产上一般不用此法。
三、无机盐

功能
构成菌体成分、酶的组成成分、酶的激活剂或抑制剂、


斜面菌种的培养 目的：纯菌生长繁殖 措施：多含有机氮，不含或少含糖 一级种子培养
目的：大量繁殖活力强的菌体 措施：少含糖分，多含有机氮，培养条件有利于长菌。

二级种子培养
目的：获得发酵所需的足够数量的菌体
为发酵培养基的配制原则
供给菌体生长繁殖和谷氨酸生产所需要的适量的营养和能源 原料来源丰富，价格便宜，发酵周期短，对产物提取无妨碍等。
酶活
改变生物合成途径，使代谢产物发生变化
改变发酵液物理性质 影响菌种对营养物的分解与吸收
5.
6.
不同微生物的最适生长温度不同
同一种微生物，菌体生长和产物合成的最适温度不一定相同。

谷氨酸生产菌的最适生长温度为30-34℃,T6-13菌 株比较耐高温，斜面、一级、二级种子和发酵开始 温度可选用33-34 ℃,生产谷氨酸的最适温度为3537℃. 谷氨酸温度敏感菌株1021最适生长温度是30 ℃， 最适产谷氨酸温度38 ℃,发酵过程中采用分段控制。

发酵⼯程章节复习资料第⼀章绪论1、发酵及发酵⼯程的概念1、传统发酵最初发酵是⽤来描述酵母菌作⽤于果汁或麦芽汁产⽣⽓泡的现象，或者是指酒的⽣产过程。

2、⽣化和⽣理学意义的发酵指微⽣物在⽆氧条件下，分解各种有机物质产⽣能量的⼀种⽅式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电⼦受体的氧化还原产能反应。

如葡萄糖在⽆氧条件下被微⽣物利⽤产⽣酒精并放出CO2。

3、⼯业上的发酵泛指利⽤微⽣物制造或⽣产某些产品的过程包括：1. 厌氧培养的⽣产过程，如酒精，乳酸等。

2. 通⽓（有氧）培养的⽣产过程，如抗⽣素、氨基酸、酶制剂等。

产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。

发酵⼯程（Fermentation Biotechnology）: 应⽤微⽣物学等相关的⾃然科学以及⼯程学原理，利⽤微⽣物等⽣物细胞进⾏酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的⼀门科学。

2、发酵⼯程技术的发展⼤致可分为哪⼏个阶段，每段的技术特点是什么？1. ⾃然发酵时期:嫌⽓性发酵⽤于酒类酿造，好⽓性发酵⽤于酿醋、制曲。

2. 纯培养技术的建⽴：⼈⼯控制环境条件使发酵效率迅速提⾼。

3.通⽓搅拌好⽓发酵过程技术的建⽴：从分解代谢转为⽣物合成代谢，可以利⽤微⽣物合成积累⼤量有⽤的代谢产物。

4.⼈⼯诱变育种与代谢控制发酵⼯程技术的建⽴：遗传⽔平上控制微⽣物代谢。

5. 发酵动⼒学、发酵⼯程连续化、⾃动化⼯程：以数学、动⼒学、化⼯原理等为基础，通过计算机实现发酵过程的⾃动化控制的研究，使发酵过程的⼯艺控制更为合理。

6. 微⽣物酶反应⽣物合成与化学合成反应结合⼯程技术：可⽣产许多过去不能⽣产的有⽤物质。

3、发酵⼯业的应⽤范围1. 酿酒⼯业（啤酒、葡萄酒、⽩酒）2. ⾷品⼯业（酱、酱油、⾷醋、腐乳、⾯包、乳酸）3. 抗⽣素⼯业（青霉素、链霉素、⼟霉素）4. 有机酸⼯业（柠檬酸、葡萄糖酸）5. 酶制剂⼯业（淀粉酶、蛋⽩酶）6. 氨基酸⼯业（⾕氨酸、赖氨酸）7. 核苷酸发酵⼯业(肌苷酸、肌苷)8. 有机溶剂⼯业（酒精、丙酮）9. 维⽣素⼯业(VB2、VB12)10.⽣物能源⼯业（沼⽓、⽣物柴油）11.环境保护产业（废⽔⽣物处理）12.⽣理活性物质发酵⼯业（激素）13. 冶⾦⼯业(微⽣物探矿、⽯油脱硫)14.微⽣物菌体蛋⽩发酵⼯业（酵母、单细胞蛋⽩）4、发酵⼯业的特点与化学⼯程相⽐，发酵⼯程具有以下特点：1、发酵过程是极其复杂的⽣物化学反应，与微⽣物细胞息息相关2、通常在常温常压下进⾏，反应安全，需求条件也⽐较简单3、发酵醪（包括固相、液相、⽓相，还含有活细胞体或菌丝体），属⾮⽜顿流体，其特性影响因素很多，对发酵⼯程都有关联4、具有严格的灭菌系统，以防⽌杂菌污染如空⽓除菌系统、培养基灭菌系统、设备的冲洗灭菌等5、反应以⽣命体的⾃动调节⽅式进⾏，因此数⼗个反应过程能够像单⼀反应⼀样，在同⼀发酵罐内进⾏6、后处理阶段，为了适应菌体与发酵产物的特点，需采取⼀些特殊的⼯艺措施并选⽤合适的设备。

1）生物素营养缺陷型⏹作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外泄漏.⏹控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10 g/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换.2）油酸营养缺陷型⏹作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右.⏹控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换.（3）添加表面活性剂⏹添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨酸.⏹机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜.⏹关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下进行分裂,形成产酸型细胞.（4）添加青霉素⏹机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸.⏹控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换.谷氨酸发酵强制控制工艺⏹为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取“强制控制”的方法,如:“高生物素高吐温”或“高生物素高青霉素”的方法.⏹控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料中生物素含量变化的影响,高生物素、大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产。

谷氨酸发酵⏹ 1.适应期:尿素分解出氨使pH上升.糖不利用.2-4h.措施:接种量和发酵条件控制使适应期缩短.⏹ 2.对数生长期:糖耗快,尿素大量分解使pH上升,氨被利用pH又迅速下降.溶氧急剧下降后维持在一定水平.菌体浓度迅速增大,菌体形态为排列整齐的八字形.不产酸.12h.措施:及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH,在pH7.5-8.0时流加尿素;维持温度30- 32℃⏹ 3.菌体生长停止期:谷氨酸合成.措施:提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4.大量通**,控制温度34-37 ℃.⏹ 4.发酵后期:菌体衰老,糖耗慢,残糖低.措施:营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐.发酵周期一般为30h.二、谷氨酸发酵的生化过程⏹（1）是代谢控制发酵的典型代表⏹（2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的……⏹整个过程可简单的分为2 个阶段:➢第1阶段是菌体生长阶段;➢第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量积累。

1）生物素营养缺陷型⏹作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外泄漏.⏹控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10 g/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换.2）油酸营养缺陷型⏹作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右.⏹控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换.（3）添加表面活性剂⏹添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨酸.⏹机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜.⏹关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下进行分裂,形成产酸型细胞.（4）添加青霉素⏹机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸.⏹控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换.谷氨酸发酵强制控制工艺⏹为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取“强制控制”的方法,如:“高生物素高吐温”或“高生物素高青霉素”的方法.⏹控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料中生物素含量变化的影响,高生物素、大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产。

谷氨酸发酵⏹ 1.适应期:尿素分解出氨使pH上升.糖不利用.2-4h.措施:接种量和发酵条件控制使适应期缩短.⏹ 2.对数生长期:糖耗快,尿素大量分解使pH上升,氨被利用pH又迅速下降.溶氧急剧下降后维持在一定水平.菌体浓度迅速增大,菌体形态为排列整齐的八字形.不产酸.12h.措施:及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH,在pH7.5-8.0时流加尿素;维持温度30- 32℃⏹ 3.菌体生长停止期:谷氨酸合成.措施:提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4.大量通**,控制温度34-37 ℃.⏹ 4.发酵后期:菌体衰老,糖耗慢,残糖低.措施:营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐.发酵周期一般为30h.二、谷氨酸发酵的生化过程⏹（1）是代谢控制发酵的典型代表⏹（2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的……⏹整个过程可简单的分为2 个阶段:➢第1阶段是菌体生长阶段;➢第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量积累。

④沿着由柠檬酸至α–酮戊二酸的氧化途径，谷氨酸产 生菌有两种NADP专性脱氢酶，即异柠檬酸脱氢酶和L谷氨酸脱氢酶。 在谷氨酸的生物合成中，谷氨酸脱氢酶和异柠檬 酸脱氢酶在铵离子存在下，两者非常密切地偶联起 来，形成强固的氧化还原共轭体系，不与NADPH2 的末端氧化系相连接，使α–酮戊二酸还原氨基化生 成谷氨酸。
2．三羧酸循环(TCA循环)的调节
谷氨酸产生菌在代谢途径中，三羧酸循环的调节主要 是通过5种酶的调节进行的。这五种酶是磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢 酶和α-酮戊二酸脱氢酶。
草酰乙酸+谷氨酸
谷氨酸转氨酶
天冬氨酸+α -酮戊二酸
谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后， 谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力并阻遏柠檬酸合成酶 的合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。
在谷氨酸发酵生产中，生物素缺陷型菌在 NH4+存在时，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率 高； NH4+不存在时，葡萄糖消耗速率很慢，生 成物是α–酮戊二酸、丙酮酸等物质，不产生谷氨 酸。
四、细胞膜通透性的调节
对谷氨酸发酵的重要性： 当细胞膜转变为有利于谷 氨酸向膜外渗透的方式， 谷氨酸才能不断地排出细 胞外，这样既有利于细胞 内谷氨酸合成反应的优先 性、连续性，也有利于谷 氨酸在胞外的积累。
4．CO2固定反应的调节
CO2固定反应主要通过以下途径完成：
C02的固定反应的作用：补充草酰乙酸； 在谷氨酸合成过程中，糖的分解代谢途径与C02固定 的适当比例是提高谷氨酸对糖收率的关键问题。
5．NH4+的调节
谷氨酸脱氢酶也能催化谷氨酸氧化脱氨反应，脱 氨过程以NAD+作为辅酶，该酶催化的反应虽然偏向 氨合成谷氨酸一边，但是脱氢过程产生的NADH被氧 化成NAD+，同时产生的NH3很容易被除去。 脱氨反应被NH4+和α–酮戊二酸所抑制，这对于谷 氨酸的积累也起到了很好的作用。

理想的发酵按如下反应进行:
• C6H12O6+NH3+1.5O2──C6H9O4N+CO2+3H2 O
谷氨酸发酵的代谢途径:
谷氨酸生产菌的育种思路 :
第二章 谷氨酸发酵机制
谷氨酸生产菌的具体育种思路
1.切断或减弱支路代谢 2.解除自身的反馈抑制 3.增加前体物的合成 4.提高细胞膜的渗透性 5.强化能量代谢 6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌 株
谷氨酸发酵机制
谷氨酸的生物合成途径:
在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要酶反应有以下 三种: 1.谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反 应. 2.转氨酶(AT)催化的转氨反应. 3.谷氨酸合成酶（GS）催化的反应.
葡萄糖生物合成谷氨酸理想途径:
• 在谷氨酸发酵时,糖酵解经过EMP及HMP两 个途径进行,生物素充足菌HMP所占比例是 38%,控制生物素亚适量的结果,发酵产酸 期,EMP所占的比例更大,HMP所占比例约为 26%
三）乙醛酸循环的作用
• 由于三羧酸循环的缺陷，在谷氨酸发酵的菌体生长期，需要异柠檬酸裂 解酶催化反应，走乙醛酸循环途径。 乙醛酸循环中生成的四碳二羧酸可返回三羧酸循环，乙醛酸循环途径可 看作三羧酸循环的支路和中间产物的补给途径。 若二氧化碳固定反应完全不起作用，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的催化作用 下，脱氢脱羧全部氧化成乙酰CoA，通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸。 当以葡萄糖为碳源时，二氧化碳固定反应与乙醛酸循环的比率对谷氨酸 产率有影响，乙醛酸循环活性越高，谷氨酸生成收率越低。因此，在糖质原 料发酵生产谷氨酸时，应尽量控制通过二氧化碳固定反应供给四碳二羧酸。
第二章 谷氨酸发酵机制
第三节 谷氨酸发酵中如何控制细胞膜 的渗透性

第二节 柠檬酸生物合成的代谢调节
柠檬酸是重要的代谢调节因子,正常细胞中 柠檬酸不积累，但黑曲霉可积累。
一、糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1.在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶 （PFK）有抑制作用，而AMP、无机磷、 NH4+对 该酶则有激活作用，特别是NH4+还能解除柠檬酸、 ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。 微生物体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的 这种反馈抑制作用，在较高的NH4+的浓度下，细 胞可以大量形成柠檬酸，那么NH4+ 浓度是如何 升高的呢？
2.进一步的研究表明，柠檬酸产生菌—— 黑曲霉如果生长在Mn+ 缺乏的培养基中， NH4+浓度异常的高，可达到25mmol/L， 显然，由于Mn+的缺乏，使得微生物体内 NH4+浓度升高，进而解除了柠檬酸对PFK 活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不断 的合成大量的柠檬酸。 缺乏如何会使NH4+浓度升高呢？ NH4+浓度升高呢 Mn+ 缺乏如何会使NH4+浓度升高呢
目前，我国柠檬酸行业从产量上位居世 界第一，从技术上，在国际上也是处于世界 领先水平，并远远领先于其他国家，其优势 在于： 1.我国的柠檬酸发酵采用的菌种（黑曲霉） 具有双重功能，当淀粉原料被液化后，即可 进行发酵，不需要将淀粉水解成葡萄糖，简 化了生产工艺，降低了生产成本。
2.尽管采用边糖化边发酵的工艺，但发酵周 期只有64小时，生产周期比国外的单边发酵周期 还要短。 3.柠檬酸的产酸速度大大地高于国外水平。 平均产酸速率是国外的2 倍。 柠檬酸合成途径： 氧化脱羧 丙 乙酰COA EMP 葡萄糖 酮 酸 羧化 草酰乙酸
二、TCA循环的调节： TCA循环的调节： 循环的调节 1.TCA环的起始酶 环的起始酶： 1.TCA环的起始酶： 柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中， 柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠 檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA TCA环的第一 檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一 个特点。 个特点。 2.顺乌头酸酶活性的控制 顺乌头酸酶活性的控制: 2.顺乌头酸酶活性的控制: 该酶的丧失或失活是阻断TCA TCA循环大量生成柠檬 该酶的丧失或失活是阻断TCA循环大量生成柠檬 酸的必要条件。 酸的必要条件。通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本 身就要求很弱，但在发酵过程中仍需要控制它的活性。 身就要求很弱，但在发酵过程中仍需要控制它的活性。 由于该酶的活性受到Fe2+ 的影响， 由于该酶的活性受到Fe2+ 的影响，控制培养基中的 的浓度，可以使该酶失活。 Fe2+ 的浓度，可以使该酶失活。 3.第二个特点 黑曲霉菌体内α 第二个特点： 3.第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失 或活力很低（TCA环被阻断），被葡萄糖和 环被阻断），被葡萄糖和NH4+ 抑制。 抑制。 或活力很低（TCA环被阻断），被葡萄糖和 4.氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大 氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。 4.氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。

2.2.1 优先合成与反馈调节
黄色短杆菌的谷氨酸代谢调节机制如图 2-3所示，以它为例说明以葡萄糖为原料生物 合成谷氨酸主要存在的代谢调节方式。
图2-3 黄色短杆菌谷氨酸的代谢调节机制
1-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；2-柠檬酸合成酶；3-异柠檬酸脱氢酶； 4-α-酮戊二酸脱氢酶；5-谷氨酸脱氢酶
(1)优先合成
(2)谷氨酸脱氢酶活性强
谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶活性都很 强。该酶以NADP+为专一性辅酶，谷氨酸发酵 的氨同化过程，是通过连接NADP+的L-谷氨酸 脱氢酶催化完成的。沿着由柠檬酸至α-酮戊二 酸的氧化途径，谷氨酸产生菌有两种NADP+专 性脱氢酶，即异柠檬酸脱氢酶和L-谷氨酸脱氢 酶。
在谷氨酸生物合成中必须有谷氨酸脱氢
由于1mol葡萄糖可以生成1mol的谷氨酸，因此理 论糖酸转化率为81.7%(147/180×100%=81.7%)。
上式中四碳二羧酸(草酰乙酸)100%通过CO2 固定反应供给。
2.1.3 谷氨酸发酵的代谢途径
葡萄糖生成丙酮酸后，一部分氧化脱 羧生成乙酰CoA，一部分固定CO2生成草 酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰CoA在 柠檬酸合成酶催化下缩合成柠檬酸，再经 氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸。
当以葡萄糖为碳源时，CO2固定反应与 乙醛酸循环的比率对谷氨酸产率有显著影 响，乙醛酸循环活性越高，谷氨酸生成收 率越低。因此，在糖质原料发酵生产谷氨 酸时，应尽量通过CO2固定反应供给四碳二 羧酸，减弱乙醛酸循环。
2.2 谷氨酸生物合成的调节机制
谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型，谷 氨酸发酵时通常控制生物素亚适量，引起代 谢失调，使谷氨酸得以积累。
谷氨酸的分泌可降低细胞内产物的浓度， 消除了谷氨酸转化成其它代谢物的可能，减低 了对谷氨酸脱氢酶的抑制，并使谷氨酸的生成 途径畅通。由生物素亚适量可造成细胞膜对产 物的高通透性。生物素改变细胞膜通透性的机 制与影响细胞膜磷脂的含量及成分有关。还可 通过添加表面活性剂、高级饱和脂肪酸或青霉 素等控制细胞膜对谷氨酸的通透性。通过选育 温度敏感突变株、油酸缺陷型或甘油缺陷型等 突变株也可控制细胞膜对谷氨酸的通透性 。

3、Patience is bitter, but its fruit is sweet. (Jean Jacques Rousseau , French thinker)忍耐是痛苦的，但它的果实是甜蜜的。10:516.17.202110:516.17.202110:5110:51:196.17.202110:516.17.2021
4、All that you do, do with your might; things done by halves are never done right. ----R.H. Stoddard, American poet做一切事都应尽力而为，半途而废永远不行6.17.20216.17.202110:5110:5110:51:1910:51:19
第二篇 发酵机制
3. α-酮戊二酸脱氢酶：黑曲霉α-酮戊二酸 脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断）。
第四章 柠檬酸发酵机制
第二篇 发酵机制
第四章 柠檬酸发酵机制
磷酸烯醇丙糖
CO2
CO2
丙酮酸
乙酰CoA
CO2 草酰乙酸
柠檬酸
苹果酸
Fe2+ 顺乌头酸
富马酸
异柠檬酸
琥珀酸
Α-酮戊二酸
Α-酮戊二酸脱氢酶
第二篇 发酵机制 二、柠檬酸生物合成的代谢调节
（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节 1.铵离子能够解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖
激酶的抑制作用，对该酶表现出激活作用； 铵离子的浓度与柠檬酸生成速度、积累有密 切关系，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬 酸产量；
9、要学生做的事，教职员躬亲共做； 要学生 学的知 识，教 职员躬 亲共学 ；要学 生守的 规则， 教职员 躬亲共 守。21.7.1421.7.14Wednesday, July 14, 2021 10、阅读一切好书如同和过去最杰出 的人谈 话。01:15:5601:15:5601:157/14/2021 1:15:56 AM 11、一个好的教师，是一个懂得心理 学和教 育学的 人。21.7.1401:15:5601:15Jul- 2114-J ul-21 12、要记住，你不仅是教课的教师， 也是学 生的教 育者， 生活的 导师和 道德的 引路人 。01:15:5601:15:5601:15Wednesday, July 14, 2021 13、He who seize the right moment, is the right man.谁把握机遇，谁就心想事成 。21.7.1421.7.1401:15:5601:15:56Jul y 14, 2021 14、谁要是自己还没有发展培养和教 育好， 他就不 能发展 培养和 教育别 人。2021年7月 14日星 期三上 午1时15分56秒01:15:5621.7.14 15、一年之计，莫如树谷；十年之计 ，莫如 树木； 终身之 计，莫 如树人 。2021年7月上 午1时15分21.7.1401:15Jul y 14, 2021 16、提出一个问题往往比解决一个更 重要。 因为解 决问题 也许仅 是一个 数学上 或实验 上的技 能而已 ，而提 出新的 问题， 却需要 有创造 性的想 像力， 而且标 志着科 学的真 正进步 。2021年7月14日星期 三1时15分56秒01:15:5614 July 2021 17、儿童是中心，教育的措施便围绕 他们而 组织起 来。上 午1时15分56秒 上午1时15分01:15:5621.7.14

第四章谷氨酸发酵的代谢与控制⏹氨基酸是生物体不可缺少的营养成分之一，因此，氨基酸的生产和应用受到了人们的重视。

⏹氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵，也就是说发酵的关键在于其控制机制是否能被解除，能否打破微生物的正常代谢调节，人为地控制发酵。

⏹谷氨酸参与许多代谢过程，具有较高的营养价值。

谷氨酸发酵目前研究得较为透彻。

4.1谷氨酸合成途径谷氨酸产生菌菌体内形成谷氨酸的方式：（1）还原氨基化作用NH4+和供氢体存在的条件下，α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下形成谷氨酸（2）氨基转移作用在氨基转移酶的催化作用下，除甘氨酸外，任何一种氨基酸都可与α-酮戊二酸作用，使α-酮戊二酸转化成谷氨酸。

4.2谷氨酸生物合成的调节机制4.2.1 优先合成与反馈调节4.2.2生物素的调节⏹生物素是羧化和转羧化反应的辅酶，在代谢过程中起CO2载体的作用。

⏹生物素充足: 糖酵解速度显著提高，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出。

生物素限量:丙酮酸的有氧氧化减弱，则乙酰辅酶A的生成量减少，乙酸浓度降低，琥珀酸氧化能力降低而积累。

导致乙醛酸循环基本上封闭。

4.3谷氨酸发酵的代谢控制育种⏹菌体生长期：为获得能量和产生生物合成反应所需的中间产物，需要异柠檬酸裂解酶反应，走乙醛酸循环途径。

⏹谷氨酸生成期：为了积累谷氨酸，最好没有异柠檬酸裂解酶反应，封闭乙醛酸循环。

⏹依据谷氨酸生物合成途径及代谢调节机制，谷氨酸发酵的代谢控制育种可从如下五个方面着手：进、通、节、堵、出。

4.3.1 “进”（1）选育耐高渗透压的菌株1）耐高糖选在20-30%葡萄糖的平板上生长好的突变株2）耐高谷氨酸选育在15-20%谷氨酸的平板上生长好的突变株3）耐高糖、高谷氨酸选育在20%葡萄糖加15%谷氨酸的平板上生长好的突变株。

4.3.2“通”⏹选育解除α-酮戊二酸到谷氨酸反馈调节的突变株1）选育抗谷氨酸结构类似物突变株，如抗谷氨酸氧肟酸等2）选育抗谷氨酰胺的突变株⏹选育强化CO2固定反应的突变株强化二氧化碳固定反应能提高菌种的产酸率1）选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源的培养基上生长快、大的菌株2）选育氟丙酮酸敏感性突变株⏹选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到α-酮戊二酸代谢的突变株1）选育抗氟乙酸、氟化钠、氟柠檬酸等突变株2）选育强化能量代谢的突变株抗呼吸链抑制剂突变株，如抗丙二酸的突变株抗氧化磷酸化解偶联剂突变株，如抗2，4-二硝基苯酚的突变株。

重要性
发酵在食品、饮料、药品和生物能源等领域具有重要的应用价值。
柠檬酸发酵的概述
柠檬酸
柠檬酸是一种有机酸，广通过微生物参与的发酵过程产生，这个过程复杂 而多样。
柠檬酸发酵的微生物参与者
1 Aspergillus niger
这个真菌物种可以产生大量的柠檬酸，并被广泛用于柠檬酸生产。
2 Yarrowia lipolytica
这个酵母菌也具有较高的柠檬酸产量，适用于工业规模生产。
柠檬酸发酵的反应过程
1
底物准备
选择适合的有机物作为柠檬酸发酵的底物。
2
发酵培养
将底物与适宜的微生物共同培养，提供适宜的温度和氧气条件。
3
柠檬酸生成
底物被微生物分解，生成柠檬酸和其他副产物。
柠檬酸发酵的影响因素
温度
适宜的温度可以促进柠檬酸生成的速率和产量。
营养物质
提供足够的营养物质，如糖类、氮源和微量元素， 有助于增加柠檬酸产量。
pH 值
不同微生物对 pH 值的要求不同，酸碱度对柠檬酸 发酵具有影响。
氧气供应
有些菌株需要适量的氧气参与发酵过程，而有些则 能在无氧条件下进行发酵。
柠檬酸发酵的应用领域
食品生产
柠檬酸在食品加工中用作风味调剂 剂和酸味调节剂。
药品工业
柠檬酸被用作制药过程中的溶剂和 酸化剂。
清洁剂生产
柠檬酸被用于生产清洁剂，具有溶 解和去污的作用。
结论和总结
1 柠檬酸发酵在许多领域具有广泛的应用 2 微生物是柠檬酸发酵的关键参与者
柠檬酸发酵技术在食品、医药和清洁剂等行业有 着重要的地位。
不同的微生物物种对柠檬酸发酵具有不同的产量 和效率。
《柠檬酸发酵机制》PPT 课件

厌氧条件
微好氧条件
在微好氧条件下，微生物通过好氧糖 酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸，再 经过一系列生物化学反应生成柠檬酸 。
在厌氧条件下，微生物通过糖酵解途 径将葡萄糖转化为丙酮酸，再经过一 系列生物化学反应生成柠檬酸。
柠檬酸发酵的原理
01
糖酵解途径
在厌氧条件下，微生物通过糖酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸的过程。
医药行业
用于生产抗生素、解热镇痛药等。
其他领域
如环保、化妆品等。
柠檬酸发酵的发展趋势
高效发酵技术
环保生产
通过优化发酵工艺和提高菌种性能，提高 柠檬酸产率。
减少柠檬酸生产过程中的环境污染，实现 绿色生产。
生物工程技术的应用
市场需求变化
利用基因工程和代谢工程手段，改良菌种 性能，提高发酵效率。
随着人们对健康和环保意识的提高，对天 然、健康的食品添加剂需求增加，柠檬酸 作为天然食品添加剂的市场前景广阔。
实验操作步骤与注意事项
菌种接种与培养
按照规定的操作步骤，将菌种接种到培 养基中，控制好温度、湿度、pH等培 养条件。
取样与检测
在发酵过程中按规定时间间隔取样， 检测柠檬酸含量等指标，记录数据。
发酵罐操作
启动发酵罐，控制好罐内压力、温度 、溶氧等参数，确保发酵过程顺利进 行。
异常情况处理
如发现异常情况，如菌种退化、发酵 异常等，应及时采取措施处理，并记 录实验过程。
营养物质的消耗
随着菌体生长和产物生成，发 酵液中的营养物质如葡萄糖逐 渐被消耗。
代谢产物的积累
在适宜的条件下，柠檬酸等代 谢产物在发酵液中积累。
发酵过程控制的方法和策略
温度控制
保持适宜的发酵温度，有利于菌体生 长和产物生成。